Summary
演示的目的是展示一个高度重复性的方法来生成矩阵相关联的干细胞植入软骨缺损，可与磁共振成像的可视化。干细胞标记与美国FDA批准的Ferumoxides用琼脂糖混合，植入软骨缺损，并与7T磁共振扫描仪成像。
Abstract
组织工程领域的集成工程，细胞生物学和医学对特定的细胞和组织功能再生的原则。矩阵相关的干细胞植入（MASI）的目标是再生软骨缺损，因关节炎或外伤关节损伤。成人间质干细胞（MSCs）分化为软骨细胞谱系细胞的能力，并已显示出可喜的成果细胞为基础的关节软骨修复技术。自体干细胞可以从各种组织中分离，在细胞培养，可以扩大，而不会失去它们的分化潜能，并表现出软骨细胞分化，在 体外和体内的1，2。
为了提供地方留成和软骨缺损移植干细胞的可行性，脚手架是必要的，这也支持了随后的分化和增殖。脚手架指导组织形成的架构，允许细胞外基质，由干细胞产生，扩大。以前的调查表明，2％琼脂糖支架可以支持稳定的透明软骨的发展并不会诱发免疫反应的3。
MASI移植的干细胞的长期保存是软骨再生的关键。氧化铁纳米粒子标记的MSCs可在体内长期跟踪与非侵入性磁共振成像技术4。
本演示将展示标签MSCs的氧化铁纳米粒子，成软骨缺损的细胞琼脂糖结构和这些结构的植入代技术。标记的结构可以跟踪非侵入性磁共振成像。
Protocol
1。与Endorem标记的hMSCs
- 细胞增长到80％汇合至少18小时前标签。
- 在这段时间内，标签媒体准备加入Endorem剂量100微克铁/ ml的无血清培养基样品。
- 培养基细胞生长至汇合后，吸气和细胞用PBS或无血清培养基洗1倍。
- 接下来，冲洗液被吸入，加入先前准备的标签媒体。细胞，然后在37℃孵育℃，5％CO 2 4小时。
- 经过4个小时的潜伏期，标签媒体是吸气和细胞，用PBS漂洗和往常一样胰酶消化。
- 胰酶消化后，细胞被冲3倍，用PBS 400rcf离心5分钟。
- 这种洗涤步骤后，重新悬浮细胞，计数，可行性评估，并用实验需要。
2。准备琼脂糖
- 后的细胞都被贴上了，现在是时候准备琼脂糖溶液。
- 罚款的规模，琼脂糖粉80毫克称重，并添加到PBS2毫升。
- 该解决方案，然后轻轻地动摇和高压灭菌。
- 约40分钟后，可以取出液的琼脂糖溶液，高压灭菌器。测量体积应与预热PBS相应调整。
- 然后溶液冷却至42 ° C
3。创建MASI
- 当琼脂糖溶液已达到所需的温度，细胞计数，并为最后一次在1.5毫升Eppendorf管离心。
- 离心后，取上清液丢弃，细胞的DMEM混合浓度达到30 × 10 6细胞/ ml。
- 现在，42℃的温暖琼脂糖混合细胞。
- 一个寒冷的枪头，可能导致琼脂糖，以巩固内部的提示，因此它应预热尖吹打热无菌PBS向上和向下
- 现在，媒体和混合介质与细胞悬浮彻底，以便创建一个同质的悬挂是相同体积的琼脂糖。
- 保持室内预热水浴Eppendorf管中，边搅拌，使琼脂糖不冷静下来，足以巩固。
- 当悬浮液是均匀的，被植入的细胞中的缺陷。
图1。冠状T2加权SE图像与髌骨标本植入软骨缺损的hMSCs（TR 4000毫秒/ TE 18.27 MS）。
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Discussion
所描述的协议提供了一个可重复的氧化铁纳米粒子标记的干细胞，这些标记的MSCs植入软骨缺损的方法。这种技术允许与磁共振成像，这使得MASI故障的早期检测软骨缺损的非侵入性干细胞移植的写照。一个错位或标记的细胞外排，可以诊断的基础上从MR图像的移植部位的标签消失。对这些事件的早期诊断是可取的，将防止不必要的替代侵入性诊断程序的病人。所述的非侵入性诊断MASI成果方法，可以在骨关节炎软骨再生的细胞治疗的成功发展援助。我们的协议是目前在临床前的体内研究的应用，将在原则上临床应用，可作为非侵入性测量结果MASI疗法在临床实践中的评估服务。
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Acknowledgments
这项工作是从国立关节炎和肌肉骨骼皮肤疾病，美国国立卫生研究院RO1AR054458赠款的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
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- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
