Summary
Den här artikeln illustrerar hur man korrekt använder BioRad Helios Gene Gun att införa plasmid DNA i lök epidermala celler och hur man testar för protein-protein interaktioner i lök celler grundat på principen om Bimolecular Fluorescens komplettering (BiFC)
Abstract
Utredning av geners funktion i olika organismer är beroende av kunskap om hur de genprodukter interagerar med varandra i sina normala cellulära miljö. Den Bimolecular Fluorescens komplettering (BiFC) analys
Protocol
I. Plasmid förberedelse
Den plasmid-DNA som används för beskjutning ska vara av hög renhet och med en koncentration av 500ng/μl eller högre. För BiFC med två plasmiden konstruktioner, är 25 mikrogram för varje plasmid behövs. Med andra ord bör 1:01 molförhållandet mellan de två plasmider blandas ge upphov till 50 mikrogram totalt plasmid-DNA för beredning av patroner. Var medveten om att lägga till mer DNA än 50 mikrogram kan ge anhopning av guldpartiklar och bör undvikas. Kommersiellt tillgängliga plasmid DNA-extraktion kit rekommenderas för att isolera plasmid utsedda nationella myndigheter.
Plasmid vektorer bör vara relativt små i storlek som pUC19. Vi klonade SEU och LUH cDNA i pUC19-SPYNE och pUC19-SPYCE respektive 3. Binära vektorer för Agrobacterium-medierad omvandling är för stora och olämpligt för beskjutning.
II. Bläckpatron förberedelse
Bläckpatron förberedelse innebär partiklar beläggning guld med plasmid-DNA och lastning dem i plaströr som sedan skärs i halv cm långa bitar, som kan laddas i kassetten genen Revolver hållare. Cartridge förberedelser beskrivs i stor detalj i ett separat Jove artikel 4 och är därför inte beskrivs här. För bombardemang av lök celler, rekommenderar vi att blanda 50 mikrogram av plasmid-DNA med 12,5 mg guld partiklar per preparat, vilket ger ca upp till 50 patroner på 1 mikrogram DNA/0.25 mg guld / kassett. Varje patron är för ett skott. Den guldpartiklar kan vara antingen 0,6 ìm eller 1,0 mikrometer i diameter (Cat # 1.652.262 eller Cat # 1.652.263, Biorad). Vi rekommenderar att använda 0,5 mg / ml PVP lösning för patronen beredning. För BiFC, kombinera de två plasmiden utsedda nationella myndigheterna i varje förmodade samverkande partner i samma kassett beredning.
Efter patron förberedelser, är det viktigt att testa patroner genom att avfyra de nygjorda patroner till en helium tryck mellan 150 och 200 psi i en kvadrat Parafilm som är lindade runt en petriskål. Detta kommer att testa om guldpartiklar kan drivas effektivt från patronerna, bör du se svimmar guldpartiklar på Parafilm. Detta ger dig en uppfattning om det område som varje slag kommer att täcka. Du kan märka olika mängder av guldpartiklar drivs på Parafilm vid olika helium tryck (vid 150-200 psi intervall). Om det inte finns någon signifikant skillnad, välj det lägre trycket för beskjutning.
III. Förbereda lök vävnader
På dagen av skytte, dra av yttre skal från en stor gul lök. Med en ren och skarp rakblad, skär 4-5 skikt djupt ett rektangulärt område på ca 2 x 8 cm. Ta ut rektangulära lök vävnaden, kasta de två yttre lagren, skär den återstående lager av löken i ca 2x1.5 cm bitar. Lägg lök bitar i en petriskål med filter (Whatman 3MM papper skärs i cirklar) fuktas med sterilt vatten. Täck petriskål och de är redo att gå.
IV. Beskjutning
- Ladda patroner i den vita runda patronen innehavare. Patroner innehållande olika plasmid konstruktioner ska matas in i olika patron hållare. Varje patronhållaren kan innehålla upp till 12 patroner för 12 skott.
- Sätt i batteriet och den friska fat liner i Helios Gene Gun. Se till att både pipan liner och vapnet har respektive bifogade O-ringar.
- Först, sätt en tom patron hållaren i genen pistol, med Mark # 12 på patronhållaren mot toppen av vapnet. Advance patronhållaren en eller två gånger för att kontrollera att den är isatt korrekt.
- Fäst pistol mot helium tank och justera trycket mellan 150 och 200 psi.
- Använd hörselskydd och brand pistol ett par gånger med tomma patronhållaren att rensa ut kammaren av vapnet och se till att trycket är stabilt.
- Ta bort den tomma filterhållaren och sätt in en laddad patronhållaren. Advance patronhållaren så att patronen du vill branden är placerad längst ner (klockan 6) av patronhållaren. Skytte en bit lök här ger en form av negativ kontroll för bakgrundsfluorescens.
- Placera lök bitar i mitten av en tom petriskål med innersta lagret av löken uppåt. Vila genen pistolens pipa liner på petriskål och eld vapnet genom att hålla ner sidan knappen samtidigt som du drar avtryckaren. Överför bombarderas löken i en petriskål med fuktigt 3MM filterpapper.
- Vidare till nästa patron och eld en annan lök bit. Upprepa detta steg tills 4-5 bitar av lök skjuts. Varje lök pjäs är skjuten en gång.
- Byt till en annan patronhållaren laddade med patroner som innehåller en annan plasmid eller olika plasmid kombination. Kom ihåg att ändra fat liner ens och för att förhindra kontaminering. Skjut 4-5 lök bitar.
- Efter beskjutningen, återlämna alla lökar till perti rätter. Täck petriskålar med lock. Linda in dem med Parafilm att förhindra uttorkning. Inkubera löken bitarna vid rumstemperatur i mörker under 16-48 timmar.
- Stäng av gasen och släpper trycket Innan du tar bort den gen pistolen från helium tanken. Skruva loss fat liner, och ta bort patronhållaren och används (eller oanvänd) patroner.
- Rengöringskassett innehavare och trosskydd fat genom att sänka dem i en bägare med tvålvatten. Låt bägaren stå i ett bad sonicator och Sonikera i 20 minuter. Efteråt, skölj dem med vatten för att avlägsna alla tvålrester. Blötlägg dem i 70% etanol i en timme och sedan torka dem på hushållspapper.
V. Observation
- Efter inkubation bombarderade lök stycken för 16-20 timmar i rumstemperatur, kan vi konstatera GFP eller YFP fluorescens med hjälp av en fluorescensmikroskop såsom Zeiss Axio Observer.z1 används i denna studie.
- Använd pincett med platta ändar för att dra långsamt en enda cell lager av det inre epidermis av lök (det lager som är direkt riktad mot pistolen under bombardemanget). Placera skalet på en droppe vatten på en bild. Lägg täckglas men var noga med att minimera bubblor.
- Under ljusa fältet i mikroskop, först kontrollera om det cytoplasmiska strömmande för att säkerställa att cellerna är levande. För att göra detta utsätter bilden till den ljusa fältet ljus under några minuter att värma upp löken vävnad och sedan leta för att flytta plastids. Cytoplasmiska streaming är inte alltid lätt att se, så bli inte avskräckt om du inte kan se någon.
- För fluorescens detektion, använda lämpliga excitation och filter detektion för GFP eller YFP. Det är viktigt att inkludera negativa kontroller såsom lök bitar skjuten med en icke-fluorescerande plasmid. Svagt gul-signaler kan visas från sårade celler, luftbubblor eller skräp. Det är också viktigt att inkludera positiva kontroller. En plasmid som innehåller konstitutivt uttryckta fluorescerande reporter som 35S:: GFP är ett utmärkt positiva kontrollen. Synliga GFP signaler från lök epidermala celler (Figur 1A, D) visade att patronerna, vävnader lök, och genen pistolen skjuter ordentligt förberedda och genomförs. Därefter observerade vi växelverkan mellan SEU-pSPYNE och LUH-pSPYCE i lök bitar bombarderas med kassetter som innehåller en blandning av 35S:: SEU-pSPYNE och 35S:: LUH-pSPYCE DNA. Svag YFP fluorescens observerades i kärnan bara (Figur 1 B, E) och ange den direkta fysiska samspelet mellan SEU och LUH som förde split YFP fragment tillsammans i kärnan. Observera att YFP signalen från BiFC är betydligt svagare än GFP-signalen från 35S:: GFP.
Representativa resultat
I vår studie redovisas här, det 35S:: GFP positiv kontroll plasmid avger stark fluorescens som fyller hela cellen, inklusive både kärnan och cytoplasman (Figur 1A, D). GFP protein är tillräckligt liten för att diffundera in kärnan utan en nukleär lokalisering signal. Däremot SEU och LUH är två Arabidopsis transkriptionell faktorer tidigare visat att interagera i en jäst två-hybrid analys 2. SEU-pSPYNE (SEU smält till N-terminal fragment av YFP) och LUH-pSPYCE (SEU smält till N-terminal fragment av YFP), både för stora för att diffundera in i kärnan, innehåller kärnkraft lokalisering signaler 2,5. Den YFP fluorescerande signal detekteras i lök cellkärnan (Figur 1 B, E) visar att SEU-pSPYNE och LUH-pSPYCE kan interagera i lök kärnor. Ingen fluorescerande signal upptäcks i lök bombarderas med plasmid blandning av vektor plasmid pSPYNE som innehåller N-terminal fragment av YFP och LUH-pSPYCE (Figur 1C, F).
Den BiFC-medierad YFP fluorescens är betydligt svagare än GFP-medierade fluorescens från 35S:: GFP plasmid. I vår studie visade de också olika subcellulära lokalisering (jämför Figur 1A med B). Dessutom är antalet fluorescerande celler betydligt lägre för BiFC som BiFC bara fungerar när både partner plasmider komma in och uttrycks i samma lök celler.
Figur 1. Lysrör (A, B, C) och ljusa fält (D, E, F) bilder av lök celler bombarderas med olika plasmid konstruktioner. (A) och (D), bombarderas Lök celler med 35S:: GFP. GFP diffunderar genom hela cytoplasman och kärnan. (B) och (E), Lök celler bombarderas med lika molar blandning av 35S:: SEU-pSPYNE (SEU smält till N-terminal fragment av YFP) och 35S:: LUH-pSPYCE (LUH smält till C-terminal fragment ) plasmid-DNA. En interaktion mellan SEU-pSPYNE och LUH-pSPYCE visas med ett fluorescerande kärna. (C) och (F), bombarderade En negativ kontroll visar lök celler med blandningar av vektor pUC19-SPYNE och LUH-pSPYCE plasmids. Ingen fluorescerande signal upptäcks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
- För första gången användare rekommenderar vi att öva hela proceduren, från kassett förberedelse till observation, med en enda plasmid konstituerande reporter som 35S:: GFP eller 35S:: Gus. Vi använde en 35S:: GFP plasmid från Dr. Steve Mount och Xiaoning Zhang 6 (Figur 1A, D). Genen sköt kontroll patroner säljs på RioRad (Cat 165-2244) är inte lämpliga för växter.
- För BiFC, en andra positiv kontroll som behövs, som bör bestå av två kända samverkande partner smält till C-terminal och N-terminal fragment av YFP, respektive.
- För BiFC är det nödvändigt att inkludera flera negativa kontroller: (1) protein X smält till N-terminal fragment av YFP plus en vektor som kodar för C-terminal fragment, (2) protein Y smält till C-terminal fragment av YFP plus en vektor som kodar för N-terminal fragment, (3) vektorn bara.
- Ett diffusion skärmen kan användas på basen av Helios Gene Gun fat vid eldning skottet, som tjänar till att minska vävnadsskada. I vår studie har vi inte använda diffusion skärmen.
- Under mikroskopiska visning av YFP fluorescens förmedlas av BiFC, exponeringstid till excitation ljus bör minimeras för att minska foto blekning.
- Patroner lagras i skintillationsflaskor innehåller torkmedel är bra för flera månader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Steve Mount och Xiaoning Zhang för 35S:: GFP pGlowbug konstruera och Hokensen doc till CH Forskning i Z. L's laboratorium stöds av US National Science Foundation (IOB0616096 och MCB0744752). ZL är delvis stöds av University of Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yellow onion | Any Supplier | ||
| Helios Gene Gun | Bio-Rad | ||
| Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP | Zeiss, Nikon, Olympus |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).
- Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development. Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).
- Walter, M. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development. Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).
- Zhang, X. N., Mount, S. M. Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development. Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).
