Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun
Summary
Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter Test
Abstract
Untersuchung von Genfunktionen in verschiedenen Organismen beruht auf Wissen, wie die Genprodukte miteinander interagieren in ihren normalen zellulären Umgebung. Die bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay<sup> 1</sup> Ermöglicht es den Forschern, um Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen sichtbar zu machen und ist zu einem wesentlichen Recherche-Tool. Dieser Test basiert auf der erleichterte Vereinigung von zwei Fragmente eines fluoreszierenden Proteins (GFP), die jeweils um eine mögliche interagierende Protein Partner verschmolzen basiert. Die Interaktion der beiden Proteine Partnern erleichtern würde die Assoziation der N-terminalen und C-terminale Fragment von GFP, was zu Fluoreszenz. Für das Werk Forscher sind Zwiebel Epidermiszellen ein ideales experimentelles System für die Durchführung der BIFC Test wegen der Leichtigkeit, bei der Beschaffung und Vorbereitung Zwiebel Gewebe und die direkte Visualisierung der Fluoreszenz bei minimaler Hintergrundfluoreszenz. Die Helios Gene Gun (BioRad) wird häufig für bombardiert Plasmid-DNA in Zwiebel-Zellen verwendet. Wir demonstrieren den Einsatz von Helios Gene Gun, um Plasmid-Konstrukte für zwei interagierende einführen<em> Arabidopsis thaliana</em> Transkriptionsfaktoren, Seuss (SEU) und LEUNIG Homolog (LUH)<sup> 2</sup> Und die Visualisierung ihrer Interaktionen durch BIFC in Zwiebel epidermalen Zellen vermittelt.
Protocol
Discussion
- Bei erstmaliger Benutzung, empfehlen wir üben das gesamte Verfahren von Cartridge Vorbereitung auf Beobachtung, mit einem einzigen Plasmid konstitutiv Reporter wie 35S:: GFP oder 35S:: GUS. Wir verwendeten einen 35S:: GFP-Plasmid von Drs. erhalten. Steve Berg und Xiaoning Zhang 6 (Abbildung 1A, D). Das Gen Schuss Patronen, bei RioRad (Cat 165-2244) verkauft werden, sind nicht geeignet für Pflanzen.
- Für BIFC, wird eine zweite positive Kontrolle erforderlich, die sich von zwei bekannten Interaktionspartner, fusion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. Steve Berg und Xiaoning Zhang für die 35S:: GFP pGlowbug konstruieren und die Hokensen Promotionsstipendium für CH Research in Z. L's Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
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