Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun
Summary
Den här artikeln illustrerar hur man korrekt använder BioRad Helios Gene Gun att införa plasmid DNA i lök epidermala celler och hur man testar för protein-protein interaktioner i lök celler grundat på principen om Bimolecular Fluorescens komplettering (BiFC)
Abstract
Utredning av geners funktion i olika organismer är beroende av kunskap om hur de genprodukter interagerar med varandra i sina normala cellulära miljö. Den Bimolecular Fluorescens komplettering (BiFC) analys<sup> 1</sup> Möjligt för forskare att visualisera protein-protein interaktioner i levande celler och har blivit ett viktigt forskningsverktyg. Denna analys bygger på den förenklade sammanslutning av två fragment av ett fluorescerande protein (GFP) som var och smält till en potentiell samverkande protein partner. Samspelet mellan de två protein partner skulle underlätta sammanslutning av N-terminalen och C-terminala fragment av GFP, vilket leder till fluorescens. För växtforskare, lök epidermala celler är en idealisk experimentellt system som leder BiFC analysen på grund av den lätthet att få och förbereda lök vävnader och direkt visualisering av fluorescens med minimal bakgrundsfluorescens. Helios Gene Gun (BioRad) är vanligen används för att bombardera plasmid DNA i lök celler. Vi visar användandet av Helios Gene Gun att införa plasmid konstruktioner för två samverkande<em> Arabidopsis thaliana</em> Transkriptionsfaktorer, Seuss (SEU) och Leunig HOMOLOG (LUH)<sup> 2</sup> Och visualisering av deras interaktioner BiFC i lök epidermala celler.
Protocol
Discussion
- För första gången användare rekommenderar vi att öva hela proceduren, från kassett förberedelse till observation, med en enda plasmid konstituerande reporter som 35S:: GFP eller 35S:: Gus. Vi använde en 35S:: GFP plasmid från Dr. Steve Mount och Xiaoning Zhang 6 (Figur 1A, D). Genen sköt kontroll patroner säljs på RioRad (Cat 165-2244) är inte lämpliga för växter.
- För BiFC, en andra positiv kontroll som behövs, som bör bestå av två kända samverkande partner smält till C-terminal och N-termina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Steve Mount och Xiaoning Zhang för 35S:: GFP pGlowbug konstruera och Hokensen doc till CH Forskning i Z. L's laboratorium stöds av US National Science Foundation (IOB0616096 och MCB0744752). ZL är delvis stöds av University of Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yellow onion | Any supermarket | |||
| Helios Gene Gun | BioRad | |||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
