Implantation av Ferumoxides Märkta mänskliga mesenkymala stamceller i brosk fel

Summary

Målet med presentationen är att visa en mycket reproducerbar metod för att skapa matrisen tillhörande implantat stamceller i brosk defekter som kan visualiseras med MR. Stamceller är märkta med FDA-godkända Ferumoxides, blandat med agaros, implanteras i brosk fel och avbildade med en 7T MR skanner.

Abstract

Området tissue engineering integrerar principerna för verkstads-, cell biologi och medicin mot förnyelse av specifika celler och funktionell vävnad. Matrix tillhörande stamceller implantat (Masi) syftar till att regenerera brosk fel på grund av artros eller traumatisk ledskador. Vuxna mesenkymala stamceller (MSC) har förmågan att differentiera i celler av chondrogenic härstamning och har visat lovande resultat för cell-baserad reparera ledbrosket teknik. Autolog MSC kan isoleras från en mängd olika vävnader, kan byggas ut i cellodlingar utan att förlora sin differentiering potential och har visat chondrogenic differentiering in vitro och in vivo ^{1, 2.}

För att ge lokal lagring och livskraften hos transplanterade MSC i brosk fel, är en klätterställning behövs, som också stöder efterföljande differentiering och spridning. Arkitektur ställningen guider vävnadsbildning och tillåter den extracellulära matrisen, som produceras av stamceller, att expandera. Tidigare undersökningar har visat att en 2% agaros klätterställning kan stödja utvecklingen av stabila hyaline brosk och inte inducera immunsvar ^3.

Långsiktig lagring av transplanterade stamceller i Masi är avgörande för brosk förnyelse. Märkning av MSC med nanopartiklar av järnoxid möjliggör långsiktiga in vivo-spårning med icke-invasiva MR tekniker ^4.

Denna presentation kommer att demonstrera tekniker för märkning MSC med nanopartiklar av järnoxid, generering av cell-agaros konstruerar och implantation av dessa konstruktioner till brosk defekter. Det märkta konstruktioner kan spåras icke-invasivt med MR-Imaging.

Protocol

1. Märkning av hMSCs med Endorem

1. Celler odlas till 80% sammanflödet minst 18 timmar innan märkning.
2. Under denna tid, är märkning media förberett genom att lägga Endorem till provet i en dos på 100 ug Fe / ml serum-fria medier.
3. Efter celler odlas till sammanflödet är kultur media aspireras och celler tvättas 1x med PBS eller serum-fria medier.
4. Därefter är den skölj lösningen aspirerade och den tidigare beredda märkning media läggs till. Cellerna är sedan inkuberas vid 37 ° C, 5% CO ₂ i 4 timmar.
5. Efter 4 timmars inkubation är märkning media aspireras och celler sköljs med PBS och trypsinized som vanligt.
6. När trypsinized, celler tvättas 3x med PBS och centrifugeras vid 400rcf i 5 minuter.
7. Efter detta tvättsteg, celler återsuspenderade, räknad bedömas vara lönsamma, och användas som behövs för experiment.

2. Förbereda Agarose

1. När cellerna har märkts att det är dags att förbereda agaroslösningen.
2. På en fin skala, är 80 mg av agaros pulver vägs och läggs till 2 ml PBS.
3. Denna lösning är sedan försiktigt skakad och autoklaveras.
4. Efter ca 40 min, kan vätskan agaroslösningen tas ut ur autoklaven. Volymen skall mätas och justeras i enlighet med förvärmd PBS.
5. Då är lösningen kyls ner till 42 ° C

3. Skapa MASI

1. När agaroslösningen har nått önskad temperatur, är de celler som räknas och centrifugeras för sista gången i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
2. Efter centrifugering är supernatanten bort och cellerna blandas med DMEM att nå en koncentration på 30 x 10 ⁶ celler / ml.
3. Nu cellerna blandas med 42 ° C varmt agaros.
4. En kall pipettspetsen kan orsaka agaros stelna inne i spetsen, därför är det rekommenderas att förvärma spetsen genom att pipettera heta sterila PBS upp och ner
5. Nu, samma mängd agaros som media tas upp och blandas noggrant med cellen-media-fjädring, så att en homogen suspension skapas.
6. Håll Eppendorf-rör inuti en förvärmd vattenbad under omrörning så att agarosen inte svalna tillräckligt för att stelna.
7. När suspensionen är homogen, är de celler som implanteras i defekten.

Figur 1. Coronal T2 viktade SE bilder (TR 4000 ms / TE 18,27 ms) en patella exemplar med implanterade hMSCs i brosk defekter.

Discussion

Den beskrivna protokollet ger ett reproducerbart sätt att märka MSC med nanopartiklar av järnoxid och implantat dessa märkta MSC till brosk defekter. Denna teknik möjliggör icke-invasiv skildring av stamcellstransplantation i brosk fel med MR, som möjliggör en tidig upptäckt av MASI misslyckande. En störning eller utflöde av den märkta celler kan diagnostiseras baseras på en försvinnande etiketten från transplantation plats på MR bilder. En tidig diagnos av dessa händelser är önskvärd och skulle hindra patienten från onödiga alternativa invasiva diagnostiska metoder. Den beskrivna icke-invasiv metod för att diagnostisera MASI utfall skulle kunna stöd i den framgångsrika utvecklingen av cellbaserade terapier för brosk förnyelse vid artros. Vår protokoll som för närvarande tillämpas i prekliniska in vivo-studier skulle i princip kliniskt tillämplig och kan fungera som icke-invasiv utfallet åtgärd för bedömning av MASI terapier i klinisk praxis.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (Ca++, Mg++ free)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Penicillin/Streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxides (Endorem)		Guerbet
Agarose Typ VII		Sigma-Aldrich	A9045	Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4%