Summary
В этой статье показано, как правильно использовать BioRad Гелиос генной пушки ввести ДНК плазмиды в клетки эпидермиса лука и как тест на белок-белковых взаимодействий в клетках лука на основе принципа Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC)
Abstract
Исследование функции генов в различных организмах зависит от знания того, как генные продукты взаимодействуют друг с другом в их нормальной клеточной среды. Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной
Protocol
И. плазмиды подготовки
Плазмидной ДНК использовались для бомбардировки должны иметь высокую чистоту и при концентрации 500ng/μl или выше. Для BiFC с участием двух плазмид конструкций, 25 мкг каждого плазмиды не требуется. Другими словами, 1:1 молярное соотношение двух плазмид должны быть смешаны, чтобы дать начало 50 мкг общего плазмидной ДНК для подготовки картриджей. Будьте внимательны, что добавить больше ДНК, чем 50 мкг может привести к агломерации частиц золота и его следует избегать. Коммерчески доступные комплекты плазмиды выделения ДНК рекомендуются для изоляции плазмиды ДНК.
Плазмидных векторов должна быть относительно небольшой по размеру, таких как pUC19. Мы клонировали СоЭС и LUH кДНК в pUC19-SPYNE и pUC19-SPYCE, соответственно 3. Двоичные векторы для агробактериальной преобразования являются слишком большими и не подходит для бомбардировки.
II. Картридж подготовки
Картридж подготовка включает в себя покрытие золотом частиц с ДНК плазмиды и загрузки их в пластиковой трубки, которая затем разрезается на половину дюйма длинные куски, которые могут быть загружены в гене держателей патрон. Картридж подготовка описана в самой подробной в отдельной статье Юпитер 4 и, таким образом, здесь не описывается. Для бомбардировки лук клетки, мы рекомендуем смешивания 50 мкг плазмидной ДНК с 12,5 мг золота частиц на подготовку, которая дает около до 50 картриджей на 1 мкг DNA/0.25 мг золота / картриджа. Каждый картридж для одного выстрела. Частицы золота может быть либо 0,6 мкм или 1,0 мкм в диаметре (Cat # 1652262 или Cat # 1652263; Biorad). Мы также рекомендуем использовать 0,5 мг / мл ПВП решение для подготовки картриджа. Для BiFC, объединить две плазмидных ДНК каждого предполагаемого партнера взаимодействующих в той же подготовки картриджа.
После подготовки картриджа, важно, чтобы проверить картриджи, стреляя новоиспеченных картриджей при давлении гелия от 150 до 200 фунтов на квадратный дюйм в квадратных парафильмом, который обернут вокруг чашки Петри. Это будет тест, если частицы золота могут быть самоходные эффективно от патронов; вы должны увидеть слабые частицы золота на парафильмом. Это дает вам представление о том, что площадь каждого выстрела покроет. Вы можете заметить различные количества частиц золота на самоходные парафильмом гелия при различных давлениях (в 150-200 фунтов на квадратный дюйм диапазона). Если нет существенной разницы, выберите более низкое давление для бомбардировки.
III. Подготовка ткани лука
В день съемки, снимать наружную оболочку из большой желтый лук. Используя чистую и острые лезвия бритвы, вырезать 4-5 слоев глубокой прямоугольной площадью около 2 х 8 см. Выньте прямоугольной ткани лук, отбросить внешние два слоя, вырезать остальные слои лука, примерно в 2x1.5 см частей. Место лук штук в чашки Петри, содержащие фильтровальной бумаге (ватман 3MM бумагу нарезают кружочками) смоченной стерильной водой. Обложка чашке Петри, и они готовы пойти.
IV. Бомбардировка
- Нагрузка патроны в белых круглых держателей картриджа. Картриджи, содержащие различные плазмиды конструкции должны быть загружены на различные держатели картриджа. Каждый держатель картриджа может содержать до 12 патронов для 12 выстрелов.
- Вставьте аккумулятор и свежие лайнер баррель в Helios генной пушки. Убедитесь, что оба ствола лайнера и пушки имеют соответствующие уплотнительные кольца прилагаются.
- Во-первых, вставить пустой держатель картриджа в генной пушки, с пометкой # 12 на держателе картриджа направлен к верхней части пистолета. Держатель Advance картридж один или два раза, чтобы убедиться, что она установлена правильно.
- Прикрепить пистолет к гелия бак и отрегулировать давление от 150 до 200 фунтов на квадратный дюйм.
- Защита от износа уха и огнестрельного оружия несколько раз с пустого держателя картриджа, чтобы вычистить камеру пистолет и, чтобы убедиться, что давление стабильное.
- Удалить пустой держатель картриджа и вставьте загружены держатель картриджа. Advance держатель фильтра так, чтобы картридж вы хотите уволить позиционируется в нижнем (6 часов) в держатель фильтра. Съемки кусок лука здесь обеспечивает форме отрицательного контроля для фоновой флуоресценции.
- Место лук штук в середине пустой чашки Петри с внутренней самый слой лука вверх. Отдых баррель лайнер генной пушки на чашку Петри и огонь пистолет, удерживая кнопку стороне в то время как нажать на курок. Передача бомбардировке лук чашки Петри содержащие влажной фильтровальной бумаге 3 мм.
- Переход на следующий патрон и пожарной другой кусок лука. Повторите этот шаг 4:56 куски лук выстрел. Каждый кусок лука выстрелили.
- Изменения в другой держатель картриджа загружены баллончиков, содержащих различные плазмиды или разных плазмида комбинации. Не забудьте изменить баррель лайнера также для предотвращения загрязнения. Стреляйте 4:56 части лука.
- После бомбардировки, вернуть все лук perti блюд. Обложка чашки Петри с крышками. Оберните их с парафильмом для предотвращения высыхания. Инкубируйте лук частей при комнатной температуре в темноте в течение 16-48 часов.
- Выключите газ и сброса давления перед отсоединением генной пушки из гелия танк. Отвинтите баррель лайнера, и снимите держатель картриджа и использовать (или не используется) картриджей.
- Чистящий картридж владельцев и ствол лайнеров, погружая их в стакан с мыльной водой. Место стакан в ванну sonicator и разрушать ультразвуком в течение 20 минут. Затем промойте их водой, чтобы удалить все остатки мыла. Замочите их в 70% этаноле в течение часа, а затем высушить их на бумажные полотенца.
В. Наблюдение
- После инкубации бомбардировке части лука в течение 16-20 часов при комнатной температуре, мы можем наблюдать GFP или YFP флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа, такие как Zeiss Axio Observer.z1, используемые в данном исследовании.
- Используйте пинцет с плоскими концами, чтобы медленно кожуру одного слоя клеток от внутренней эпидермиса лука (слой, который выходит непосредственно на пистолет во время бомбардировки). Место корки на каплю воды на предметное стекло. Добавить покровное но будьте осторожны, чтобы минимизировать пузыри.
- В светлом поле микроскопа, первый чек на цитоплазматических потокового для того, чтобы клетки живы. Для этого необходимо выставить слайд к яркому свету поле в течение нескольких минут, чтобы разогреться лук ткани и затем посмотреть на движущиеся пластид. Цитоплазматическая потоковое не всегда легко понять, так что не расстраивайтесь, если вы не можете видеть.
- Для обнаружения флуоресценции, использовать соответствующие возбуждения и регистрации фильтров для GFP или YFP. Важно, чтобы включить отрицательные элементы управления, такие как лук частей, снятых без флуоресцентного плазмиды. Слабые желтые сигналы могут появляться из раненых клетки, пузырьки воздуха, или мусор. Важно также, чтобы включить положительного контроля. Плазмиды, содержащей конститутивно выразил флуоресцентные репортер, такие как 35S:: GFP является отличным положительного контроля. Видимые сигналы GFP из лука клеток эпидермиса (рис. 1А, D) указали, что патроны, лук тканей, и стрельба генной пушки должным образом подготовлены и казнен. Впоследствии мы наблюдали взаимодействие между SEU-pSPYNE и LUH-pSPYCE в луковом части засыпаны баллончиков, содержащих смесь 35S:: SEU-pSPYNE и 35S:: LUH-pSPYCE ДНК. Слабые флуоресценции YFP наблюдался в ядро только (рис. 1 В, Е), что указывает на прямое физическое взаимодействие между СоЭС и LUH, который принес раскол фрагменты YFP вместе в ядре. Обратите внимание, что сигнал от YFP BiFC значительно слабее, чем сигнал GFP из 35S:: GFP.
Представитель Результаты
В нашем исследовании сообщали здесь, 35S:: GFP положительного контроля плазмиды испускает сильное флуоресценции, которая заполняет всю клетку, в том числе оба ядра и цитоплазмы (рис. 1А, D). GFP белка достаточно мал, чтобы диффундировать в ядро без сигнал ядерной локализации. В противоположность этому, СоЭС и LUH два Arabidopsis транскрипционных факторов показано ранее, взаимодействуют в дрожжах двугибридная анализа 2. SEU-pSPYNE (СоЭС слит с N-концевой фрагмент YFP) и LUH-pSPYCE (СоЭС слит с N-концевой фрагмент YFP), и слишком велики, чтобы диффундировать в ядро, содержащих ядерные сигналы локализации 2,5. YFP флуоресцентный сигнал обнаружен в ядре лук ячейки (рис. 1 В, Е) показывает, что SEU-pSPYNE и LUH-pSPYCE могут взаимодействовать в луковом ядер. Нет флуоресцентный сигнал обнаружен в луке засыпаны плазмиды смесь вектора плазмиды pSPYNE содержащих N-концевой фрагмент YFP и LUH-pSPYCE (рис. 1C, F).
BiFC-опосредованной YFP флуоресценция значительно слабее, чем GFP-опосредованной флуоресценции от 35S:: GFP плазмиды. В нашем исследовании, они также показали различные субклеточные локализации (ср. рис 1A с B). Кроме того, количество флуоресцентных клеток значительно ниже для BiFC, как BiFC работает только, когда оба партнера плазмид успешно войти и выражаются в тех же клетках лука.
Рисунок 1. Флуоресцентный (А, В, С) и светлого поля (D, E, F) изображений лука клетки засыпаны различных плазмидных конструкций. (А) и (D), Лук клетки засыпаны 35S:: GFP. GFP диффундирует через из цитоплазмы и ядра. (B) и (Е), лук клетки засыпаны равных молярных смесей 35S:: SEU-pSPYNE (СоЭС слит с N-концевой фрагмент YFP) и 35S:: LUH-pSPYCE (LUH слит с С-концевой фрагмент ) плазмидной ДНК. Взаимодействие между SEU-pSPYNE и LUH-pSPYCE показывает флуоресцентные ядра. (C) и (F), отрицательный контроль показывает лук клетки засыпаны смесей вектор pUC19-SPYNE и LUH-pSPYCE plasmiDS. Нет флуоресцентного сигнала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- Для пользователей-новичков, мы рекомендуем практикующих всю процедуру, от картриджа подготовка к наблюдению, с одной плазмиды учредительных репортер, такие как 35S:: GFP или 35S:: GUS. Мы использовали 35S:: GFP плазмида получена из докторов. Стив горе и Чжан Сяонин 6 (рис. 1А, D). Ген выстрел контроль картриджи продаются по RioRad (Cat 165-2244) не подходят для растений.
- Для BiFC, второй положительный контроль является необходимым, который должен состоять из двух известных взаимодействующих партнеров, слитый с С-концевым и N-концевых фрагментов из YFP, соответственно.
- Для BiFC, необходимо включать в себя несколько отрицательных контролей: (1) белок X, слитый с N-концевой фрагмент YFP плюс векторного кодирования для С-концевой фрагмент, (2) У белок, слитый с С-концевой фрагмент YFP плюс векторного кодирования для N-концевого фрагмента, (3) только вектором.
- Диффузии экран может быть использован на базе Helios ствол пистолета генов при стрельбе выстрел, который служит для уменьшения повреждения тканей. В нашем исследовании мы не использовали диффузии экрана.
- Во время просмотра микроскопических YFP флуоресценции посредничестве BiFC, время экспозиции, чтобы возбуждающего света должно быть сведено к минимуму, чтобы уменьшить фотографию отбеливания.
- Картриджи, хранящихся в сцинтилляционных флаконах, содержащих осушители хорошо в течение нескольких месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. Стив горе и Чжан Сяонин для 35S:: GFP pGlowbug построить и Hokensen Докторантура стипендий для CH Исследования в лаборатории З. единиц поддерживается Национальным научным фондом США (IOB0616096 и MCB0744752). ZL частично поддержана Университета штата Мэриленд сельскохозяйственной опытной станции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
