Summary
Цель презентации является демонстрация высокой воспроизводимостью метод для создания матрицы связаны имплантатов стволовых клеток в дефектов хряща, которые могут быть визуализированы с МРТ. Стволовые клетки помечены FDA утвержденных Ferumoxides, смешанный с агарозы, внедренных в хряще дефектов и полученную с использованием сканера 7T MR.
Abstract
Области тканевой инженерии интегрирует принципы инженерии, клеточной биологии и медицины по отношению к регенерации специфических клеток и функциональной ткани. Матрица связанных стволовых клеток имплантаты (MASI) направлены к регенерации хряща дефекты, связанные с артритом или травматического травмы суставов. Взрослых мезенхимальных стволовых клеток (МСК), были способны дифференцироваться в клетки хондрогенного линии и показали многообещающие результаты в клеточной суставного хряща технологии ремонта. Аутологичных МСК может быть выделен из различных тканей, может быть расширен в клеточных культурах, не теряя их дифференциации потенциал, и продемонстрировали хондрогенного дифференциации в пробирке и в естественных условиях 1, 2.
В целях обеспечения местного удержания и жизнеспособности пересаженных МСК в дефектов хряща, строительные леса необходимы, который также поддерживает последующей дифференциации и пролиферации. Архитектура ткани формирование эшафот руководства и разрешений внеклеточного матрикса, производства стволовых клеток, расширяться. Предыдущие исследования показали, что 2% агарозном леса может поддержать развитие стабильных гиалиновых хрящей и не вызывать иммунный ответ 3.
Долгосрочное сохранение пересаженные стволовые клетки в MASI имеет решающее значение для регенерации хряща. Маркировка МСК с наночастицами оксида железа обеспечивает долгосрочный в естественных условиях слежения с неинвазивных методов визуализации МР 4.
Эта презентация будет демонстрировать методы маркировки МСК с наночастицами оксида железа, поколению клеточных агарозном конструкций и имплантации эти конструкции в хряще дефектов. Помечены конструкции могут быть отслежены неинвазивно с МР-изображений.
Protocol
1. Маркировка hMSCs с Endorem
- Клетки выращивают до 80% слияния по крайней мере за 18 часов до маркировки.
- За это время, маркировка СМИ получают путем добавления Endorem к образцу в дозе 100 мкг Fe / мл сыворотки среде.
- После клетки выращивают до слияния, питательных сред отсасывают и клетки промывают 1x с PBS или сыворотки среде.
- Далее, промывочный раствор отсасывают и ранее подготовленный СМИ маркировке добавляется. Затем клетки инкубировали при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 4 часов.
- После инкубации в 4 часа, маркировка СМИ отсасывают и клетки промывали PBS и трипсином, как обычно.
- После трипсином, клетки промывают 3 раза с PBS и центрифугировали при 400rcf течение 5 минут.
- После этой промывки, клетки ресуспендируют, считая, оцениваются на жизнеспособность, и используется по мере необходимости для экспериментов.
2. Подготовка агарозном
- После клетки были помечены пришло время приготовления раствора агарозы.
- На мелкого масштаба, 80 мг агарозы порошка взвешивают и добавляют в 2 мл PBS.
- Это решение затем слегка встряхивают и автоклавировать.
- Примерно через 40 мин, жидкий раствор агарозы может быть выведена из автоклава. Объем должен быть измерены и соответствующим образом скорректированы с разогретой PBS.
- Затем раствор охлаждают до 42 ° C
3. Создание MASI
- Когда раствор агарозы достигла нужной температуры, клетки подсчитываются и центрифугировали в течение последнего времени в трубку 1,5 мл Eppendorf.
- После центрифугирования супернатант удаляют, а клетки смешиваются с DMEM достичь концентрации 30 х 10 6 клеток / мл.
- Теперь клетки смешиваются с 42 ° С теплыми агарозы.
- Холодный наконечник пипетки может вызвать агарозном закрепить в наконечнике, поэтому он рекомендуется для подогрева наконечник с помощью пипетки горячей стерильной PBS вверх и вниз
- Теперь же объем агарозы как средства массовой информации занимают и тщательно перемешивают с сотовым медиа-суспензии так, что однородная суспензия будет создан.
- Держите пробирку Эппендорфа в разогретой водяной бане, помешивая, чтобы агарозном не остыть достаточно, чтобы затвердеть.
- Когда подвеска однородной, клетки имплантируются в дефект.
Рисунок 1. Корональные Т2 взвешенных изображениях SE (TR 4000 мс / TE 18,27 мс) коленной чашечки образца с имплантированными hMSCs в хрящах дефектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные протокол обеспечивает воспроизводимые способ этикетке МСК с наночастицами оксида железа и внедрить эти меченых МСК на дефекты хряща. Эта техника позволяет неинвазивным изображением трансплантации стволовых клеток в дефектов хряща с МРТ, которая позволяет раннего выявления MASI недостаточности. Дислокации или истечение меченых клеток может быть диагностирована на основе исчезновение метки из трансплантации сайта на МРТ. Ранняя диагностика этих событий желательно и не допускал бы пациента от ненужных альтернативных инвазивных диагностических процедур. Описанные неинвазивный метод диагностики MASI результаты могут помочь в успешном развитии клеточной терапии на основе по регенерации хряща при остеоартрите. Наш протокол в настоящее время применяется в доклинических в естественных условиях исследования, было бы в принципе клинически применимый и может служить неинвазивным результат мерой для оценки MASI терапии в клинической практике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института артрита и костно-мышечной заболевания кожи, NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
