Summary
프레 젠 테이션의 목표는 MR 영상과 시각 수있는 연골의 결함에 매트릭스 관련 줄기 세포 이식을 생성하는 높은 재현성 방법을 입증하는 것입니다. 줄기 세포는 아가로 오스와 혼합 FDA 승인 Ferumoxides, 연골의 결함에 심어 및 7T MR 스캐너와 함께 몇 군데으로 표시됩니다.
Abstract
조직 공학 분야는 특정 세포 기능 조직의 재생을 향해 공학, 세포 생물학 및 의학의 원리를 통합합니다. 매트릭스 관련 줄기 세포 이식 (마시는) arthritic 또는 외상성 관절 부상으로 인해 연골의 결함을 재생하는 것을 목표로하고 있습니다. 성인 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)는 chondrogenic 혈통의 세포로 차별화할 수있는 능력을 가지고 셀 기반의 관절 연골 수리 기술에 대한 유망한 결과를 보여주었다. Autologous MSCS는, 조직의 다양한 격리 수들은 차별의 잠재력을 그대로 유지한 채 셀 문화에 확장 될 수 있으며, 체외에서 생체내 1, 2 chondrogenic 차별을 증명하고있다.
연골의 결함 지역 유지 및 이식 MSCS의 생존을 제공하기 위해 발판도 후속 차별과 확산을 지원하는, 필요합니다. 발판 가이드 조직 형성의 아키텍처 및 줄기 세포에 의해 생산되는 세포외 매트릭스가, 확장 수 있습니다. 이전 조사는 2 % 아가로 오스 비계가 안정 유리 모양의 연골의 개발을 지원할 수 및 면역 반응에게 3 유발하지 않는 것으로 나타났습니다.
마시에 이식 줄기 세포의 장기 보관은 연골의 재생을 위해 중요합니다. 철 산화물 nanoparticles와 MSCS의 라벨링하는 비침습 MR 영상 기법 4 생체내 추적의 장기를 허용합니다.
이 프레 젠 테이션은 철 산화물 nanoparticles와 라벨 MSCS, 연골의 결함으로 이러한 구조의 셀 - 아가로 오스의 구성 및 이식의 생성에 대한 기술을 설명합니다. 분류 구조는 MR - 이미징과 비 invasively 추적할 수 있습니다.
Protocol
1. Endorem과 hMSCs의 라벨링
- 전지는 적어도 18시간 라벨 전에 80 %를 합류로 성장하고 있습니다.
- 이 기간 동안, 라벨 미디어는 100 UG 철 / ML 혈청이없는 미디어의 복용량에있는 예제 Endorem을 추가하여 준비가되어 있습니다.
- 세포가 합류로 성장 후, 문화, 미디어 aspirated되고 세포는 PBS 또는 혈청 무료 매체와 1X 세탁 있습니다.
- 다음, 린스 솔루션 aspirated되고 이전에 준비 라벨 미디어가 추가됩니다. 세포는 다음 37 incubated 아르 ° C, 5 % 4 시간 CO 2.
- 사시간 보육 후, 미디어를 분류하는 것은 aspirated되고 세포는 PBS로 씻어서하고 평소와 같이 trypsinized.
- 일단 trypsinized, 세포는 PBS로 3 배 세탁과 5 분 400rcf에 centrifuged 있습니다.
- 이 세척 단계 후, 전지, resuspended 집계, 생존을위한 평가 및 실험에 필요한으로 사용됩니다.
2. 아가로 오스 준비
- 세포로 분류되었습니다 후에 그것은 아가로 오스 솔루션을 준비하는 시간이다.
- 벌금 규모, 아가로 오스 분말 80mg 아무리하고 PBS의 2ml에 추가됩니다.
- 이 솔루션은 다음 부드럽게 떨면서 autoclaved입니다.
- 약 40 분 후, 유체 아가로 오스 솔루션은 압력솥에서 촬영하실 수 있습니다. 볼륨은 측정 preheated PBS와 함께 적절하게 조정해야합니다.
- 그런 다음 솔루션은 42 다운 냉각 ° C
3. 마시 만들기
- 아가로 오스 솔루션 원하는 온도에 도달하면 세포는 계산 및 1.5ml Eppendorf 튜브에 마지막 centrifuged 있습니다.
- 원심 분리 후, 뜨는가 폐기되고 세포는 30 X 10 6 세포 / ML의 농도에 도달하는 DMEM과 혼합됩니다.
- 이제 세포는 42 ° C 따뜻한 아가로 오스와 혼합됩니다.
- 감기 피펫 팁은 아가로 오스는 팁 내부 응고를 일으킬 수 있으므로 그것은 뜨거운 멸균 PBS를 pipetting 아래로 앞서 열을 가하다 끝에으로 좋습니다
- 자, 동질적인 현탁액이 생성되도록 미디어가 최대 촬영과 휴대 미디어 정직과 철저하게 혼합으로 아가로 오스의 같은 볼륨.
- 아가로 오스는 응고 정도로 진정되지 않도록 믹싱 동안 preheated 물 목욕 내부 Eppendorf 튜브 보관하십시오.
- 정지가 동질적인 경우, 세포가 결함에 이식하고 있습니다.
그림 1. 연골의 결함에 이식 hMSCs과 슬개골 시편의 코로나 T2 가중 SE 이미지 (TR 4000 MS / MS TE 18.27).
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Discussion
설명 프로토콜은 철 산화물 nanoparticles와 MSCS를 라벨 및 연골의 결함으로 이러한 레이블 MSCS를 이식하는 재현할 방법을 제공합니다. 이 기술은 마시 장애의 조기 발견을 허용 MR 영상과 연골의 결함에 줄기 세포 이식의 비침습 묘사를 허용합니다. 라벨 세포의 전위 또는 유출은 MR 영상에서 이식 사이트에서 라벨의 실종에 따라 진단할 수 있습니다. 이러한 이벤트의 초기 진단 바람직하고 불필요한 대체 침입 진단 절차에서 환자를 방지합니다. 마시 결과를 진단에 대한 설명 비침습 방법은 관절염의 연골 재생을위한 셀 기반 요법의 성공적인 개발에 도움을 수 있습니다. 우리 프로토콜은 현재 잠복기에 - 생체내 연구에 적용, 원칙적으로 임상 적용됩니다 및 임상 연습에 마시 요법의 평가에 대한 비침습 성과 측정 역할을 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 관절염의 국립 연구소 Musculoskeletal 피부병, NIH RO1AR054458에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
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- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
