Summary
Sunumun Amaç, kıkırdak defektleri, MR görüntüleme ile görüntülendi olabilir matris ilişkili kök hücre implantları üretmek için son derece tekrarlanabilir bir yöntem göstermektir. Kök hücreler, agaroz ile karışık FDA onaylı Ferumoxides, kıkırdak hasarlarının içine implante edilerek 7T MR tarayıcı ile görüntülü olarak etiketlenir.
Abstract
Doku mühendisliği alanında özel hücreler ve fonksiyonel doku rejenerasyonu doğru mühendislik, hücre biyolojisi ve tıp ilkelerini bütünleştiren. Matrix ilişkili kök hücre implantlar (Masi) artritik veya travmatik eklem yaralanmaları nedeniyle kıkırdak defektleri yeniden hedefliyoruz. Yetişkin mezenkimal kök hücreler (MKH) chondrogenic soy hücrelerin içine ayırt etme yeteneğine sahip ve hücre tabanlı eklem kıkırdağının onarım teknolojileri için umut verici sonuçlar göstermiştir. Otolog MKH, dokuların çeşitli izole edilebilir farklılaşma potansiyelini kaybetmeden hücre kültürlerinde genişletilebilir, ve in vitro ve in vivo 1, 2 chondrogenic farklılaşma göstermiştir.
Kıkırdak hasarlarının yerel tutma ve nakledilen MKH canlılığı sağlamak amacıyla, bir iskele de sonraki farklılaşması ve proliferasyonu destekler ihtiyaç vardır. Iskele kılavuzları doku oluşumu mimarisi ve kök hücreleri tarafından üretilen ekstraselüler matriks, genişletmek için izin verir. Önceki soruşturma% 2 agaroz iskele istikrarlı hyalin kıkırdak gelişimini desteklemek ve bağışıklık yanıtlarını 3 neden olmadığını göstermiştir.
Uzun vadeli tutma Masi nakledilen kök hücrelerin kıkırdak rejenerasyonu için kritik öneme sahiptir. Demir oksit nano ile MKH Etiketleme non-invaziv MR görüntüleme teknikleri 4 in vivo izleme uzun vadeli sağlar.
Bu sunum, demir oksit nano-etiketleme MKH, kıkırdak hasarlarının hücre agaroz yapıları ve bu yapıları implantasyonu nesil tekniklerini gösterecektir. Etiketli yapıları MR görüntüleme ile non-invaziv takip edilebilir.
Protocol
1. Endorem ile hMSCs Etiketleme
- Hücreler,% 80 izdiham etiketleme en az 18 saat önce büyüdü.
- Bu süre zarfında 100 ug Fe / ml serum ücretsiz medya bir doz örnek Endorem ekleyerek, etiketleme ortam hazırlanır.
- Hücreleri izdiham büyüdü sonra, kültür medya aspire edilir ve hücreler PBS veya serum ücretsiz medya ile 1x yıkanır.
- Daha sonra, durulama çözüm aspire edilir ve önceden hazırlanmış etiketleme medya eklenir. Bu hücreler daha sonra 37 inkübe ° C,% 5 CO 2 4 saat.
- 4 saat inkübasyondan sonra, medya etiketleme aspire edilir ve hücreler PBS ile durulanır ve her zamanki gibi tripsinize.
- Bir kez tripsinize, hücreler PBS ile 3x yıkanır ve 400rcf 5 dakika santrifüj edilir.
- Bu yıkama adımdan sonra, hücreler, yeniden süspanse sayılır, canlılığı açısından değerlendirildi ve deneyler için gerekli olarak kullanılır.
2. Agaroz hazırlanması
- Hücrelerin etiketli edildikten sonra agaroz çözeltisi hazırlamak için zamanı.
- Ince bir ölçekte, agaroz toz 80mg tartılır ve PBS 2ml eklendi.
- Bu çözüm daha sonra hafifçe sarsıldı ve otoklava.
- Yaklaşık 40 dakika sonra, sıvı agaroz çözüm otoklav alınacak. Hacmi önceden ısıtılmış PBS ile ölçülür ve buna göre ayarlanması gerekir.
- Sonra çözüm 42 kadar soğutulur ° C
3. Masi Oluşturma
- Agaroz çözümü istenilen sıcaklığa ulaştığında, hücreler sayılır ve son kez bir 1.5ml Eppendorf tüp santrifüj.
- Santrifüj sonra, süpernatant atılır ve hücreler 30 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ulaşmak için DMEM ile karıştırılır.
- Şimdi hücreler 42 ° C sıcak agaroz ile karıştırılır.
- Soğuk bir pipet agaroz ucu içinde katılaşmaya yol açabilir, bu nedenle sıcak steril PBS pipetleme yukarı ve aşağı ucu ön ısıtma için tavsiye edilir
- Şimdi, böylece homojen bir süspansiyon oluşturulan medya alınır ve hücre-medya-süspansiyon ile iyice karıştırılır olarak agaroz aynı hacimde.
- Agaroz sağlamlaştırmak için yeterli soğumaya kalmaması karıştırma Eppendorf tüp önceden ısıtılmış bir su banyosu içinde tutun.
- Süspansiyon homojen olduğunda, hücrelerin defekt implante edilirler.
Şekil 1 kıkırdak defektleri implante hMSCs ile patella örnek Koronal T2 ağırlıklı SE görüntüleri (TR 4000 ms / TE 18.27 ms).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokol demir oksit nano ile MKH etiket ve kıkırdak hasarlarının içine bu etiketli MKH implant tekrarlanabilir bir şekilde sağlar. Bu teknik, MR, Masi yetmezliği erken teşhis sağlayan kıkırdak hasarlarının kök hücre nakli non-invaziv bir tasviri izin verir. Etiketli hücreleri efflux çıkığı ya da MR görüntüleri nakli sitesinden etiket yok dayalı teşhis edilebilir. Bu olayların bir erken tanı ve arzu edilen bir durumdur ve hastanın gereksiz alternatif invaziv tanısal işlemler önleyecektir. Masi sonuçların teşhis için açıklanan non-invaziv yöntem, osteoartrit kıkırdak rejenerasyonu için hücre bazlı tedavilerin başarılı bir biçimde gelişmesinde yardımcı olabilir. Bizim protokolü henüz preklinik in vivo çalışmalarda uygulanan ilke olarak, klinik olarak geçerli olacak ve klinik pratikte Masi tedavilerin değerlendirilmesi için non-invaziv sonuç ölçütü olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Artrit Enstitüsü ve Kas-iskelet Deri Hastalıkları, NIH RO1AR054458 bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | ||
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25399-120 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | ||
| Ferumoxides (Endorem) | Guerbet | |||
| Agarose Typ VII | Sigma-Aldrich | A9045 | Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4% |
References
- Mauck, R. L., Yuan, X., Tuan, R. S. Chondrogenic differentiation and functional maturation of bovine mesenchymal stem cells in long-term agarose culture. Osteoarthritis Cartilage. 14, 179-189 (2006).
- Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Rahfoth, B. Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits. Osteoarthritis Cartilage. 6, 50-65 (1998).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with iron oxide nanoparticles for non-invasive in vivo tracking with MR imaging. J Vis Exp. , (2008).
