Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios
Summary
Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC)
Abstract
Investigação da função dos genes em diversos organismos baseia-se no conhecimento de como os produtos de genes interagem uns com os outros em seu ambiente normal de celular. O Bimolecular Fluorescência de Complementação Assay (BiFC)<sup> 1</sup> Permite aos pesquisadores visualizar interações proteína-proteína em células vivas e se tornou uma ferramenta de pesquisa essencial. Este ensaio é baseado na associação facilitada de dois fragmentos de uma proteína fluorescente (GFP), que são cada fundido a um parceiro em potencial interação de proteínas. A interação dos dois parceiros proteína facilitaria a associação da N-terminal e C-terminal de fragmento de boas práticas agrícolas, conduzindo a fluorescência. Para os pesquisadores células vegetais, cebola epidérmicas são um sistema ideal experimental para a realização do ensaio BiFC por causa da facilidade na obtenção e preparação de tecidos e cebola a visualização direta de fluorescência com fluorescência de fundo mínimo. O Gene Gun Helios (BioRad) é comumente usado para bombardear DNA plasmídeo em células de cebola. Nós demonstramos o uso de Helios Gun Gene introduzir constrói plasmídeo por dois interagindo<em> Arabidopsis thaliana</emFatores> transcrição, Seuss (SEU) e homólogo Leunig (LUH)<sup> 2</sup> Ea visualização de suas interações mediadas por BiFC em células epidérmicas de cebola.
Protocol
Discussion
- Para usuários de primeira vez, recomendamos a prática de todo o processo, desde a preparação do cartucho para observação, com um plasmídeo repórter única constitutiva, como 35S:: GFP ou 35S:: GUS. Usamos um 35S:: GFP plasmídeo obtido a partir de drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning 6 (Figura 1A, D). O gene cartuchos de tiro controle vendido a RioRad (Cat 165-2244) não são adequados para as plantas.
- Para BiFC, um segundo controle positivo é necessário, que deve ser composto de dois conhecidos parceiros in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a drs. Steve Monte e Zhang Xiaoning para o 35S:: GFP pGlowbug construir e Doutorado da Irmandade Hokensen para CH Pesquisa em laboratório Z. L's é apoiado pela National Science Foundation EUA (IOB0616096 e MCB0744752). ZL é parcialmente financiado pela Universidade de Maryland Estação Experimental Agrícola.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
