Summary
प्रस्तुति के लक्ष्य के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि उपास्थि दोष, जो एमआर इमेजिंग के साथ visualized किया जा सकता है में मैट्रिक्स जुड़े स्टेम सेल प्रत्यारोपण उत्पन्न प्रदर्शित है. स्टेम सेल एफडीए को मंजूरी दी Ferumoxides agarose के साथ मिश्रित है, उपास्थि दोष में प्रत्यारोपित और एक 7T एमआर स्कैनर के साथ imaged के साथ लेबल रहे हैं.
Abstract
ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में इंजीनियरिंग, सेल विशिष्ट कोशिकाओं और कार्यात्मक ऊतक के उत्थान की दिशा में जीव विज्ञान और चिकित्सा के सिद्धांतों को एकीकृत. मैट्रिक्स जुड़े स्टेम सेल प्रत्यारोपण (मासी) उपास्थि गठिया या अभिघातजन्य संयुक्त चोटों की वजह से दोष पुनर्जन्म उद्देश्य. वयस्क mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) chondrogenic वंश की कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता है और सेल आधारित जोड़ उपास्थि की मरम्मत प्रौद्योगिकियों के लिए आशाजनक परिणाम दिखाया. ऑटोलॉगस MSCs ऊतकों की एक किस्म से अलग किया जा सकता है, उनके भेदभाव की क्षमता खोने के बिना सेल संस्कृतियों में विस्तार किया जा सकता है, और इन विट्रो में और vivo में 1, 2 में chondrogenic भेदभाव का प्रदर्शन किया.
आदेश में स्थानीय और उपास्थि दोष में प्रतिरोपित MSCs की व्यवहार्यता प्रतिधारण प्रदान करने के लिए, एक पाड़ की जरूरत है, जो भी बाद में भेदभाव और प्रसार का समर्थन करता है. पाड़ गाइड ऊतक गठन की वास्तुकला और बाह्य मैट्रिक्स, स्टेम कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, विस्तार करने के लिए परमिट. पिछले जांच से पता चला है कि एक 2% agarose पाड़ स्थिर Hyaline उपास्थि के विकास का समर्थन है और करता है 3 प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया नहीं कर सकते .
Masi में प्रतिरोपित स्टेम कोशिकाओं की लंबी अवधि के प्रतिधारण उपास्थि उत्थान के लिए महत्वपूर्ण है. MSCs के लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ लेबल गैर इनवेसिव एमआर इमेजिंग 4 तकनीकों के साथ vivo ट्रैकिंग में लंबी अवधि के लिए अनुमति देता है.
इस प्रस्तुति लेबलिंग MSCs, लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ उपास्थि दोष में सेल agarose इन constructs की constructs और आरोपण की पीढ़ी के लिए तकनीक का प्रदर्शन करेंगे. लेबल constructs एमआर इमेजिंग के साथ गैर invasively लगाया जा सकता है.
Protocol
1. Endorem साथ hMSCs की लेबलिंग
- कक्ष लेबलिंग से पहले कम से कम 18 घंटे 80% संगम हो कर रहे हैं.
- इस समय के दौरान, लेबलिंग मीडिया नमूना 100 स्नातकीय / Fe मिलीलीटर सीरम मुक्त मीडिया की एक खुराक पर Endorem जोड़कर तैयार है.
- बाद कोशिकाओं संगम के लिए बड़े हो रहे हैं, संस्कृति, मीडिया से aspirated और कोशिकाओं पीबीएस या सीरम स्वतंत्र मीडिया के साथ 1x धो रहे हैं.
- अगले, कुल्ला समाधान से aspirated है और पहले से तैयार लेबलिंग मीडिया जोड़ा जाता है. कोशिकाओं तो 37 में incubated हैं डिग्री सेल्सियस, 5% 4 घंटे के लिए सीओ 2.
- 4 घंटे ऊष्मायन के बाद, लेबलिंग मीडिया से aspirated और कोशिकाओं पीबीएस के साथ rinsed हैं और सामान्य रूप से trypsinized.
- एक बार trypsinized, कोशिकाओं पीबीएस के साथ 3x धो रहे हैं और 5 मिनट के लिए 400rcf पर centrifuged.
- धोने के इस कदम के बाद, कोशिकाओं resuspended हैं, गिना, व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन, और प्रयोग किया जाता के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक है.
2. Agarose तैयारी
- बाद कोशिकाओं लेबल किया गया है यह समय है agarose समाधान तैयार करने के लिए.
- एक ठीक पैमाने पर agarose पाउडर के 80mg तौला और पीबीएस के 2ml करने के लिए जोड़ा.
- यह समाधान फिर धीरे से हिलाकर रख दिया है और autoclaved.
- लगभग 40 मिनट के बाद, द्रव agarose समाधान आटोक्लेव के बाहर ले जाया जा सकता है. मात्रा और मापा जाना चाहिए preheated पीबीएस के साथ तदनुसार समायोजित.
- तो समाधान नीचे 42 करने के लिए ठंडा है डिग्री सेल्सियस
3. Masi बनाना
- जब agarose समाधान वांछित तापमान तक पहुँच गया है, कोशिकाओं गिना रहे हैं और एक 1.5ml Eppendorf ट्यूब में पिछली बार के लिए centrifuged.
- Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्याग है और कोशिकाओं DMEM के साथ मिलाया जाता है 30 10 6 कोशिकाओं / एमएल एक्स के एक एकाग्रता तक पहुँचने.
- अब कोशिकाओं से 42 डिग्री सेल्सियस गर्म agarose के साथ मिश्रित कर रहे हैं.
- एक ठंडी विंदुक टिप agarose टिप अंदर जमना करने के लिए कारण हो सकता है, इसलिए यह गर्म बाँझ पीबीएस pipetting ऊपर और नीचे के द्वारा पहले से गरम टिप करने के लिए सलाह दी जाती है
- अब, agarose का एक ही मात्रा के रूप में मीडिया को लिया जाता है और सेल मीडिया निलंबन के साथ अच्छी तरह से मिश्रित इतना है कि एक समरूप निलंबन बनाया है.
- एक preheated पानी के स्नान के अंदर Eppendorf ट्यूब रखें जबकि ताकि मिश्रण agarose नीचे काफी शांत करने के लिए जमना नहीं करता है.
- जब निलंबन समरूप है, कोशिकाओं को दोष में प्रत्यारोपित कर रहे हैं.
चित्रा 1 कोरोनल T2 उपास्थि दोष में प्रत्यारोपित hMSCs के साथ वुटने की चक्की नमूना भारित छवियों एसई (टी.आर. 4000 / एमएस ते 18.27 एमएस) .
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Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के लिए लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ MSCs लेबल और उपास्थि दोष में इन लेबल MSCs प्रत्यारोपण तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक को एमआर इमेजिंग, जो Masi की विफलता के एक जल्दी पता लगाने की अनुमति देता है के साथ उपास्थि दोष में गैर इनवेसिव स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण का चित्रण परमिट. अव्यवस्था या लेबल की कोशिकाओं के तपका एमआर छवियों पर प्रत्यारोपण साइट से लेबल के लापता होने के आधार पर निदान किया जा सकता है. इन घटनाओं का एक प्रारंभिक निदान वांछनीय है और अनावश्यक वैकल्पिक आक्रामक नैदानिक प्रक्रियाओं से रोगी को रोका जा सके. वर्णित Masi परिणामों के निदान के लिए गैर इनवेसिव विधि पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस में उपास्थि उत्थान के लिए सेल आधारित चिकित्सा के सफल विकास में सहायता कर सकते हैं. हमारी प्रोटोकॉल वर्तमान में preclinical में vivo अध्ययन में लागू किया जाता है, सिद्धांत रूप में चिकित्सकीय लागू होगा और नैदानिक अभ्यास में Masi के उपचारों के मूल्यांकन के लिए गैर इनवेसिव परिणाम उपाय के रूप में सेवा कर सकता है.
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Acknowledgments
इस काम संधिशोथ और Musculoskeletal त्वचा रोग, RO1AR054458 एनआईएच के राष्ट्रीय संस्थान से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
