Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene
Summary
In questo articolo viene illustrato come utilizzare correttamente il BioRad Helios Gene Gun per introdurre DNA plasmidico in cellule epidermiche di cipolla e come test per interazioni proteina-proteina in cellule di cipolla in base al principio della complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC)
Abstract
Indagine della funzione del gene in diversi organismi si basa sulla conoscenza di come i prodotti gene interagiscono tra loro nel loro ambiente normale cellulare. La fluorescenza complementazione bimolecolare (BiFC) Assay<sup> 1</sup> Permette ai ricercatori di visualizzare le interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi ed è diventato uno strumento di ricerca fondamentale. Questo test si basa sulla associazione agevolata di due frammenti di una proteina fluorescente (GFP) che sono ogni fuso con un potenziale partner di proteine interagenti. L'interazione dei due partner proteina faciliterebbe l'associazione dei N-terminale e C-terminale frammento di GFP, portando a fluorescenza. Per i ricercatori cellule vegetali, cipolla epidermiche sono un sistema ideale di sperimentazione per condurre l'analisi BiFC a causa della facilità nel raccogliere ed elaborare i tessuti cipolla e la visualizzazione diretta della fluorescenza con fluorescenza di fondo minima. L'Helios Gun Gene (BioRad) è comunemente usato per bombardare DNA plasmidico in cellule di cipolla. Dimostriamo l'uso di Helios Gun Gene introdurre costruisce plasmide per due interagenti<em> Arabidopsis thaliana</em> Fattori di trascrizione, Seuss (SEU) e omologo Leunig (LUH)<sup> 2</sup> E la visualizzazione delle loro interazioni mediate da BiFC nelle cellule epidermiche di cipolla.
Protocol
Discussion
- Per gli utenti prima volta, si consiglia di praticare l'intera procedura, dalla preparazione delle cartucce di osservazione, con un singolo giornalista plasmide costitutivo come 35S:: GFP o 35S:: GUS. Abbiamo usato un 35S:: GFP plasmide ottenuto da Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang 6 (Figura 1A, D). Le cartucce colpo di controllo gene venduti a RioRad (Cat 165-2244) non sono adatti per le piante.
- Per BiFC, un secondo controllo positivo è necessario, che dovrebbe consistere in due partner noto che interagiscono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Steve Monte e Xiaoning Zhang per il 35S:: GFP pGlowbug costruire e la Fellowship Hokensen dottorato di ricerca in laboratorio CH Z. L's è supportato dal US National Science Foundation (IOB0616096 e MCB0744752). ZL è parzialmente supportata dalla University of Maryland Stazione esperimento agricola.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
