Summary
Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.
Abstract
Das Gebiet des Tissue Engineering integriert die Prinzipien der Ingenieur-, Zell-Biologie und der Medizin auf die Regeneration von bestimmten Zellen und funktionelle Gewebe. Matrix verbunden Stammzellen Implantate (MASI) sollen Knorpeldefekte durch arthritischen oder traumatische Gelenkverletzungen zu regenerieren. Adulten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) haben die Fähigkeit, in Zellen des chondrogene Linie zu unterscheiden und haben vielversprechende Ergebnisse für zellbasierte Gelenkknorpel Reparatur-Technologien. Autologe MSCs können aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden, können in Zellkulturen, ohne ihre Differenzierungspotenzial erweitert werden, und haben gezeigt, chondrogene Differenzierung in vitro und in vivo 1, 2.
Um lokale Speicherung und Lebensfähigkeit der transplantierten MSCs in Knorpeldefekte bieten, ist ein Gerüst benötigt, das auch spätere Differenzierung und Proliferation. Die Architektur des Gerüsts führt Gewebebildung und ermöglicht die extrazelluläre Matrix, die von den Stammzellen produzierte, zu erweitern. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass ein 2% iges Gerüst kann die Entwicklung von stabilen hyalinen Knorpel zu unterstützen und nicht induziert Immunreaktionen drei.
Langfristige Aufbewahrung von transplantierten Stammzellen in MASI ist entscheidend für die Knorpelregeneration. Kennzeichnung von MSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel können für langfristige In-vivo-Tracking mit nicht-invasiven MR Bildgebung 4.
Diese Präsentation wird zeigen, Techniken zur Kennzeichnung MSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel, die Erzeugung von Zell-Agarose-Konstrukte und die Implantation dieser Konstrukte in Knorpeldefekte. Die markierten Konstrukte können nicht-invasiv mit MR-Imaging verfolgt werden.
Protocol
1. Kennzeichnung von hMSCs mit Endorem
- Die Zellen sind zu 80% Konfluenz mindestens 18 Stunden vor der Etikettierung gewachsen.
- Während dieser Zeit ist die Kennzeichnung Medien, indem Endorem, um die Probe in einer Dosis von 100 ug Fe / ml Serum-freien Medien vorbereitet.
- Nachdem sich die Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet werden, ist Kulturmedien abgesaugt und die Zellen werden mit PBS gewaschen oder Serum-freien Medien 1x.
- Als nächstes wird die Spüllösung abgesaugt und die vorbereitete Beschriftung Medien aufgenommen. Die Zellen werden dann bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Stunden.
- Nach 4 Stunden Inkubation wird die Kennzeichnung Medien abgesaugt und die Zellen werden mit PBS gespült und mit Trypsin behandelt wie gewohnt.
- Sobald trypsiniert werden die Zellen mit PBS gewaschen 3x und zentrifugiert bei 400rcf für 5 Minuten.
- Nach diesem Waschschritt werden die Zellen resuspendiert, gezählt, geprüft für die Lebensfähigkeit, und als für Experimente benötigt.
2. Vorbereitung Agarose
- Nachdem die Zellen markiert wurden, ist es Zeit, um die Agarose-Lösung vorzubereiten.
- An einem schönen Skala werden 80 mg Agarose Pulver gewogen und in 2 ml PBS.
- Diese Lösung wird dann sanft geschüttelt und autoklaviert.
- Nach ca. 40 min, kann die Flüssigkeit Agarose-Lösung aus dem Autoklaven entnommen werden. Das Volumen sollte gemessen und dementsprechend mit vorgewärmter PBS eingestellt.
- Dann wird die Lösung auf 42 ° C abgekühlt
3. Erstellen MASI
- Wenn die Agarose-Lösung hat die gewünschte Temperatur erreicht ist, werden die Zellen gezählt und zentrifugiert zum letzten Mal in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und die Zellen werden mit dem DMEM gemischt, um eine Konzentration von 30 x 10 6 Zellen / ml erreichen.
- Nun werden die Zellen mit dem 42 ° C warme Agarose gemischt.
- Ein kalter Pipettenspitze kann Agarose auf in der Spitze zu verfestigen, daher ist es zur Vorwärmung der Spitze durch Pipettieren heißen sterile PBS nach oben und unten empfohlen
- Nun, das gleiche Volumen an Agarose als Medien aufnimmt und gründlich mit der Zelle-media-Suspension gemischt, so dass eine homogene Suspension entsteht.
- Halten Sie die Eppendorf-Röhrchen in einem vorgeheizten Wasserbad beim Mischen, so dass die Agarose nicht abkühlen genug, um zu erstarren.
- Wenn die Suspension homogen ist, sind die Zellen in den Defekt implantiert.
Abbildung 1. Koronare T2-gewichteten SE-Bildern (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) einer Patella Probe mit implantierten hMSCs in Knorpeldefekte.
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Discussion
Das beschriebene Protokoll bietet eine reproduzierbare Möglichkeit, MSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel-Label und Implantat dieser markierten MSCs in Knorpeldefekte. Diese Technik ermöglicht nicht-invasive Darstellung von Stammzell-Transplantationen in Knorpeldefekte mit der MR-Bildgebung, die eine frühzeitige Erkennung von MASI Fehler erlaubt. Eine Dislokation oder Efflux der markierten Zellen können basierend auf einem Verschwinden des Etiketts von der Transplantation vor Ort auf MR-Bildern diagnostiziert werden. Eine frühzeitige Diagnose dieser Veranstaltungen ist wünschenswert und würde den Patienten vor unnötigen alternative invasive diagnostische Verfahren zu verhindern. Die beschriebenen nicht-invasive Methode zur Diagnose von MASI Ergebnisse können in die erfolgreiche Entwicklung von Zell-basierte Therapien zur Knorpelregeneration bei Arthrose helfen. Unser Protokoll ist derzeit in der präklinischen in-vivo-Studien angewendet wird, wäre im Prinzip klinisch anwendbar und könnte als nicht-invasive Ergebnis Maß für die Beurteilung der MASI Therapien in der klinischen Praxis dienen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Arthritis and Muskel-Skelett-Skin Diseases, NIH RO1AR054458 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
