Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג'ין
Summary
מאמר זה מדגים כיצד להשתמש נכון BioRad הליוס Gun ג'ין להציג פלסמיד דנ"א לתוך תאים אפידרמיס בצל ואיך לבדוק אינטראקציות בין חלבונים בתאים בצל מבוססת על העיקרון של השלמה Fluorescence bimolecular (BiFC)
Abstract
חקירת פונקציה הגן באורגניזמים שונים מסתמך על הידע של איך את המוצרים גן לתקשר אחד עם השני בסביבה הסלולר הרגיל שלהם. את הקרינה bimolecular השלמה (BiFC) Assay<sup> 1</sup> מאפשר לחוקרים לחזות חלבונים אינטראקציות בתאים חיים הפך לכלי מחקר חיוני. Assay זו מבוססת על הקשר בהנחייתם של שני שברים של חלבון פלואורסצנטי (GFP), כי הם התמזגו כל שותף פוטנציאלי אינטראקציה חלבון. האינטראקציה של שני השותפים חלבון יקל את הקשר של N-מסוף בטרמינל C-שבר של ה-GFP, המוביל פלואורסצנטי. עבור החוקרים צמח, התאים בצל אפידרמיס מהווים מערכת ניסיונית אידיאלי לביצוע assay BiFC בגלל הקלות בקבלת והכנת רקמות הבצל ואת להדמיה ישירה של הקרינה עם הקרינה רקע מינימלי. האקדח הליוס ג'ין (BioRad) משמש בדרך כלל מפציצים פלסמיד דנ"א לתאי הבצל. אנו מדגימים את השימוש הליוס Gun ג'ין להציג בונה פלסמיד לאינטראקציה two<em> ארבידופסיס thaliana</em> גורמי שעתוק, סוס (שאו) ו homolog LEUNIG (LUH)<sup> 2</sup> ואת להדמיה של האינטראקציות ביניהם בתיווך BiFC בתאי אפידרמיס בצל.
Protocol
Discussion
- עבור משתמשים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל את ההליך כולו, מתוך הכנה מחסנית אל תצפית, עם כתבת אחת מכוננת פלסמיד כגון 35S:: GFP או 35S:: גאס. השתמשנו 35S:: GFP פלסמיד המתקבל בני הזוג. סטיב הר Xiaoning אנג 6 (איור 1 א, ד). ירו גן לשלוט מחסניות נמכר RioRad (חתול 165-2244) אינם מתאימים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בני הזוג. סטיב הר Xiaoning ז'אנג עבור 35S:: GFP pGlowbug לבנות את האחווה Hokensen דוקטורט כדי CH מחקר במעבדה צ's L'נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
