Summary
الهدف من العرض هو لاظهار طريقة استنساخه للغاية لتوليد مصفوفة الخلايا الجذعية يزرع في العيوب المرتبطة الغضروف ، والتي يمكن تصور مع التصوير بالرنين المغناطيسي. وصفت الخلايا الجذعية مع ادارة الاغذية والعقاقير التي وافق عليها Ferumoxides ، مختلطة مع agarose ، مزروع في عيوب الغضروف وتصويرها مع ماسح ضوئي 7T MR.
Abstract
مجال هندسة الأنسجة يدمج مبادئ علم الأحياء الهندسة الخلية ، والدواء نحو تجديد الخلايا والأنسجة وظيفية محددة. مصفوفة زرع الخلايا الجذعية المرتبطة به (مازي) تهدف إلى تجديد عيوب الغضروف بسبب الاصابة بالتهاب المفاصل المشتركة أو الصدمة. الكبار الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCS) لديها القدرة على التمايز إلى خلايا النسب مكون للغضروف وأظهرت نتائج واعدة لخلية تكنولوجيات إصلاح الغضروف المفصلي. ويمكن توسيع نطاق ذاتي يمكن عزل اللجان الدائمة من مجموعة متنوعة من الأنسجة ، في ثقافات الخلية دون أن تفقد قدرتها التمايز ، وبرهنت تمايز مكون للغضروف في المختبر والمجراة في 1 و 2.
من أجل توفير الاحتفاظ المحلية وصلاحية اللجان الدائمة زرع غضروف في العيوب ، لا بد من السقالة ، والذي يدعم أيضا تمايز اللاحقة والانتشار. بنية النسيج سقالة تشكيل دلائل وتصاريح المصفوفة خارج الخلية ، التي تنتجها الخلايا الجذعية ، للتوسع. وقد أظهرت التحقيقات السابقة بأن 2 ٪ agarose سقالة قد دعم تنمية مستقرة وغضروف زجاجي لا تحفز الاستجابات المناعية 3.
الاحتفاظ على المدى الطويل من الخلايا الجذعية المزروعة في مازي أمر حاسم بالنسبة لتجديد الغضاريف. وسم اللجان الدائمة مع جزيئات أكسيد الحديد يسمح على المدى الطويل في تتبع المجراة مع المنظمات غير الغازية تقنيات التصوير بالرنين المغناطيسي 4.
وهذا العرض شرح التقنيات لوضع العلامات اللجان الدائمة مع جزيئات أكسيد الحديد ، وتوليد خلايا agarose يبني وغرس هذه التركيبات في عيوب الغضروف. ويمكن تتبع يبني المسمى غير جراحية مع MR - التصوير.
Protocol
1. وسم hMSCs مع Endorem
- تزرع الخلايا لالتقاء 80 ٪ على الأقل 18 ساعة قبل وضع العلامات.
- خلال هذا الوقت ، على استعداد وسائل الاعلام الوسم بإضافة Endorem إلى نموذج بجرعة 100 ميكروغرام الحديد / مل مصل خالية من وسائل الإعلام.
- بعد تزرع الخلايا لالتقاء ، ويستنشق وسائل الإعلام والثقافة ، ويتم غسل الخلايا 1X مع برنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام المصل الحرة.
- المقبل ، ويستنشق الحل شطف وإضافة وسائل الاعلام الوسم أعدت مسبقا. ثم يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 4 ساعات.
- بعد 4 ساعات الحضانة ، ووضع العلامات وسائل الاعلام هو يستنشق وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني وtrypsinized كالمعتاد.
- trypsinized مرة واحدة ، يتم غسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني وطرد في 400rcf لمدة 5 دقائق.
- بعد هذه الخطوة الغسيل ، ومعلق الخلايا ، وعدها ، المقررة للبقاء ، وتستخدم حسب الحاجة من أجل التجريب.
2. إعداد Agarose
- بعد أن تم تسمية الخلايا أن الوقت قد حان لإعداد حل agarose.
- على نطاق وغرامة ، ويتم وزن 80mg من مسحوق agarose وإضافتها إلى 2ml من برنامج تلفزيوني.
- ثم يتم هذا الحل اهتزت بلطف وتعقيمها.
- بعد حوالي 40 دقيقة ، ويمكن أن تؤخذ في حل agarose السوائل من الأوتوكلاف. وينبغي قياس حجم وتعديلها وفقا لبرنامج تلفزيوني مع مسخن.
- ثم يتم تبريد المحلول وصولا الى 42 درجة مئوية
3. خلق مازي
- عندما حل agarose قد وصل إلى درجة الحرارة المطلوبة ، يتم الاعتماد على الخلايا وطرد للمرة الأخيرة في أنبوب إيبندورف 1.5ml.
- بعد الطرد المركزي ، ويتم تجاهل طاف وتختلط مع خلايا DMEM من أجل التوصل إلى تركيز 30 × 10 6 خلية / مل.
- الآن تختلط الخلايا التي تحتوي على 42 درجة مئوية agarose الدافئة.
- وهناك معلومات ماصة الباردة قد يؤدي إلى ترسيخ agarose داخل الحافة ، ولذلك ينصح بأن يزج تسخين بواسطة pipetting الساخنة العقيمة PBS صعودا وهبوطا
- الآن ، نفس الحجم من agarose كما اتخذت وسائل الإعلام حتى وخلطها بشكل تام مع الخلية وسائل الإعلام ، بحيث يتم تعليق إنشاء تعليق متجانسة.
- الحفاظ على أنبوب إيبندورف داخل حمام ماء مسخن حين خلط بحيث agarose لا يبرد بما يكفي لترسيخ.
- عندما وقف ومتجانسة ، وزرع الخلايا في العيب.
الشكل 1. T2 المرجحة صور الاكليل SE (TR 4000 مللي / TE 18.27 مللي) من عينة الرضفة مع hMSCs مزروع في عيوب الغضروف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف بروتوكول يوفر وسيلة لتسمية اللجان الدائمة للتكرار مع جزيئات أكسيد الحديد وزرع هذه اللجان الدائمة في المسمى عيوب الغضروف. هذا الأسلوب يسمح غير الغازية تصوير زرع الخلايا الجذعية في عيوب الغضروف مع التصوير بالرنين المغناطيسي ، والذي يسمح للكشف المبكر عن الفشل مازي. ويمكن تشخيص الخلع أو هروب رأس المال من الخلايا المسمى على أساس اختفاء التسمية من موقع الزرع على صور الرنين المغناطيسي. والتشخيص المبكر لهذه الأحداث هو مرغوب فيه ، وسوف يمنع المريض من إجراءات الغازية لا لزوم لها بديل التشخيص. يمكن للوصف غير الغازية طريقة لتشخيص نتائج مازي مساعدة في التنمية الناجحة للعلاجات تستند لتجديد خلايا الغضروف في هشاشة العظام. البروتوكول المطبق حاليا لدينا في الدراسات قبل السريرية المجراة في و، سيكون من حيث المبدأ ينطبق سريريا ويمكن أن تكون بمثابة قياس النتيجة غير الغازية لتقييم علاجات مازي في الممارسة السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض الجلدية العظام والعضلات ، NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
