Summary
Doel van de presentatie is om aan te tonen een zeer reproduceerbare methode om matrix geassocieerd stamcelimplantaten genereren in kraakbeen defecten, die kunnen worden gevisualiseerd met MRI. Stamcellen zijn gelabeld met de FDA-goedgekeurde Ferumoxides, vermengd met agarose, geïmplanteerd in letsels aan het kraakbeen en afgebeeld met een 7T MR-scanner.
Abstract
Op het gebied van tissue engineering integreert de principes van de engineering, celbiologie en geneeskunde aan de regeneratie van specifieke cellen en functionele weefsel. Matrix geassocieerd stamcelimplantaten (MASI) hebben tot doel kraakbeen defecten als gevolg van artritis of traumatische letsel aan gewrichten te regenereren. Volwassen mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben de mogelijkheid om te differentiëren tot cellen van de chondrogenische afstamming en veelbelovende resultaten laten zien voor cel-gebaseerde kraakbeen te herstellen technologieën. Autologe MSC's kunnen worden geïsoleerd uit een verscheidenheid van weefsels, kan worden uitgebreid in celculturen zonder verlies van hun differentiatie potentieel, en hebben aangetoond chondrogene differentiatie in vitro en in vivo 1, 2.
Om lokale behoud en de levensvatbaarheid van de getransplanteerde MSC's in kraakbeendefecten bieden, is een steiger nodig, die ook de daaropvolgende differentiatie en proliferatie ondersteunt. De architectuur van de steiger gidsen weefsel vorming en laat de extracellulaire matrix, geproduceerd door de stamcellen, uit te breiden. Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat een 2% agarose steiger kan de ontwikkeling van stabiele hyalien kraakbeen te ondersteunen en veroorzaakt geen immuunreacties 3.
Op lange termijn behoud van getransplanteerde stamcellen in MASI is cruciaal voor het herstel van kraakbeen. Etikettering van MSC's met ijzeroxide nanodeeltjes maakt voor de lange termijn in vivo tracking met niet-invasieve MRI technieken 4.
Deze presentatie zal aantonen technieken voor het labelen van MSC's met ijzeroxide nanodeeltjes, de generatie van cel-agarose constructen en de implantatie van deze constructen in de gebreken van het kraakbeen. De gelabelde constructen kunnen non-invasief worden gevolgd met MR-Imaging.
Protocol
1. Etikettering van hMSCs met Endorem
- Cellen zijn gegroeid tot 80% confluentie ten minste 18 uur voor etikettering.
- Gedurende deze tijd, is het labelen van media bereid door toevoeging van Endorem om het monster op een dosis van 100 ug Fe / ml serum-vrije media.
- Na de cellen worden gekweekt tot confluentie, is cultuur media opgezogen en cellen worden gewassen 1x met PBS of serum-vrije media.
- Vervolgens wordt de spoeling oplossing opgezogen en de vooraf bereide etikettering media is toegevoegd. De cellen worden vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 4 uur.
- Na 4 uur incubatie, is het labelen van media opgezogen en cellen worden gespoeld met PBS en getrypsiniseerd zoals gewoonlijk.
- Eenmaal getrypsiniseerd, worden de cellen gewassen met PBS 3x en gecentrifugeerd bij 400rcf gedurende 5 minuten.
- Na deze wasstap, worden de cellen geresuspendeerd, geteld, beoordeeld op levensvatbaarheid, en worden gebruikt als nodig is voor experimenten.
2. Voorbereiden Agarose
- Nadat de cellen zijn gelabeld is het tijd om de voorbereiding van de agarose-oplossing.
- Op een mooie schaal, zijn 80 mg agarose poeder afgewogen en toegevoegd aan 2 ml PBS.
- Deze oplossing wordt dan zachtjes geschud en geautoclaveerd.
- Na ongeveer 40 min, kan de vloeistof agarose oplossing worden genomen van de autoclaaf. Het volume moet worden gemeten en dienovereenkomstig te worden aangepast met voorverwarmde PBS.
- Dan is de oplossing afgekoeld tot 42 ° C
3. Het creëren van MASI
- Wanneer de agarose-oplossing heeft de gewenste temperatuur bereikt, worden de cellen geteld en gecentrifugeerd voor de laatste keer in een 1,5 ml Eppendorf buis.
- Na het centrifugeren, is het supernatant verwijderd en de cellen worden gemengd met de DMEM tot een concentratie van 30 x 10 6 cellen / ml te bereiken.
- Nu de cellen worden gemengd met de 42 ° C warm agarose.
- Een koude pipetpunt kan agarose te stollen in de tip, daarom is het aangeraden om Verwarm de tip door pipetteren hete steriele PBS op en neer
- Nu, hetzelfde volume van agarose als media wordt in beslag genomen en grondig gemengd met de cell-media-vering, zodat een homogene suspensie is gemaakt.
- Houd de eppendorfbuisje in een voorverwarmde waterbad tijdens het mengen, zodat de agarose niet afkoelen genoeg om te stollen.
- Dat de opschorting homogeen is, zijn de cellen geïmplanteerd in het defect.
Figuur 1. Coronale T2-gewogen SE beelden (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) van een patella exemplaar met geïmplanteerde hMSCs in kraakbeen defecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschreven protocol voorziet in een reproduceerbare manier om MSC label met ijzeroxide nanodeeltjes en implantaat deze gelabelde MSC's in het kraakbeen defecten. Deze techniek maakt niet-invasieve weergave van stamceltransplantaties in letsels aan het kraakbeen met MR beeldvorming, die een vroegtijdige detectie van MASI mislukking toestaat. Een dislocatie of efflux van de gelabelde cellen kan worden gediagnosticeerd op basis van een verdwijning van het label van de transplantatie site op MR-beelden. Een vroege diagnose van deze gebeurtenissen is wenselijk en zou voorkomen dat de patiënt tegen onnodige andere invasieve diagnostische procedures. De beschreven non-invasieve methode voor de diagnose MASI resultaten kunnen helpen bij de succesvolle ontwikkeling van cell-based therapieën voor herstel van kraakbeen in artrose. Ons protocol is op dit moment toegepast in preklinische in-vivo studies, zou in principe klinisch toepasbaar en kan als niet-invasieve uitkomstmaat dienen voor de beoordeling van de MASI therapieën in de klinische praktijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Nationaal Instituut van artritis en spier Skin Diseases, NIH RO1AR054458.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
