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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Abstract

La transcripción de genes espaciotemporales está estrechamente regulada por elementos reguladores distales, como potenciadores y silenciadores, que dependen de la proximidad física con sus promotores de genes objetivo para controlar la transcripción. Aunque estos elementos reguladores son fáciles de identificar, sus genes diana son difíciles de predecir, ya que la mayoría de ellos son específicos de tipo celular y pueden estar separados por cientos de kilobases en la secuencia lineal del genoma, saltándose otros genes no diana. Durante varios años, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ha sido el estándar de oro para la asociación de elementos reguladores distales a sus genes diana. Sin embargo, PCHi-C se basa en la disponibilidad de millones de células, lo que prohíbe el estudio de poblaciones de células raras, como las que se obtienen comúnmente de los tejidos primarios. Para superar esta limitación, se ha desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un método rentable y personalizable para identificar el repertorio de elementos reguladores distales que controlan cada gen del genoma. liCHi-C se basa en un marco experimental y computacional similar al PCHi-C, pero al emplear cambios mínimos en los tubos, modificar la concentración y los volúmenes del reactivo e intercambiar o eliminar pasos, representa una pérdida mínima de material durante la construcción de la biblioteca. En conjunto, liCHi-C permite el estudio de la regulación génica y la organización del genoma espaciotemporal en el contexto de la biología del desarrollo y la función celular.

Introduction

La expresión génica temporal impulsa la diferenciación celular y, en última instancia, el desarrollo del organismo, y su alteración está estrechamente relacionada con una amplia plétora de enfermedades 1,2,3,4,5. La transcripción génica está finamente regulada por la acción de elementos reguladores, que pueden clasificarse como proximales (es decir, promotores génicos) y distales (por ejemplo, potenciadores o silenciadores), estos últimos frecuentemente ubicados lejos de sus genes diana e interactúan físicamente con ellos a través del bucle de cromatina para modular la expresión génica 6,7,8.

La identificación de regiones reguladoras distales en el genoma es un asunto ampliamente consensuado, ya que estas regiones albergan modificaciones específicas de histonas 9,10,11 y contienen motivos específicos de reconocimiento de factores de transcripción, actuando como plataformas de reclutamiento para ellos12,13,14. Además, en el caso de los potenciadores y superpotenciadores 15,16, también tienen baja ocupación nucleosómica 17,18 y se transcriben en eRNAs no codificantes 19,20.

No obstante, los genes diana de cada elemento regulador distal son más difíciles de predecir. La mayoría de las veces, las interacciones entre los elementos reguladores distales y sus objetivos son de tipo celular y específicas del estímulo 21,22, abarcan cientos de kilobases, puenteando sobre otros genes en cualquier dirección 23,24,25, e incluso pueden ubicarse dentro de regiones intrónicas de su gen objetivo u otros genes no intervinientes 26,27. Además, los elementos reguladores distales también pueden controlar más de un gen al mismo tiempo, y viceversa28,29. Esta complejidad posicional dificulta la identificación de asociaciones regulatorias entre ellos y, por lo tanto, la mayoría de los objetivos de cada elemento regulador en cada tipo de célula siguen siendo desconocidos.

Durante los últimos años, ha habido un auge significativo en el desarrollo de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) para estudiar las interacciones de la cromatina. El más utilizado de ellos, Hi-C, permite generar un mapa de todas las interacciones entre cada fragmento del genoma de una célula30. Sin embargo, para detectar interacciones significativas a nivel de fragmento de restricción, Hi-C se basa en la secuenciación ultraprofunda, lo que prohíbe su uso para estudiar rutinariamente el panorama regulatorio de genes individuales. Para superar esta limitación económica, han surgido varias técnicas 3C basadas en el enriquecimiento, como ChIA-PET31, HiChIP 32 y su contraparte HiCuT33 de baja entrada. Estas técnicas dependen del uso de anticuerpos para enriquecer las interacciones de todo el genoma mediadas por una proteína específica. No obstante, la característica única de estas técnicas 3C es también la pesadilla de su aplicación; Los usuarios cuentan con la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad para la proteína de interés y no pueden comparar condiciones en las que la unión de la proteína es dinámica.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) es otra técnica 3C basada en el enriquecimiento que elude estas limitaciones34,35. Mediante el empleo de un sistema de enriquecimiento de sonda de ARN biotinilado, PCHi-C es capaz de generar bibliotecas de alta resolución de todo el genoma de regiones genómicas que interactúan con 28.650 promotores de genes anotados en humanos o 27.595 en ratones, también conocidos como interactoma promotor. Este enfoque permite detectar interacciones significativas de largo alcance a nivel de resolución de fragmentos de restricción de promotores activos e inactivos, y comparar robustamente los interactomas promotores entre cualquier condición independientemente de la dinámica de las modificaciones de histonas o la unión a proteínas. El PCHi-C ha sido ampliamente utilizado en los últimos años para identificar reorganizaciones del interactoma promotor durante la diferenciación celular 36,37, identificar el mecanismo de acción de los factores de transcripción38,39 y descubrir nuevos genes potenciales y vías desreguladas en la enfermedad por variantes no codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, junto con nuevas mutaciones no codificantes49,50. Además, con solo modificar el sistema de captura, esta técnica puede personalizarse de acuerdo con la pregunta biológica para interrogar cualquier interactoma (por ejemplo, el interactoma potenciador 51 o el interactoma de una colección de alteraciones no codificantes41,52).

Sin embargo, PCHi-C se basa en un mínimo de 20 millones de células para realizar la técnica, lo que impide el estudio de poblaciones celulares escasas como las que se utilizan a menudo en biología del desarrollo y aplicaciones clínicas. Por esta razón, hemos desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un nuevo método rentable y personalizable basado en el marco experimental de PCHi-C para generar interactomas promotores de alta resolución con entrada de baja celda. Al realizar el experimento con cambios mínimos de tubo, intercambiar o eliminar pasos del protocolo PCHi-C original, reducir drásticamente los volúmenes de reacción y modificar las concentraciones de reactivos, se maximiza la complejidad de la biblioteca y es posible generar bibliotecas de alta calidad con tan solo 50,000 celdas53.

La captura Hi-C de baja entrada (liCHi-C) ha sido comparada con PCHi-C y utilizada para dilucidar el recableado del interactoma promotor durante la diferenciación de células hematopoyéticas humanas, descubrir nuevos genes y vías potenciales asociadas a enfermedades desreguladas por alteraciones no codificantes y detectar anomalías cromosómicas53. El protocolo paso a paso y los diferentes controles de calidad a través de la técnica se detallan aquí hasta la generación final de las librerías y su análisis computacional.

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Protocol

Para garantizar una pérdida mínima de material, (1) trabaje con tubos y puntas de ADN de baja unión (consulte la Tabla de materiales), (2) coloque reactivos en la pared del tubo en lugar de introducir la punta dentro de la muestra y, (3) si es posible, mezcle la muestra por inversión en lugar de pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo, y gire hacia abajo después para recuperar la muestra.

1. Fijación celular

  1. Células que crecen en suspensión
    1. Cosechar de 50.000 a un millón de células y colocarlas en un tubo de ADN de baja unión de 1,5 ml.
      NOTA: Los tipos de células utilizados para el presente estudio se detallan en la sección de resultados representativos.
    2. Centrifugar las celdas durante 5 min a 600 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y extraer el sobrenadante mediante pipeteo.
    3. Resuspender las células en 1 ml de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a temperatura ambiente.
    4. Agregue 143 μL de formaldehído al 16% sin metanol para alcanzar una concentración del 2% y mezcle.
    5. Incubar las células durante 10 minutos mientras gira a temperatura ambiente para fijar las células.
      NOTA: Trate de ser lo más preciso posible con la incubación de 10 minutos. La fijación excesiva o insuficiente de las células puede conducir a una disminución en la calidad de la biblioteca.
    6. Apague la reacción agregando 164 μL de glicina 1 M helada y mezcle. Incubar las celdas durante 5 minutos, girando a temperatura ambiente.
    7. Incubar aún más las células durante 15 minutos en hielo, mezclando por inversión cada ~ 5 minutos.
    8. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y retirar el sobrenadante.
    9. Lave las células resuspendiendo el gránulo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
    10. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante.
      NOTA: Las celdas granuladas pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 °C.
  2. Células adherentes
    1. Lave las células en la placa de cultivo con 1x PBS.
    2. Prepare suficiente RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y formaldehído al 2% sin metanol a temperatura ambiente para cubrir la placa de cultivo.
    3. Agregue los medios suplementados a la placa de cultivo con las células e incube durante 10 minutos, balanceando a temperatura ambiente para fijar las células.
      NOTA: Trate de ser lo más preciso posible con la incubación de 10 minutos. La fijación excesiva o insuficiente de las células puede conducir a una disminución en la calidad de la biblioteca.
    4. Apagar la reacción añadiendo 1 M de glicina hasta 0,125 M y mezclar balanceando.
    5. Incubar las celdas durante 5 minutos, balanceándolas a temperatura ambiente.
    6. Incubar las células durante 15 minutos a 4 °C, mezclando meciendo cada 3-4 min.
    7. Retire el medio y lave las células con 1x PBS frío.
    8. Raspa las células y transfiéralas a un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Limpie el plato de cultivo con 0.5-1 ml de PBS frío 1x.
    9. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y retirar el sobrenadante. Las células peletizadas pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 °C.

2. Lisis y digestión

  1. Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis fría (Tabla 1) para interrumpir la membrana celular. La adición del tampón solo debería ser suficiente para resuspender las células, pero pueden resuspenderse aún más si es necesario mediante vórtice ligero.
  2. Incubar en hielo durante 30 min, mezclando por inversión cada ~5 min. Centrifugar los núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender los núcleos con 500 μL de tampón de restricción 2 frío 1.25x (ver Tabla de materiales).
  3. Centrifugar los núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender los núcleos en 179 μL del tampón de restricción 1.25x 2.
  4. Agregue 5.5 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS; consulte la Tabla de materiales) y mezcle. Las células pueden formar grumos; Esto es normal y debe desglosarse tanto como sea posible mediante vórtices. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  5. Apague la SDS agregando 37.5 μL de Triton X-100 al 10% y mezcle. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  6. Digiera la cromatina agregando 7.5 μL de HindIII (100 U/μL; ver Tabla de materiales) y mezcle. Incubar la muestra durante la noche a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  7. A la mañana siguiente, añadir 2,5 μL adicionales de HindIII (100 U/μL) e incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm para asegurar una digestión adecuada de la cromatina.
    NOTA: Como parte de los controles de eficiencia digestiva (ver paso 5.1), transfiera el equivalente de 20.000 a 40.000 núcleos a otro tubo para representar el control no digerido. Después de la digestión, transfiera el mismo número de células a otro tubo nuevamente para representar el control digerido. Se recomienda probar la eficiencia de la digestión como un experimento separado si la disponibilidad del material de partida es escasa.

3. Ligadura y desenlace

  1. Enfríe la muestra en hielo. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para rellenar y biotinilar los voladizos del fragmento de restricción: 3 μL de tampón de restricción 10x 2, 1 μL de agua libre de nucleasa, 0.75 μL de 10 mM dCTP, 0.75 μL de 10 mM dTTP, 0.75 μL de 10 mM dGTP, 18.75 μL de 0.4 mM biotina-14-dATP y 5 μL de 5 U/μL de Klenow (ver Tabla de materiales). Incubar la muestra durante 75 min a 37 °C, mezclando por inversión cada ~15 min.
  2. Enfríe la muestra en hielo. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para ligar los extremos de ADN rellenos: 50 μL de tampón de ligadura 10x, 2.5 μL de albúmina sérica bovina (BSA) de 20 mg / ml de albúmina sérica bovina (BSA), 12.5 μL de 1 U/μL de ligasa de ADN T4 y 173 μL de agua libre de nucleasas (ver Tabla de materiales).
  3. Incubar la muestra durante 4-6 h a 16 °C, mezclando por inversión cada ~1 h. Además, incubar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Desentrecruza la cromatina añadiendo 30 μL de proteinasa K de 10 mg/ml y mezcla. Incubar la muestra durante la noche a 65 °C.
  4. A la mañana siguiente, añadir 15 μL adicionales de 10 mg/ml de proteinasa K e incubar la muestra durante 2 h a 65 °C para garantizar una reticulación adecuada de la cromatina.

4. Purificación del ADN

  1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente y transferirla a un tubo adecuado para la purificación de fenol-cloroformo.
  2. Añadir 1 volumen (545 μL) de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) para purificar el ADN y mezclar agitando vigorosamente.
  3. Centrifugar la muestra durante 5 min a 12.000 x g a temperatura ambiente y transferir la fase acuosa superior (545 μL) a un tubo de baja unión de ADN de 2 ml.
  4. Agregue los siguientes reactivos para precipitar el ADN: 1,362.5 μL de etanol 100% refrigerado a -20 ° C, 54.5 μL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y 2 μL de glucógeno de 15 mg / ml como coprecipitante.
  5. Incubar durante 1 h a -80 °C o durante la noche a -20 °C.
  6. Centrifugar la muestra durante 30 min a 16.000-21.000 x g a 4 °C y retirar el sobrenadante. El pellet de ADN debe ser visible.
  7. Lave el pellet agregando 1 ml de etanol al 70%, vórtice y centrifugación durante 10 minutos a 16,000-21,000 x g a temperatura ambiente.
  8. Retire el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire. Resuspender el pellet de ADN en 130 μL de agua libre de nucleasas.
  9. Evaluar la concentración mediante cuantificación fluorométrica (ver Tabla de materiales). Almacene el material purificado de 3C a -20 °C durante varios meses antes de continuar con el protocolo.

5. Controles de calidad opcionales

  1. Evaluar la eficiencia digestiva. Realizar la desvinculación y purificación del ADN fenol:cloroformo, como se describió anteriormente, a los controles no digeridos y digeridos obtenidos en el paso 2.13. Resuspender el pellet de ADN en 10 μL de agua libre de nucleasas. Cuantificar la concentración y diluir el ADN obtenido, si es necesario, a 4 ng/μL.
  2. Realice PCR cuantitativa con 4 ng de ADN tanto de los controles no digeridos como de los digeridos, con cebadores que abarcan un locus de cromatina abierto con y sin un objetivo HindIII (consulte la Tabla 2 para el diseño del cebador). Calcule la eficiencia de la digestión siguiendo un informe publicado anteriormente35.
    NOTA: La eficiencia de la ligadura se calcula como un porcentaje utilizando la fórmula: digestión (%) = 100 -100/(2^[(Ct digerido con HindIII - Ctdigested without HindIII) - (Ct no digerido con HindIII - Ct no digerido sin HindIII)]) (ver Tabla 3), que tiene en cuenta el diferencial de los diferentes Cts obtenidos para cada par de cebadores en los controles no digeridos y digeridos.
  3. Evalúe la sensibilidad de la detección de interacción mediante la realización de la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm ambos cebadores F + R, 0,1 y U/μL de polimerasa de arranque en caliente), con cebadores que abarcan interacciones invariantes celulares de largo y corto alcance (consulte la Tabla 2 para el diseño del cebador). Utilice 50-100 ng de material 3C (para interacciones de corto y largo alcance, respectivamente) y amplíe utilizando las siguientes condiciones: 98 °C durante 15 min, seguido de 37 ciclos de 98 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min, y terminar a 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
    NOTA: Si la cantidad de ADN obtenida es inferior a 2 μg, compruebe únicamente una interacción de largo y corto alcance en lugar de todo el panel de interacción.
  4. Ejecute el producto en 1x tris-borato-EDTA (TBE) utilizando gel de agarosa al 1,6% y busque la presencia del amplificador PCR correspondiente54.
    NOTA: Debido al impredecible "cortar y pegar" del genoma, pueden aparecer bandas inespecíficas. Siempre que se observe el tamaño de banda correcto, se cuenta como correcto.
  5. Evalúe la eficiencia del relleno y la ligadura de biotina digiriendo diferencialmente un producto de PCR de corto alcance con HindIII, NheI (consulte la Tabla de materiales), ambas enzimas o ninguna (agua) y ejecutando el producto en un gel de agarosa 1x TBE al 1,6%. Un relleno y ligadura correctos eliminan el objetivo HindIII anterior y crean un nuevo objetivo NheI, por lo que el amplicón debe cortarse solo en presencia de NheI.
    NOTA: Para minimizar la pérdida de material, recupere 2,5 μL de un producto de PCR de corto alcance de los controles de interacción y vuelva a amplificarlo cinco veces para realizar los controles de relleno y ligadura.

6. Sonicación

  1. Transfiera los 130 μL de la muestra (rellene con agua libre de nucleasas si se usó algo para los controles) a una cubeta adecuada para la sonicación.
  2. Configure un sonicador de baño de agua y un sonicate utilizando los siguientes parámetros (optimizados para el modelo y las cubetas descritas en la Tabla de materiales): factor de trabajo: 20%; potencia de incidencia máxima: 50; ciclos por ráfaga: 200; Tiempo: 65 s; y rango de temperatura: 6-10 °C (óptimo 8 °C).
  3. Transfiera la muestra a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.

7. Reparación final

  1. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para reparar los extremos desiguales de los fragmentos de ADN creados durante la sonicación: 18 μL de tampón de ligadura 10x, 18 μL de mezcla dNTP de 2.5 mM cada uno, 6.5 μL de 3 U/μL T4 ADN polimerasa, 6.5 μL de 10 U/μL T4 PNK y 1.3 μL de 5 U/μL Klenow (ver Tabla de materiales).
  2. Incubar la muestra durante 30 min a 20 °C y completar con tampón Tris-low EDTA (TLE) (ver Tabla 1) hasta 300 μL.

8. Extracción de biotina

  1. Transfiera 150 μL de perlas de estreptavidina C1 (consulte la Tabla de materiales) por muestra a un tubo de 1.5 ml, colóquelas en un imán de tubo de 1.5 ml y espere de 2 a 3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás.
  2. Lave las perlas con 400 μL de 1x tampón Tween (TB; ver Tabla 1). Para lavar las cuentas, agregue el tampón y vuelva a suspenderlas mediante un vórtice suave. Coloque el tubo de nuevo en el imán y espere 2-3 minutos o hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás.
  3. Lave las perlas con 300 μL de 1x sin tampón Tween (NTB; ver Tabla 1). Resuspender las perlas en 300 μL de 2x NTB (ver Tabla 1).
    NOTA: Las perlas pueden formar una capa polvorienta alrededor de la pared del tubo al lavarlas con tampones sin detergente. Esto es normal y no afecta el resultado del protocolo.
  4. Combinar estos 300 μL de perlas en 2x NTB con los 300 μL de la muestra. Incubar durante 15 minutos, girando a temperatura ambiente para extraer los fragmentos de ADN informativos con biotina. La biblioteca ahora está pegada a las cuentas de estreptavidina C1.
  5. Lave las perlas con 400 μL de 1x NTB. Lave las perlas con 100 μL de tampón TLE y luego vuelva a suspenderlas en 35.7 μL de tampón TLE.

9. dATP-tailing, ligadura del adaptador y amplificación por PCR

  1. Preparar una mezcla maestra y añadir los siguientes reactivos a la muestra para dATP-cola los extremos de los fragmentos de ADN reparados: 5 μL de tampón de restricción 10x 2, 2,3 μL de 10 mM dATP, y 7 μL de 5 U/μL Klenow exo-. Incubar la muestra durante 30 min a 37 °C.
  2. Inactivar Klenow exo- incubando la muestra durante 10 min a 65 °C. Enfríe la muestra en hielo. Lave las perlas con 300 μL de 1x TB. Lave las perlas con 300 μL de 1x NTB.
  3. Lave las perlas con 100 μL de 1x tampón de ligadura y luego resuspenda en 50 μL de 1x tampón de ligadura. Agregue 4 μL de mezcla adaptadora prerecocida de 15 μM (ver Tabla 2) y 1 μL de 2,000 U/μL de ADN ligasa T4 (ver Tabla de materiales) a la muestra.
  4. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Lave las perlas con 400 μL de 1x TB. Lave las perlas con 200 μL de 1x NTB. Lave las perlas con 100 μl de 1x tampón de restricción 2.
  5. Lave las perlas con 50 μL de 1x tampón de restricción 2 y luego vuelva a suspenderlas en 50 μL de 1x tampón de restricción 2.
  6. Mezcle los siguientes reactivos para preparar la reacción de PCR para amplificar la biblioteca: 50 μL de perlas con la biblioteca, 250 μL de 2x mezcla maestra de PCR con enzima, 12 μL de cebadores F + R (25 μM cada uno; ver Tabla 2) y 188 μL de agua libre de nucleasas.
  7. Realizar la PCR con las siguientes condiciones (dividir la mezcla de reactivos de PCR en reacciones de 50 μL): 98 °C durante 40 s, seguido de ciclos X de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s y terminar a 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
    NOTA: Utilice el siguiente número de ciclos como punto de partida para optimizar el protocolo en celdas diploides con el objetivo de una salida de 500-1.000 ng antes de la captura de la biblioteca: un millón de celdas para ocho ciclos; 250.000 células para 10 ciclos; 50.000 células para 12 ciclos.
  8. Agrupe todas las reacciones de 50 μL de la misma muestra en un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml, colóquelo en un imán de tubo de 1,5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared.
  9. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (500 μL) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Rellene con tampón TLE a 500 μL si se pierde parte del sobrenadante. Las perlas de estreptavidina C1 ya no son necesarias.
  10. Realice una selección de doble cara55 utilizando purificación de perlas paramagnéticas (volumen 0.4-1). Esto permite la eliminación selectiva de fragmentos demasiado grandes (>1.000 pb) y demasiado pequeños o cebadores de PCR (<200 pb), dependiendo de la concentración de polietilenglicol y sal de las perlas paramagnéticas añadidas.
  11. Agregue 200 μL (0.4 volúmenes) de cuentas de stock a la biblioteca y mezcle por vórtice. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente.
  12. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (sin los fragmentos más grandes) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  13. Concentre las perlas tomando 750 μL de perlas de stock, colóquelas en un tubo de 1.5 ml en un imán, espere 2-3 min o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas mediante un vórtice en 300 μL de cuentas nuevas.
  14. Añadir estos 300 μL de perlas concentradas a la muestra (1 volumen) y mezclar por vórtice. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared y retire el sobrenadante (que contiene los fragmentos más pequeños y los cebadores de PCR).
  15. Lave las perlas tres veces con 1 ml de etanol al 70%. Para hacer esto, agregue el etanol mientras el tubo con las perlas todavía está en el imán, tratando de no molestar las perlas, y espere 30-60 s. Después, retire el sobrenadante sin alterar las cuentas.
  16. Deje que las perlas se sequen al aire y resuspenda en 21 μL de tampón TLE mediante vórtice.
    NOTA: El secado excesivo de las perlas puede reducir el rendimiento al eluyir el ADN. Trate de resuspenderlos en tampón TLE inmediatamente después de que ya no estén "brillantes" del etanol.
  17. Incubar la muestra durante 10 min a 37 °C en un termobloque para eluyer la biblioteca de las cuentas. Coloque el tubo en un imán y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  18. Cuantificar el tamaño y la concentración mediante electroforesis automatizada (ver Tabla de materiales). El material Hi-C purificado se puede almacenar a -20 °C durante varios meses antes de continuar con el protocolo.

10. Captura de la biblioteca

  1. Trabajar con 500-1.000 ng de la biblioteca. Concentrar la biblioteca secando el ADN usando un concentrador de vacío y resuspendiendo el material en 3.4 μL de agua libre de nucleasas.
  2. Agregue los siguientes bloqueadores del kit de enriquecimiento objetivo (consulte la Tabla de materiales) a la muestra: 2,5 μL del bloqueador 1, 2,5 μL del bloqueador 2 y 0,6 μL del oligobloqueante personalizado para los adaptadores.
  3. Vuelva a suspender completamente, transfiera la solución a una tira de PCR de 0,2 ml e incubar en un termociclador durante 5 min a 95 °C, seguido de 5 min a 65 °C con una tapa calentada. Dejar el tubo incubando a 65 °C.
  4. Preparar la solución de hibridación combinando los siguientes reactivos del kit de enriquecimiento objetivo (ver Tabla de materiales) por muestra (13 μL). Mantener en el banco a temperatura ambiente: 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 y 3,45 μL de Hyb 4.
  5. Diluir 0,5 μL de bloque de RNasa del kit de enriquecimiento objetivo con 1,5 μL de agua libre de nucleasa por muestra. Descongele 5 μL del ARN biotinilado por muestra en hielo y añádale los 2 μL del bloque de RNasa diluido. Mantener en el banco a temperatura ambiente.
  6. Añadir los 13 μL de la solución de hibridación a los 7 μL del ARN biotinilado con RNasa y mezclar bien.
  7. Mientras esté en el termociclador a 65 °C, transfiera la solución de hibridación con el ARN biotinilado (20 μL) a la biblioteca bloqueada. Cierre firmemente la tapa del tubo e incubar en el termociclador durante la noche a 65 °C.
    NOTA: Para minimizar la evaporación de la muestra (que puede conducir a una hibridación subóptima de ARN-ADN) al realizar varias muestras al mismo tiempo, utilice una pipeta multicanal para transferir el ARN biotinilado a cada biblioteca al mismo tiempo.

11. Extracción de biotina y amplificación por PCR

  1. Transfiera 50 μL de perlas de estreptavidina T1 por muestra a un tubo de baja unión de ADN de 1.5 ml, colóquelas en un imán de tubo de 1.5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás. Lave las perlas tres veces con 200 μL del tampón de unión del kit de enriquecimiento objetivo.
  2. Resuspender las perlas en 200 μL de tampón de unión. Mientras esté en el termociclador a 65 °C, transfiera la muestra a las perlas de estreptavidina T1 resuspendidas e incube durante 30 minutos, girando a temperatura ambiente.
  3. Lave las perlas con 200 μL de tampón de lavado 1 del kit de enriquecimiento objetivo. Incubar durante 15 min, girando a temperatura ambiente. Lavar las perlas tres veces con 200 μL de tampón de lavado 2 del kit de enriquecimiento objetivo calentado a 65 °C. Incubar durante 10 min a 65 °C en un termobloque, agitando a 300 rpm entre lavados.
  4. Lave las perlas con 200 μL de 1x tampón de restricción 2 y luego vuelva a suspenderlas en 30 μL de 1x tampón de restricción 2.
  5. Mezcle los siguientes reactivos para preparar la reacción de PCR para amplificar la biblioteca: 30 μL de perlas con la biblioteca, 150 μL de 2x PCR mastermix con enzima, 7.2 μL de cebadores F + R (25 μM cada uno; ver Tabla 2) y 112.8 μL de agua libre de nucleasas.
  6. Realizar la PCR con las siguientes condiciones (dividir la mezcla de reactivos de PCR en reacciones de 50 μL): 98 °C durante 40 s, seguido de cuatro ciclos de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s y terminar con 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
  7. Agrupe todas las reacciones de 50 μL de la misma muestra en un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml, colóquelo en un imán de tubo de 1,5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared.
  8. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (300 μL) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Rellene con tampón TLE a 300 μL si se perdió parte del sobrenadante. Las perlas de estreptavidina T1 ya no son necesarias.
  9. Realice una purificación de ADN utilizando perlas paramagnéticas (0,9 volúmenes; consulte la Tabla de materiales). Agregue 270 μL de perlas de caldo a la muestra y mezcle por vórtice.
  10. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente.
  11. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared y retire el sobrenadante.
  12. Lave las perlas tres veces con 1 ml de etanol al 70%. Para hacer esto, agregue el etanol mientras el tubo con las perlas todavía está en el imán, tratando de no molestar las perlas, y espere 30-60 s. Después, retire el sobrenadante sin alterar las cuentas.
  13. Deje que las perlas se sequen al aire y resuspenda en 21 μL de tampón TLE mediante vórtice.
    NOTA: El secado excesivo de las perlas puede reducir el rendimiento al eluyir el ADN. Trate de resuspenderlos en tampón TLE inmediatamente después de que ya no estén "brillantes" del etanol.
  14. Incubar la muestra durante 10 min a 37 °C en un termobloque para eluyer la biblioteca de las cuentas.
  15. Coloque el tubo en un imán y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  16. Cuantificar el tamaño y la concentración mediante electroforesis automatizada.

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Representative Results

liCHi-C ofrece la posibilidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de todo el genoma de alta calidad y resolución con tan solo 50.000 células53. Esto se logra – además de la reducción drástica de los volúmenes de reacción y el uso de artículos de plástico de baja unión de ADN en todo el protocolo – eliminando pasos innecesarios del protocolo original, en los que se producen pérdidas significativas de material. Estos incluyen la purificación de fenol después de la desinterconexión, la eliminación de biotina y la posterior purificación de fenol-cloroformo y precipitación de etanol. Además de eso, reorganizar los pasos de la preparación de la biblioteca Hi-C (extracción de biotina, A-tailing, ligadura de adaptadores, amplificación por PCR y selección de perlas paramagnéticas de doble cara, también como purificación del producto de PCR) nos permite eliminar otro paso innecesario de purificación de ADN. Una descripción general del flujo de trabajo experimental se puede encontrar en la Figura 1A.

Para evaluar la calidad de la biblioteca, se realizan varios controles a lo largo del protocolo, el primero de los cuales es el cálculo de la eficiencia de la digestión del genoma; los valores superiores al 80% se consideran aceptables (Tabla 3). Se sugiere verificar la eficiencia de digestión del tipo de célula en un experimento separado para no perder una cantidad significativa de material de un solo experimento liCHi-C. En segundo lugar, antes de la sonicación y la reparación final, se recomienda verificar la sensibilidad de la detección de interacciones mediante la amplificación de las interacciones de cromatina invariantes de tipo celular mediante PCR convencional (Figura 1B). Si se detecta el producto específico, se debe realizar un tercer control, centrándose en la eficiencia de biotinilación y ligadura mediante la digestión diferencial de uno de los productos de PCR obtenidos previamente con HindIII y NheI (Figura 1C, D). Al llenar un sitio de restricción HindIII digerido y ligarlo con otro, se genera un nuevo sitio de restricción NheI en lugar de regenerar el HindIII original. Por lo tanto, la digestión del amplicón de PCR solo debe observarse cuando NheI está presente. Finalmente, justo antes y después de toda la captura, la concentración y la distribución del tamaño deben verificarse mediante electroforesis automatizada. La amplificación de la biblioteca previa a la captura debe tener como objetivo obtener 500-1.000 ng de material Hi-C, la cantidad exacta necesaria para realizar la captura de la sonda de ARN, ya que la amplificación excesiva de la biblioteca pre y post-capturada conduce a un alto porcentaje de duplicados de PCR y la consiguiente pérdida de lecturas de secuenciación durante el análisis. Las bibliotecas pueden volver a amplificarse en las mismas condiciones si no se obtiene suficiente material durante la primera amplificación conservadora por PCR. La cantidad de material de biblioteca post-capturado puede variar, pero como regla general, debe ser aproximadamente diez veces a 20 veces menos que antes de la captura. La distribución del tamaño de la biblioteca debe caer alrededor de 450-550 pb (Figura 2A, B), invariable entre las bibliotecas pre y post-capturadas. En conjunto, los resultados correctos de estos controles aseguran la generación de excelentes bibliotecas liCHi-C.

Las bibliotecas liCHi-C terminadas se secuencian y analizan (al menos) 100 pb de extremo pareado. Los datos de secuenciación sin procesar53 se procesan mediante la canalizaciónHiCUP 56 para asignar y filtrar artefactos. El informe HiCUP ideal muestra un aumento de cinco a diez veces en la distribución de las lecturas cis (dentro del mismo cromosoma) en comparación con las lecturas trans (entre diferentes cromosomas), como se describió anteriormente según la ligadura en el núcleo Hi-C57 (Figura 3B). La obtención de más de 100 millones de lecturas únicas y válidas tras la eliminación de duplicados de PCR es suficiente para proceder al siguiente paso del análisis (Figura 3B), que es evaluar la eficiencia de captura. Las lecturas de extremo pareado en las que ninguno de sus extremos se mapea en un fragmento de restricción capturado por el sistema de enriquecimiento de la sonda de ARN, se descartan, manteniendo solo las que representan el interactoma promotor de la célula (es decir, aquellas lecturas en las que al menos uno de sus extremos se mapea en fragmentos de restricción que contienen uno o más promotores de genes [Figura 3C], idealmente más del 60%).

Finalmente, se denominan interacciones significativas con la tubería CHiCAGO, como se describe en58,59. Se necesitan dos o más réplicas biológicas para el conjunto final de interacciones promotoras significativas. La calidad de los datos también se puede validar mediante el análisis de componentes principales (PCA), ya que las réplicas biológicas deben agruparse y los tipos de células deben separarse. Por ejemplo, al analizar conjuntos de datos de liCHi-C de cuatro tipos diferentes de células primarias del árbol hematopoyético humano (progenitores mieloides comunes, monocitos, megacariocitos y eritroblastos), podemos observar en un PCA que las bibliotecas liCHi-C se agrupan de una manera que refleja la trayectoria del desarrollo (Figura 3D). Un examen más detallado de las interacciones significativas detectadas para los cuatro tipos de células revela que los interactomas promotores son específicos y dinámicos del tipo celular durante el desarrollo celular. Por ejemplo, el gen AHSP, una chaperona clave sintetizada en precursores eritroides que supervisa el plegamiento correcto de la hemoglobina60,61,62, muestra una ganancia de interacciones con elementos reguladores potencialmente activos (es decir, regiones enriquecidas con H3K27ac y H3K4me1) en eritroblastos, pero no en otros tipos de células (Figura 4). Esto demuestra que el método liCHi-C puede descubrir posibles interacciones reguladoras en tipos de células raras.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del protocolo y controles de calidad de la muestra antes de la sonicación . (A) Descripción esquemática del protocolo liCHi-C dividido por días. Las manos B y azul representan, respectivamente, moléculas de biotina y pasos en los que se puede detener el protocolo de manera segura durante un largo período de tiempo. (B) Resultados representativos de los controles de interacción 3C. Se muestran ambos conjuntos de interacción para humano (izquierda) y ratón (derecha). Las bandas a esperar están marcadas en azul oscuro, mientras que una banda inespecífica está marcada en azul claro. (C) Controles representativos de relleno y ligadura utilizando el par de cebadores de interacción humana "Dekker". La banda se corta solo en los carriles 2 y 3, donde se agrega NheI. (D) Representación esquemática de la generación de un nuevo sitio de restricción NheI durante el relleno y la ligadura de un sitio de restricción HindIII. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Perfiles representativos de electroforesis automatizada de bibliotecas antes y después de la captura. (A) Perfil de electroforesis automatizada de una biblioteca justo antes de la captura. La cantidad total de ADN obtenido es de 994 ng (49,7 ng/μL en 20 μL). (B) Perfil de electroforesis automatizada de alta sensibilidad de una biblioteca liCHi-C terminada. La muestra se carga medio diluida para preservar la mayor cantidad de material posible. La cantidad total de ADN obtenido es de 61,2 ng (1,53 ng/μL en 20 μL x2 para tener en cuenta la dilución). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Salida representativa de la canalización HiCUP y agrupación en clústeres de replicación de muestras por PCA . (A) Clasificación de la validez de los pares de lectura por porcentajes y recuentos totales. Los pares de lectura no válidos se subclasifican según el tipo de artefacto experimental. (B) Porcentajes de deduplicación y clasificación de los tipos de interacción. Las interacciones cis se subclasifican además como cis-close (menos de 10 kb) y cis-far (más de 10 kb). (C) Porcentaje de eficiencia de captura. Los pares de lectura capturados se subclasifican aún más si un extremo, el otro o ambos contienen uno o más promotores. (D) Análisis de componentes principales de las puntuaciones de interacción significativa de CHiCAGO de ambas réplicas de bibliotecas liCHi-C de progenitores mieloides comunes (CMP), eritroblastos, megacariocitos y monocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Paisaje de interacción de AHSP en células hematopoyéticas primarias humanas. Ejemplo representativo del panorama de interacción centrado en el promotor AHSP en progenitores mieloides comunes (CMP), eritroblastos (Ery), megacariocitos (MK) y monocitos (Mon) como se ve en el WashU Epigenome Browser63. Los arcos representan interacciones significativas. El tono azul oscuro muestra el promotor del gen AHSP, mientras que los tonos azul claro se superponen a posibles elementos reguladores activos que interactúan específicamente con el promotor AHSP en los eritroblastos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición y preparación del tampón. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Cebadores de PCR y secuencias de adaptadores. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Ejemplo del cálculo para la eficiencia digestiva. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

liCHi-C ofrece la capacidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de alta resolución utilizando un marco experimental similar al de PCHi-C, pero con un número de células muy reducido. Esto se logra en gran medida mediante la eliminación de pasos innecesarios, como la purificación de fenol y la eliminación de biotina. En el protocolo clásico Hi-C de ligadura en núcleo57 y su posterior técnica derivada PCHi-C, la biotina se elimina de fragmentos de restricción no ligados para evitar extraer fragmentos de ADN que luego no son informativos. Omitir esta parte y su posterior purificación del ADN no se traduce en una reducción significativa en el porcentaje de lecturas válidas (Figura 3A) mientras se eliminan los posibles pasos de pérdida de ADN, que son las purificaciones de ADN. La reorganización de la preparación de la biblioteca Hi-C después de la sonicación permite omitir otra purificación innecesaria utilizando la selección de doble cara como el paso de purificación en sí. Todo esto mejora el rendimiento de todo el protocolo al emplear cambios mínimos de tubo, y junto con la reducción en el volumen de reacción, los cambios en la concentración de reactivos y el uso de artículos de plástico de baja unión de ADN, es lo que permite la generación de bibliotecas de alta calidad utilizando tan solo 50,000 células. Es importante tener en cuenta que el número de celda inicial determina, en parte, el número de interacciones significativas debido a la complejidad de la biblioteca. Aunque las bibliotecas generadas con 50.000 células conservan las características topológicas específicas e invariantes de tipo celular de bibliotecas más complejas53, nuestra recomendación es utilizar, si es posible, más de 100.000 células por réplica biológica para capturar un mayor número de interacciones promotoras significativas.

La resolución de las interacciones detectadas en las técnicas 3C viene dada esencialmente por la enzima de restricción utilizada. Aquí, la aplicación de liCHi-C se describe utilizando HindIII, una enzima de corte de 6 pb que da una resolución media teórica de 4.096 pb. liCHi-C permite reemplazar la enzima de restricción, por ejemplo, hacia una enzima de corte de 4 pb o incluso una nucleasa microcócica, aumentando así la resolución de las interacciones significativas detectadas. Se ha informado que la generación de bibliotecas liCHi-C, cambiando la enzima de restricción HindIII por la enzima MboI de corte de 4 pb, ofrece excelentes resultados detectando casi el doble de interacciones totales, aunque con el desplazamiento de la distancia lineal media de las interacciones detectadas a la mitad de la distancia53.

En cuanto al sistema real de enriquecimiento de la sonda de ARN, una de las principales ventajas de utilizar este tipo de captura frente a una basada en anticuerpos, como HiChIP32 o HiCuT33, entre otras, es la capacidad de comparar condiciones independientemente de la unión de la proteína, así como no tener que depender de la disponibilidad de un anticuerpo funcional para la proteína de interés. Además, el sistema de enriquecimiento de ARN se puede adaptar para capturar cualquier región específica de todo el genoma para satisfacer las necesidades de cada investigador (el diseño se discute en35,64).

Además de los métodos de captura basados en anticuerpos, en los últimos años se han desarrollado varios métodos sobresalientes de células individuales (como scHi-C 65, Dip-C 66 o Sci-Hi-C 67, entre otros) o de baja entrada (como Low-C 68 o Easy Hi-C 69) para investigar la arquitectura del genoma 3D. Sin embargo, estos generan mapas de contacto dispersos con baja resolución que no permiten la identificación de contactos entre elementos reguladores distales y genes diana. liCHi-C es un método capaz de superar esta limitación, abriendo la posibilidad de estudiar la arquitectura del genoma centrada en el promotor en tipos de células escasas y brindando la oportunidad de avanzar en nuestra comprensión de la biología celular y del desarrollo y el desarrollo de enfermedades.

A pesar de todas sus características, liCHi-C no está exento de limitaciones. En primer lugar, el procesamiento de los datos de secuenciación sin procesar no es trivial, y se necesitan habilidades computacionales justas para analizar los datos e interpretar sus resultados. Además, liCHi-C no discrimina entre interacciones funcionales y estructurales; se requiere que los datos de liCHi-C se integren con datos epigenéticos y / o análisis funcional para validar las posibles interacciones funcionales de los promotores de genes con sus elementos reguladores objetivo. Por último, la complejidad de la biblioteca se sacrifica cuando se trabaja en el extremo inferior de los números de celda. Esto se refleja en la cantidad de interacciones únicas detectadas en comparación con las bibliotecas liCHi-C de mayor número de células y su tasa de deduplicación, que puede alcanzar hasta el 80%. Sin embargo, las bibliotecas liCHi-C de bajo número de células conservan las características topológicas de las bibliotecas de números de células superiores de una manera más focal53, lo que demuestra que es factible realizar bibliotecas liCHi-C que recapitulan el interactoma promotor de la célula con tan solo 50.000 células.

En general, liCHi-C es un método rentable y personalizable para generar bibliotecas de interactoma promotor de alta calidad y alta resolución en tipos de células escasas. Es el primer método de baja entrada para mapear el interactoma promotor y requerir bucles significativos en la resolución del fragmento de restricción. Prevemos que esta nueva herramienta, como su predecesora PCHi-C, proporcionará nuevos conocimientos sobre la diferenciación celular y el desarrollo de organismos, tanto en salud como en enfermedad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al resto de miembros del laboratorio Javierre sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos al Programa CERCA, a la Generalitat de Catalunya y a la Fundación Josep Carreras por el apoyo institucional. Este trabajo ha sido financiado por FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación (RTI2018-094788-A-I00), la Asociación Europea de Hematología (4823998) y la Asociación Española contra el Cáncer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ está financiado por el proyecto Junior Leader de la Fundación Bancaria La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), LR está financiado por una beca AGAUR FI (2019FI-B00017) y LT-D está financiado por una beca FPI (PRE2019-088005). Agradecemos el apoyo del programa de doctorado en bioquímica y biología molecular de la Universitat Autònoma de Barcelona. Ninguno de los financiadores participó en ningún momento en el diseño experimental o la redacción del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

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References

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Genética Número 194
Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas
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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

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