Summary
Obiettivo della presentazione è quello di dimostrare un metodo altamente riproducibile per generare matrice associata impianti di cellule staminali a difetti della cartilagine, che può essere visualizzato con la RM. Le cellule staminali sono etichettati con FDA ha approvato Ferumoxides, mescolato con agarosio, impiantati in difetti della cartilagine e ripreso con uno scanner 7T MR.
Abstract
Il campo della ingegneria dei tessuti integra i principi della biologia cellulare ingegneria e medicina verso la rigenerazione di cellule specifiche e tessuti funzionali. Matrice associata impianti di cellule staminali (MASI) mirano a rigenerare i difetti della cartilagine a causa di lesioni alle articolazioni artritiche o traumatica. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno la capacità di differenziarsi in cellule della linea condrogenico e hanno mostrato risultati promettenti per cellulari basati su tecnologie di riparazione della cartilagine articolare. Autologo di cellule staminali mesenchimali possono essere isolate da una varietà di tessuti, può essere ampliato in colture cellulari, senza perdere il loro potenziale di differenziazione, e hanno dimostrato condrogenico differenziazione in vitro e in vivo 1, 2.
Al fine di garantire la conservazione locale e la vitalità delle cellule staminali mesenchimali trapiantate in difetti della cartilagine, un ponteggio è necessario, che supporta anche la differenziazione e la proliferazione successive. L'architettura del tessuto patibolo formazione di guide e permette la matrice extracellulare, prodotto dalle cellule staminali, ad espandersi. Indagini precedenti hanno mostrato che un 2% di agarosio impalcatura può sostenere lo sviluppo della cartilagine ialina stabile e non induce risposte immunitarie 3.
Conservazione a lungo termine delle cellule staminali trapiantate nel MASI è fondamentale per la rigenerazione della cartilagine. L'etichettatura di MSC con nanoparticelle di ossido di ferro permette di lungo termine il monitoraggio in vivo con non invasive tecniche di imaging RM 4.
Questa presentazione dimostrerà le tecniche per MSC etichettatura con nanoparticelle di ossido di ferro, la generazione di cellule-agarosio costrutti e l'impianto di questi costrutti nei difetti della cartilagine. I costrutti etichettati possono essere monitorati in modo non invasivo con MR-imaging.
Protocol
1. L'etichettatura di hMSCs con Endorem
- Le cellule sono coltivate a 80% confluenza di almeno 18 ore prima di etichettatura.
- Durante questo periodo, i media di etichettatura si prepara aggiungendo Endorem al campione ad una dose di 100 ug Fe / ml di siero-media liberi.
- Dopo che le cellule sono coltivate a confluenza, la cultura media è aspirato e le cellule vengono lavate con PBS 1x o senza siero dei media.
- Quindi, la soluzione di risciacquo viene aspirato e dei media etichettatura precedentemente preparato viene aggiunto. Le cellule vengono poi incubate a 37 ° C, 5% di CO 2 per 4 ore.
- Dopo 4 ore di incubazione, l'etichettatura dei media è aspirato e le cellule vengono sciacquati con PBS e trypsinized come al solito.
- Una volta trypsinized, le cellule vengono lavate 3 volte con PBS e centrifugati a 400rcf per 5 minuti.
- Dopo questa fase di lavaggio, le cellule sono risospese, contati, valutati per la viabilità, e utilizzato come necessario per la sperimentazione.
2. Preparazione agarosio
- Dopo che le cellule sono state etichettate è tempo di preparare la soluzione agarosio.
- Su una scala bene, 80 mg di polvere di agarosio sono pesati e aggiunti 2 ml di PBS.
- Questa soluzione è poi delicatamente scossa e sterilizzati in autoclave.
- Dopo circa 40 minuti, la soluzione di agarosio fluido può essere tolto dal autoclave. Il volume deve essere misurato e regolato di conseguenza, preriscaldato PBS.
- Allora la soluzione è raffreddata a 42 ° C
3. Creazione MASI
- Quando la soluzione di agarosio ha raggiunto la temperatura desiderata, le celle sono contati e centrifugati per l'ultima volta in un tubo Eppendorf 1,5 ml.
- Dopo la centrifugazione, il surnatante viene eliminato e le cellule sono mescolate con le DMEM di raggiungere una concentrazione di 30 x 10 6 cellule / ml.
- Ora, le cellule sono mescolate con i 42 ° C caldo agarosio.
- Un puntale freddo può causare agarosio a solidificare all'interno della punta, quindi si consiglia di preriscaldare la punta pipettando caldo PBS sterile su e giù
- Ora, lo stesso volume di agarosio come media è ripreso e miscelare con la cellula-media-sospensione in modo che una sospensione omogenea viene creato.
- Tenere il tubo Eppendorf all'interno di un bagno d'acqua preriscaldata mescolando in modo che l'agarosio non si raffredda abbastanza per solidificare.
- Quando la sospensione è omogenea, le cellule vengono impiantate nel difetto.
Figura 1. Coronale T2 pesate SE (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) di un campione rotula con hMSCs impiantati in difetti della cartilagine.
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Discussion
Il protocollo descritto fornisce un modo riproducibile per etichettare MSC con nanoparticelle di ossido di ferro e di impianto tali etichettati MSCs in difetti della cartilagine. Questa tecnica permette non invasiva rappresentazione dei trapianti di cellule staminali a difetti della cartilagine con la RM, che consente una diagnosi precoce di fallimento MASI. Una lussazione o efflusso delle cellule etichettate può essere diagnosticata sulla base di una scomparsa del marchio dal sito trapianto sulle immagini MR. Una diagnosi precoce di questi eventi è auspicabile e potrebbe evitare che il paziente inutili procedure invasive diagnostiche alternative. Il descritto metodo non invasivo per la diagnosi di esiti MASI potrebbe contribuire allo sviluppo di successo delle terapie cellulari a base per la rigenerazione della cartilagine nell'osteoartrosi. Il nostro protocollo è attualmente applicato in studi preclinici in vivo studi, sarebbe in linea di principio clinicamente applicabile e potrebbe servire come non invasiva misura di outcome per la valutazione delle terapie MASI nella pratica clinica.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio presso l'Istituto Nazionale di artrite e malattie della pelle muscolo-scheletrico, NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
