Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun
Summary
Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC)
Abstract
Onderzoek naar gen-functie in diverse organismen is gebaseerd op kennis van hoe de genproducten met elkaar in hun normale cellulaire omgeving. De Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Assay<sup> 1</sup> Stelt onderzoekers in staat te visualiseren eiwit-eiwit interacties in levende cellen en is uitgegroeid tot een onmisbaar onderzoeksinstrument. Deze test is gebaseerd op de vergemakkelijkt associatie van twee fragmenten van een fluorescerend eiwit (GFP), die elk gefuseerd aan een potentiële interagerende proteïne partner. De interactie van de twee partners eiwit zou de associatie van de N-terminale en C-terminale fragment van GFP, wat leidt tot fluorescentie. Voor plantaardige onderzoekers, ui epidermale cellen zijn een ideaal experimenteel systeem voor het uitvoeren van de test BiFC vanwege het gemak bij het verkrijgen en het voorbereiden van ui weefsels en de directe visualisatie van de fluorescentie met een minimale achtergrond fluorescentie. De Helios Gene Gun (BioRad) wordt vaak gebruikt voor het bombarderen van plasmide DNA in ui cellen. We demonstreren het gebruik van de Helios Gene Gun om plasmide constructen te voeren voor twee interactie<em> Arabidopsis thaliana</em> Transcriptiefactoren, Seuss (SEU) en Leunig homoloog (LUH)<sup> 2</sup> En de visualisatie van hun interacties gemedieerd door BiFC de ui epidermale cellen.
Protocol
Discussion
- Voor het eerst gebruikt, raden we aan het oefenen van de gehele procedure, van de cartridge voorbereiding tot observatie, met een enkel plasmide constitutief reporter, zoals 35S:: GFP of 35S:: GUS. Wij gebruikten een 35S:: GFP plasmide verkregen van Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang 6 (figuur 1A, D). Het gen schot controle cartridges verkocht tegen RioRad (Cat 165-2244) zijn niet geschikt voor planten.
- Voor BiFC, een tweede positieve controle noodzakelijk is, die moet bestaan uit twee bekende interagerende p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Steve Mount en Xiaoning Zhang voor de 35S:: GFP pGlowbug bouwen en de Hokensen Doctoral Fellowship aan CH Onderzoek in het laboratorium Z. L's wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
