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Genetics

दुर्लभ सेल आबादी में प्रमोटर-केंद्रित स्थानिक-अस्थायी जीनोम आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत वर्कफ़्लो

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

जीन अभिव्यक्ति को डिस्टल नियामक तत्वों के साथ जीन प्रमोटरों की बातचीत द्वारा विनियमित किया जाता है। यहां, हम बताते हैं कि कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) दुर्लभ सेल प्रकारों में इन इंटरैक्शन की पहचान करने की अनुमति देता है, जो पहले मापने योग्य नहीं थे।

Abstract

स्पैटियोटेम्पोरल जीन ट्रांसक्रिप्शन को डिस्टल नियामक तत्वों द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है, जैसे कि एन्हांसर और साइलेंसर, जो प्रतिलेखन को नियंत्रित करने के लिए अपने लक्ष्य जीन प्रमोटरों के साथ भौतिक निकटता पर भरोसा करते हैं। यद्यपि इन नियामक तत्वों की पहचान करना आसान है, उनके लक्ष्य जीन की भविष्यवाणी करना मुश्किल है, क्योंकि उनमें से अधिकांश सेल-प्रकार विशिष्ट हैं और रैखिक जीनोम अनुक्रम में सैकड़ों किलोबेस द्वारा अलग किए जा सकते हैं, अन्य गैर-लक्ष्य जीनों पर छोड़ दिए जा सकते हैं। कई वर्षों से, प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) अपने लक्षित जीन के लिए डिस्टल नियामक तत्वों के जुड़ाव के लिए स्वर्ण मानक रहा है। हालांकि, पीसीएचआई-सी लाखों कोशिकाओं की उपलब्धता पर निर्भर करता है, जो दुर्लभ कोशिका आबादी के अध्ययन को प्रतिबंधित करता है जैसे कि आमतौर पर प्राथमिक ऊतकों से प्राप्त। इस सीमा को दूर करने के लिए, कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी), जीनोम के प्रत्येक जीन को नियंत्रित करने वाले डिस्टल नियामक तत्वों के प्रदर्शनों की पहचान करने के लिए एक लागत प्रभावी और अनुकूलन योग्य विधि विकसित की गई है। LICHI-C PCHI-C के समान प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल ढांचे पर निर्भर करता है, लेकिन न्यूनतम ट्यूब परिवर्तनों को नियोजित करके, अभिकर्मक एकाग्रता और मात्रा को संशोधित करके, और चरणों की अदला-बदली या समाप्त करके, यह पुस्तकालय निर्माण के दौरान न्यूनतम सामग्री हानि के लिए जिम्मेदार है। सामूहिक रूप से, LICHI-C विकासात्मक जीव विज्ञान और सेलुलर फ़ंक्शन के संदर्भ में जीन विनियमन और स्थानिक जीनोम संगठन के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

Introduction

अस्थायी जीन अभिव्यक्ति सेल भेदभाव और अंततः, जीव विकास को चलाती है, और इसका परिवर्तन बीमारियों की एक विस्तृत अधिकता से निकटता से संबंधित है 1,2,3,4,5. जीन प्रतिलेखन को नियामक तत्वों की कार्रवाई द्वारा बारीकी से विनियमित किया जाता है, जिसे समीपस्थ (यानी, जीन प्रमोटर) और डिस्टल (जैसे, एन्हांसर या साइलेंसर) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, जिनमें से उत्तरार्द्ध अक्सर अपने लक्ष्य जीन से दूर स्थित होते हैं और जीन अभिव्यक्ति 6,7,8 को संशोधित करने के लिए क्रोमैटिन लूपिंग के माध्यम से शारीरिक रूप से उनके साथ बातचीत करते हैं।

जीनोम में डिस्टल नियामक क्षेत्रों की पहचान एक ऐसा मामला है जिस पर व्यापक रूप से सहमति व्यक्त की जाती है, क्योंकि इन क्षेत्रों में विशिष्ट हिस्टोन संशोधन9,10,11 होते हैं और इनमें विशिष्ट प्रतिलेखन कारक पहचान रूपांकन होते हैं, जो उनके लिए भर्ती प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य करते हैं। इसके अलावा, एन्हांसर और सुपर-एन्हांसर 15,16 के मामले में, उनके पास कम-न्यूक्लियोसोम अधिभोग 17,18 भी है और उन्हें गैर-कोडिंग ईआरएनए 19,20 में स्थानांतरित किया जाता है।

बहरहाल, प्रत्येक डिस्टल नियामक तत्व के लक्ष्य जीन की भविष्यवाणी करना अधिक कठिन है। अधिक बार नहीं, डिस्टल नियामक तत्वों और उनके लक्ष्यों के बीच बातचीत सेल-प्रकार और उत्तेजना विशिष्ट 21,22 होती है, सैकड़ों किलोबेस तक फैली होती है, किसी भी दिशा में अन्य जीनों पर ब्रिजिंग 23,24,25, और यहां तक कि उनके लक्षित जीन या अन्य गैर-हस्तक्षेप जीन26,27 के इनट्रोनिक क्षेत्रों के अंदर भी स्थित हो सकती है।. इसके अलावा, डिस्टल नियामक तत्व एक ही समय में एक से अधिक जीन को भी नियंत्रित कर सकते हैं, और इसके विपरीत28,29। यह स्थितिगत जटिलता उनके बीच नियामक संघों को इंगित करने में बाधा डालती है, और इसलिए, प्रत्येक सेल प्रकार में प्रत्येक नियामक तत्व के अधिकांश लक्ष्य अज्ञात रहते हैं।

हाल के वर्षों के दौरान, क्रोमैटिन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (3 सी) तकनीकों के विकास में एक महत्वपूर्ण उछाल आया है। उनमें से सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हाय-सी, एक सेल के जीनोम30 के हर टुकड़े के बीच सभी इंटरैक्शन का नक्शा उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, प्रतिबंध खंड स्तर पर महत्वपूर्ण बातचीत का पता लगाने के लिए, हाई-सी अल्ट्रा-डीप अनुक्रमण पर निर्भर करता है, जो व्यक्तिगत जीन के नियामक परिदृश्य का नियमित रूप से अध्ययन करने के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित करता है। इस आर्थिक सीमा को दूर करने के लिए, कई संवर्धन-आधारित 3 सी तकनीकें उभरी हैं, जैसे कि सीएचआईए-पीईटी31, हाइसीएचआईपी 32, और इसके कम-इनपुट समकक्ष हाइक्यूटी33। ये तकनीक एक विशिष्ट प्रोटीन द्वारा मध्यस्थ जीनोम-वाइड इंटरैक्शन के लिए समृद्ध करने के लिए एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करती हैं। बहरहाल, इन 3 सी तकनीकों की अनूठी विशेषता उनके आवेदन का अभिशाप भी है; उपयोगकर्ता रुचि के प्रोटीन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भरोसा करते हैं और उन स्थितियों की तुलना नहीं कर सकते हैं जिनमें प्रोटीन का बंधन गतिशील है।

प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) एक और संवर्धन-आधारित 3 सी तकनीक है जो इन सीमाओंको दरकिनार करती है। बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच संवर्धन प्रणाली को नियोजित करके, पीसीएचआई-सी 28,650 मानव- या 27,595 माउस-एनोटेटेड जीन प्रमोटरों के साथ बातचीत करने वाले जीनोमिक क्षेत्रों के जीनोम-व्यापी उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुस्तकालयों को उत्पन्न करने में सक्षम है, जिसे प्रमोटर इंटरएक्टोम के रूप में भी जाना जाता है। यह दृष्टिकोण सक्रिय और निष्क्रिय प्रमोटरों दोनों के प्रतिबंध टुकड़ा स्तर संकल्प पर महत्वपूर्ण लंबी दूरी की बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है, और हिस्टोन संशोधनों या प्रोटीन बाइंडिंग की गतिशीलता से स्वतंत्र रूप से किसी भी स्थिति के बीच प्रमोटर इंटरैक्शन की तुलना करता है। पीसीएचआई-सी का हाल के वर्षों में व्यापक रूप से सेल भेदभाव 36,37 के दौरान प्रमोटर इंटरएक्टोम पुनर्गठन की पहचान करने, प्रतिलेखन कारकों38,39 की कार्रवाई के तंत्र की पहचान करने और गैर-कोडिंग वेरिएंट 40,41,42,43,44,45 द्वारा रोग में विनियमित नए संभावित जीन और मार्गों की खोज करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।46,47,48, नए ड्राइवर गैर-कोडिंग उत्परिवर्तन49,50 के साथ। इसके अलावा, केवल कैप्चर सिस्टम को संशोधित करके, इस तकनीक को किसी भी इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए जैविक प्रश्न के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एन्हांसर इंटरएक्टोम 51 या गैर-कोडिंग परिवर्तनों के संग्रह का इंटरैक्शन41,52)।

हालांकि, पीसीएचआई-सी तकनीक करने के लिए न्यूनतम 20 मिलियन कोशिकाओं पर निर्भर करता है, जो दुर्लभ कोशिका आबादी के अध्ययन को रोकता है जैसे कि अक्सर विकासात्मक जीव विज्ञान और नैदानिक अनुप्रयोगों में उपयोग किया जाता है। इस कारण से, हमने कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) विकसित किया है, जो पीसीएचआई-सी के प्रयोगात्मक ढांचे के आधार पर एक नई लागत प्रभावी और अनुकूलन योग्य विधि है जो कम-सेल इनपुट के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर इंटरैक्शन उत्पन्न करती है। न्यूनतम ट्यूब परिवर्तनों के साथ प्रयोग करके, मूल पीसीएचआई-सी प्रोटोकॉल से चरणों की अदला-बदली या समाप्त करके, प्रतिक्रिया मात्रा को काफी कम करके, और अभिकर्मक सांद्रता को संशोधित करके, पुस्तकालय जटिलता को अधिकतम किया जाता है और 50,000कोशिकाओं के साथ उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों को उत्पन्न करना संभव है।

कम इनपुट कैप्चर हाई-सी (एलआईसीएचआई-सी) को पीसीएचआई-सी के खिलाफ बेंचमार्क किया गया है और इसका उपयोग मानव हेमटोपोइएटिक सेल भेदभाव के दौरान प्रमोटर इंटरएक्टोम रीवायरिंग को स्पष्ट करने, संभावित नए रोग से जुड़े जीन और गैर-कोडिंग परिवर्तनों द्वारा विनियमित मार्गों की खोज करने और क्रोमोसोमल असामान्यताओं का पता लगाने के लिए किया जाताहै। चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल और तकनीक के माध्यम से विभिन्न गुणवत्ता नियंत्रण यहां पुस्तकालयों की अंतिम पीढ़ी और उनके कम्प्यूटेशनल विश्लेषण तक विस्तृत हैं।

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Protocol

न्यूनतम सामग्री हानि सुनिश्चित करने के लिए, (1) डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूबों और युक्तियों के साथ काम करें ( सामग्री की तालिका देखें), (2) नमूने के अंदर टिप पेश करने के बजाय ट्यूब की दीवार पर अभिकर्मकों को रखें और (3) यदि संभव हो, तो नमूने को ऊपर और नीचे पाइप करने के बजाय उलटा करके नमूना मिलाएं, और बाद में नमूना को पुनर्प्राप्त करने के लिए नीचे घुमाएं।

1. सेल निर्धारण

  1. निलंबन में बढ़ रही कोशिकाएं
    1. 50,000 से एक मिलियन कोशिकाओं की कटाई करें और उन्हें डीएनए कम-बाध्यकारी 1.5 एमएल ट्यूब में रखें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत हैं।
    2. एक निश्चित-कोण रोटर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 600 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पाइपिंग द्वारा सुपरनैटेंट को हटा दें।
    3. कमरे के तापमान पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक आरपीएमआई 1640 के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    4. 2% की एकाग्रता तक पहुंचने और मिश्रण करने के लिए मेथनॉल-मुक्त 16% फॉर्मलाडेहाइड के 143 μL जोड़ें।
    5. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर घूमते हुए 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 10 मिनट के इनक्यूबेशन के साथ जितना संभव हो उतना सटीक होने की कोशिश करें। कोशिकाओं के अधिक या कम निर्धारण से पुस्तकालय की गुणवत्ता में कमी हो सकती है।
    6. 164 μL बर्फ-ठंडा 1 M ग्लाइसिन डालकर प्रतिक्रिया को बुझाएं और मिलाएं। कमरे के तापमान पर घूमते हुए कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. इसके अलावा बर्फ पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, हर ~ 5 मिनट में व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें।
    8. एक निश्चित-कोण रोटर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 1,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
    9. 1 एमएल बर्फ-ठंडा 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में गोली को फिर से निलंबित करके कोशिकाओं को धोएं।
    10. 1,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
      नोट: पेलेट कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ में फ्लैश-जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. अनुगामी कोशिकाएँ
    1. 1x PBS के साथ कल्चर डिश में कोशिकाओं को धोएं।
    2. कल्चर डिश को कवर करने के लिए कमरे के तापमान पर 10% एफबीएस और मेथनॉल-मुक्त 2% फॉर्मलाडेहाइड के साथ पूरक पर्याप्त आरपीएमआई 1640 तैयार करें।
    3. कोशिकाओं के साथ कल्चर डिश में पूरक मीडिया जोड़ें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर रॉकिंग करते हुए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: 10 मिनट के इनक्यूबेशन के साथ जितना संभव हो उतना सटीक होने की कोशिश करें। कोशिकाओं के अधिक या कम निर्धारण से पुस्तकालय की गुणवत्ता में कमी हो सकती है।
    4. 0.125 मीटर तक 1 एम ग्लाइसिन जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं और रॉकिंग करके मिलाएं।
    5. कमरे के तापमान पर रॉकिंग करते हुए 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. इसके अलावा 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, हर 3-4 मिनट में रॉकिंग करके मिश्रण करें।
    7. मीडिया को हटा दें और कोशिकाओं को ठंडे 1x पीबीएस से धो लें।
    8. कोशिकाओं को खुरचें और उन्हें 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें। कल्चर डिश को 0.5-1 एमएल ठंडे 1x पीबीएस के साथ साफ करें।
    9. एक निश्चित-कोण रोटर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 1,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। पेलेट कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ में फ्लैश-जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. लाइसिस और पाचन

  1. कोशिका झिल्ली को बाधित करने के लिए 1 मिलीलीटर ठंडे लाइसिस बफर (तालिका 1) में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। अकेले बफर का जोड़ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन यदि आवश्यक हो तो उन्हें प्रकाश भंवर द्वारा फिर से निलंबित किया जा सकता है।
  2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, हर ~ 5 मिनट में व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें। 1,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 10 मिनट के लिए नाभिक को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 500 μL ठंडे 1.25x प्रतिबंध बफर 2 के साथ नाभिक को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. 1,000 x g (4 डिग्री सेल्सियस पर) पर 10 मिनट के लिए नाभिक को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 1.25x प्रतिबंध बफर 2 के 179 μL में नाभिक को पुन: निलंबित करें।
  4. 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस; सामग्री की तालिका देखें) के 5.5 μL जोड़ें और मिलाएं। कोशिकाएं झुरमुट बना सकती हैं; यह सामान्य है और इसे भंवर द्वारा यथासंभव अलग-अलग करने की आवश्यकता है। 950 आरपीएम पर हिलाने के साथ, थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  5. 10% ट्राइटन एक्स -100 के 37.5 μL जोड़कर SDS बुझाएं और मिलाएं। 950 आरपीएम पर हिलाने के साथ, थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  6. 7.5 μL हिंदIII (100 U/μL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर क्रोमैटिन को पचाएं और मिलाएं। 950 आरपीएम पर हिलाने के साथ, थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने को इनक्यूबेट करें।
  7. अगली सुबह, हिंदIII (100 यू / μL) का एक अतिरिक्त 2.5 μL जोड़ें और उचित क्रोमैटिन पाचन सुनिश्चित करने के लिए 950 आरपीएम पर हिलाने के साथ थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    ध्यान दें: पाचन दक्षता नियंत्रण के हिस्से के रूप में (चरण 5.1 देखें), 20,000 से 40,000 नाभिक के बराबर को किसी अन्य ट्यूब में स्थानांतरित करें ताकि बिना पचे हुए नियंत्रण का प्रतिनिधित्व किया जा सके। पाचन के बाद, पचे हुए नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करने के लिए फिर से उसी संख्या में कोशिकाओं को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि प्रारंभिक सामग्री की उपलब्धता दुर्लभ है तो एक अलग प्रयोग के रूप में पाचन दक्षता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।

3. लिगेशन और डीक्रॉसलिंकिंग

  1. बर्फ पर नमूना ठंडा करें। एक मास्टरमिक्स तैयार करें और प्रतिबंध खंड ओवरहैंग को भरने और बायोटिनाइलेट करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 10x प्रतिबंध बफर 2 का 3 μL, न्यूक्लियस-मुक्त पानी का 1 μL, 10 mM dCTP का 0.75 μL, 10 mM dTTP का 0.75 μL, 10 mM dGTP का 0.75 μL, 0.4 mM बायोटिन-14-dATP का 18.75 μL, और 5 u/μL सामग्री की तालिका देखें। नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, हर ~ 15 मिनट में व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें।
  2. बर्फ पर नमूना ठंडा करें। एक मास्टरमिक्स तैयार करें और भरे हुए डीएनए सिरों को अलग करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 10x लिगेशन बफर का 50 μL, 20 mg/mL बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (BSA) का 2.5 μL, 1 U/μL T4 DNA लिगेज का 12.5 μL, और 173 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. नमूने को 16 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, हर ~ 1 घंटे में व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण करें। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन के 30 μL जोड़कर क्रोमैटिन को डीक्रॉसलिंक करें और मिलाएं। नमूने को 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. अगली सुबह, 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के का एक अतिरिक्त 15 μL जोड़ें और उचित क्रोमैटिन डीक्रॉसलिंकिंग सुनिश्चित करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।

4. डीएनए शुद्धिकरण

  1. नमूने को कमरे के तापमान पर ठंडा करें और इसे फिनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण के लिए एक उपयुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. डीएनए को शुद्ध करने और जोर से हिलाकर मिश्रण करने के लिए फिनोल: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल (25: 24: 1) की 1 मात्रा (545 μL) जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर 12,000 x g पर 5 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और ऊपरी जलीय चरण (545 μL) को 2 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. डीएनए को अवक्षेपित करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 100% इथेनॉल का 1,362.5 μL -20 °C तक ठंडा हो जाता है, 3 M सोडियम एसीटेट (pH 5.2) का 54.5 μL, और 15 mg/mL ग्लाइकोजन का 2 μL एक कोप्रेसिपेटेंट के रूप में।
  5. -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए या -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000-21,000 x g पर 30 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। डीएनए गोली दिखाई देनी चाहिए।
  7. कमरे के तापमान पर 16,000-21,000 x g पर 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, भंवर, और सेंट्रीफ्यूजिंग के 1 मिलीलीटर जोड़कर गोली को धोएं।
  8. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को हवा में सूखने दें। न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 130 μL में डीएनए गोली को पुन: निलंबित करें।
  9. फ्लोरोमेट्रिक परिमाणीकरण द्वारा एकाग्रता का आकलन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले कई महीनों के लिए शुद्ध 3 सी सामग्री को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. वैकल्पिक गुणवत्ता नियंत्रण

  1. पाचन क्षमता का आकलन करें। डीक्रॉसलिंकिंग और फिनोल: क्लोरोफॉर्म डीएनए शुद्धि, जैसा कि पहले वर्णित है, चरण 2.13 में प्राप्त अनपचे और पचे हुए नियंत्रणों के लिए। न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 10 μL में डीएनए गोली को फिर से निलंबित करें। सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें और प्राप्त डीएनए को पतला करें, यदि आवश्यक हो, तो 4 ng / μL तक।
  2. बिना पचे और पचे हुए दोनों नियंत्रणों के 4 एनजी डीएनए के साथ मात्रात्मक पीसीआर करें, जिसमें प्राइमर हिंद III लक्ष्य के साथ और बिना एक खुले क्रोमैटिन लोकस को फैलाते हैं (प्राइमर डिजाइन के लिए तालिका 2 देखें)। पहले प्रकाशित रिपोर्ट35 के बाद पाचन की दक्षता की गणना करें।
    नोट: बंधाव की दक्षता की गणना सूत्र का उपयोग करके प्रतिशत के रूप में की जाती है: पाचन (%) = 100 -100/(2^[(हिंदIII के साथ पचने वाला सीटी - हिंद III के बिना पचा हुआ) - (हिंद III के बिना सीटी अनडाइजेस्ट) - बिना हिंद III के सीटी अनडाइजेस्ट)] (तालिका 3 देखें), जो बिना पचे हुए और पचे हुए नियंत्रणों में प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए प्राप्त अलग-अलग सीटी के अंतर को ध्यान में रखता है।
  3. पारंपरिक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) (0.2 एमएम डीएनटीपी, 0.4 μm दोनों F + R प्राइमर, 0.1 और U/μL हॉट स्टार्ट पोलीमरेज़) करके इंटरैक्शन डिटेक्शन की संवेदनशीलता का आकलन करें, जिसमें प्राइमर लंबी और छोटी दूरी के सेल-अपरिवर्तनीय इंटरैक्शन दोनों में फैले हुए हैं (प्राइमर डिज़ाइन के लिए तालिका 2 देखें)। 3 सी सामग्री के 50-100 एनजी का उपयोग करें (क्रमशः छोटी और लंबी दूरी की बातचीत के लिए) और निम्नलिखित शर्तों का उपयोग करके बढ़ाएं: 15 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 37 चक्र, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस से समाप्त करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: यदि प्राप्त डीएनए की मात्रा 2 μg से कम है, तो पूरे इंटरैक्शन पैनल के बजाय केवल एक लंबी और छोटी दूरी की बातचीत की जांच करें।
  4. 1.6% एगारोस जेल का उपयोग करके 1x tris-borate-EDTA (TBE) पर उत्पाद चलाएं और संबंधित पीसीआर एम्प्लिकॉन54 की उपस्थिति देखें।
    नोट: जीनोम के अप्रत्याशित "कटिंग-एंड-पेस्टिंग" के कारण, अस्पष्ट बैंड दिखाई दे सकते हैं। जब तक सही बैंड आकार देखा जाता है, तब तक इसे सही के रूप में गिना जाता है।
  5. हिंद-III, NHEI ( सामग्री की तालिका देखें), दोनों एंजाइमों या कोई नहीं (पानी) के साथ एक छोटी दूरी के पीसीआर उत्पाद को अलग-अलग पचाकर और 1x TBE 1.6% Agarose जेल पर उत्पाद चलाकर बायोटिन फिल-इन और लिगेशन की दक्षता का आकलन करें। एक सही फिल-इन और लिगेशन पिछले हिंद III लक्ष्य को समाप्त करता है और एक नया एनएचईआई लक्ष्य बनाता है, इसलिए एम्पलीकॉन को केवल एनएचईआई की उपस्थिति में काटा जाना चाहिए।
    नोट: सामग्री के नुकसान को कम करने के लिए, इंटरैक्शन कंट्रोल से शॉर्ट-रेंज पीसीआर उत्पाद के 2.5 μL को पुनः प्राप्त करें और फिल-इन और लिगेशन नियंत्रण करने के लिए इसे पांच बार पुन: बढ़ाएं।

6. सोनिकेशन

  1. नमूने के 130 μL (न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ टॉप अप करें यदि कुछ नियंत्रण के लिए उपयोग किया गया था) को सोनिकेशन के लिए उपयुक्त क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
  2. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके एक जल स्नान सोनिकेटर और सोनिकेट स्थापित करें ( सामग्री की तालिका में वर्णित मॉडल और क्यूवेट के लिए अनुकूलित): ड्यूटी फैक्टर: 20%; पीक घटना शक्ति: 50; प्रति विस्फोट चक्र: 200; समय: 65 सेकंड; और तापमान सीमा: 6-10 डिग्री सेल्सियस (8 डिग्री सेल्सियस इष्टतम)।
  3. नमूने को एक नए 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।

7. अंत-मरम्मत

  1. एक मास्टरमिक्स तैयार करें और सोनिकेशन के दौरान बनाए गए डीएनए टुकड़ों के असमान सिरों की मरम्मत के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 10x लिगेशन बफर का 18 μL, प्रत्येक 2.5 mM dNTP मिश्रण का 18 μL, 3 U/μL T4 DNA पोलीमरेज़ का 6.5 μL, 10 U/μL T4 PNK का 6.5 μL, और 5 U/μL क्लेनो का 1.3 μL ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नमूने को 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और ट्रिस-लो ईडीटीए (टीएलई) बफर ( तालिका 1 देखें) से 300 μL तक टॉप अप करें।

8. बायोटिन पुल-डाउन

  1. प्रति नमूने 150 μL C1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों ( सामग्री की तालिका देखें) को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब चुंबक पर रखें, और 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं। मोतियों को पीछे छोड़ते हुए सुपरनैटेंट को हटा दें।
  2. मोतियों को 1x ट्वीन बफर (टीबी; तालिका 1 देखें) के 400 μL के साथ धोएं। मोतियों को धोने के लिए, बफर जोड़ें और उन्हें नरम भंवर द्वारा फिर से निलंबित करें। ट्यूब को चुंबक में वापस रखें और 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं। मोतियों को पीछे छोड़ते हुए सुपरनैटेंट को हटा दें।
  3. मोतियों को 300 μL 1x नो ट्वीन बफर (NTB; तालिका 1 देखें) से धोएं। 2x NTB के 300 μL में मोतियों को पुन: निलंबित करें ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: डिटर्जेंट के बिना बफर से धोने पर मोती ट्यूब की दीवार के चारों ओर एक धूल भरी परत बना सकते हैं। यह सामान्य है और प्रोटोकॉल के परिणाम को प्रभावित नहीं करता है।
  4. नमूने के 300 μL के साथ 2x NTB में इस 300 μL मोतियों को मिलाएं। बायोटिन के साथ सूचनात्मक डीएनए टुकड़ों को नीचे खींचने के लिए कमरे के तापमान पर घूमते हुए 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पुस्तकालय अब सी 1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों से चिपक गया है।
  5. 1x NTB के 400 μL के साथ मोतियों को धो लें। मोतियों को 100 μL TLE बफर के साथ धोएं और बाद में उन्हें TLE बफर के 35.7 μL में फिर से निलंबित करें।

9. डीएटीपी-टेलिंग, एडाप्टर लिगेशन और पीसीआर प्रवर्धन।

  1. एक मास्टरमिक्स तैयार करें और मरम्मत किए गए डीएनए टुकड़ों के सिरों को डीएटीपी-टेल करने के लिए नमूने में निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 10x प्रतिबंध बफर 2 का 5 μL, 10 mM dATP का 2.3 μL, और 5 U / μL क्लेनो एक्सो-का 7 μL। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  2. क्लेनो एक्सो को निष्क्रिय करें- 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को आगे बढ़ाकर। बर्फ पर नमूना ठंडा करें। मोतियों को 1x TB के 300 μL के साथ धो लें। 1x NTB के 300 μL के साथ मोतियों को धो लें।
  3. मोतियों को 100 μL 1x लिगेशन बफर के साथ धोएं और बाद में उन्हें 1x लिगेशन बफर के 50 μL में फिर से निलंबित करें। नमूने में 15 μM पूर्व-एनाल्ड एडाप्टर मिश्रण के 4 μL ( तालिका 2 देखें) और 2,000 U/μL T4 DNA लिगेज ( सामग्री की तालिका देखें) का 1 μL जोड़ें।
  4. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। मोतियों को 1x TB के 400 μL के साथ धो लें। 1x NTB के 200 μL के साथ मोतियों को धो लें। 1x प्रतिबंध बफर 2 के 100 μl के साथ मोतियों को धो लें।
  5. मोतियों को 1x प्रतिबंध बफर 2 के 50 μL के साथ धोएं और बाद में उन्हें 1x प्रतिबंध बफर 2 के 50 μL में फिर से निलंबित करें।
  6. लाइब्रेरी को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाएं: पुस्तकालय के साथ 50 μL मोती, एंजाइम के साथ 2x PCR मास्टरमिक्स का 250 μL, F + R प्राइमरों का 12 μL (25 μM प्रत्येक; तालिका 2 देखें), और 188 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी।
  7. निम्नलिखित स्थितियों के साथ पीसीआर करें (पीसीआर अभिकर्मक मिश्रण को 50 μL प्रतिक्रियाओं में विभाजित करें): 40 s के लिए 98 °C, इसके बाद 10 s के लिए 98 °C के X चक्र, 30 s के लिए 65 °C, 30 s के लिए 72 °C, और 10 मिनट के लिए 72 °C से समाप्त करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
    नोट: लाइब्रेरी कैप्चर से पहले 500-1,000 एनजी आउटपुट के उद्देश्य से द्विगुणित कोशिकाओं में प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में चक्रों की निम्नलिखित संख्या का उपयोग करें: आठ चक्रों के लिए एक मिलियन कोशिकाएं; 10 चक्रों के लिए 250,000 कोशिकाएं; 12 चक्रों के लिए 50,000 कोशिकाएं।
  8. एक ही नमूने से सभी 50 μL प्रतिक्रियाओं को 1.5 मिलीलीटर डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में पूल करें, इसे 1.5 एमएल ट्यूब चुंबक पर रखें, और 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं।
  9. लाइब्रेरी (500 μL) वाले सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 mL डीएनए कम-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि कुछ सतह पर तैरनेवाला खो गया था तो 500 μL तक TLE बफर के साथ टॉप अप करें। सी 1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की अब आवश्यकता नहीं है।
  10. पैरामैग्नेटिक बीड शुद्धिकरण (0.4-1 वॉल्यूम) का उपयोग करके डबल-साइडेड चयन55 करें। यह पॉलीथीन ग्लाइकोल और पैरामैग्नेटिक मोतियों के नमक की एकाग्रता के आधार पर बहुत बड़े (>1,000 बीपी) और बहुत छोटे टुकड़े या पीसीआर प्राइमर (<200 बीपी) के चयनात्मक उन्मूलन की अनुमति देता है।
  11. लाइब्रेरी में स्टॉक मोतियों के 200 μL (0.4 वॉल्यूम) जोड़ें और भंवर द्वारा मिलाएं। कमरे के तापमान पर घूमते हुए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. एक चुंबक पर रखें, 2-3 मिनट प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं, और पुस्तकालय (बड़े टुकड़ों के बिना) वाले सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  13. मोतियों को 750 μL स्टॉक मोती लेकर केंद्रित करें, उन्हें एक चुंबक पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें, 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं, सतह पर तैरने वाला को हटा दें, और 300 μL नए स्टॉक मोतियों में भंवर करके मोतियों को फिर से निलंबित करें।
  14. नमूने (1 मात्रा) में इस 300 μL केंद्रित मोतियों जोड़ें और भंवर द्वारा मिलाएं। कमरे के तापमान पर घूमते हुए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक चुंबक पर रखें, 2-3 मिनट प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं, और सतह पर तैरने वाला (छोटे टुकड़े और पीसीआर प्राइमर युक्त) को हटा दें।
  15. मोतियों को 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। ऐसा करने के लिए, इथेनॉल जोड़ें, जबकि मोतियों के साथ ट्यूब अभी भी चुंबक पर है, मोतियों को परेशान नहीं करने की कोशिश कर रहा है, और 30-60 सेकंड तक प्रतीक्षा करें। बाद में, मोतियों को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  16. मोतियों को हवा में सूखने दें और उन्हें भंवर द्वारा 21 μL TLE बफर में फिर से निलंबित करें।
    नोट: मोतियों के अत्यधिक सूखने से डीएनए को सलाम करते समय उपज कम हो सकती है। इथेनॉल से "चमकदार" नहीं होने के तुरंत बाद उन्हें टीईएल बफर में फिर से निलंबित करने का लक्ष्य रखें।
  17. मोतियों से पुस्तकालय को निकालने के लिए थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। ट्यूब को एक चुंबक में रखें और पुस्तकालय वाले सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  18. स्वचालित वैद्युतकणसंचलन द्वारा आकार और एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले शुद्ध हाई-सी सामग्री को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

10. पुस्तकालय कैप्चर

  1. पुस्तकालय के 500-1,000 एनजी के साथ काम करें। वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके डीएनए को सुखाकर और न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 3.4 μL में सामग्री को निलंबित करके पुस्तकालय को केंद्रित करें।
  2. लक्ष्य संवर्धन किट ( सामग्री की तालिका देखें) से नमूने में निम्नलिखित ब्लॉकर्स जोड़ें: ब्लॉकर 1 का 2.5 μL, ब्लॉकर 2 का 2.5 μL, और एडेप्टर के लिए कस्टम ऑलिगो ब्लॉकर का 0.6 μL।
  3. अच्छी तरह से निलंबित करें, घोल को 0.2 एमएल पीसीआर स्ट्रिप में स्थानांतरित करें, और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें, इसके बाद गर्म ढक्कन के साथ 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट करें। ट्यूब को 65 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  4. प्रति नमूना (13 μL) लक्ष्य संवर्धन किट ( सामग्री की तालिका देखें) से निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाकर संकरण समाधान तैयार करें। कमरे के तापमान पर बेंच पर रखें: हाइब 1 के 6.63 μL, Hyb 2 के 0.27 μL, Hyb 3 के 2.65 μL, और Hyb 4 के 3.45 μL।
  5. प्रति नमूना 1.5 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ लक्ष्य संवर्धन किट से RNase ब्लॉक के 0.5 μL को पतला करें। बर्फ पर प्रति नमूने बायोटिनीलेटेड आरएनए के 5 μL को पिघलाएं और इसमें पतला RNase ब्लॉक के 2 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर बेंच पर रखें।
  6. संकरण समाधान के 13 μL को RNase के साथ बायोटिनीलेटेड आरएनए के 7 μL में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  7. 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइकलर पर रहते हुए, बायोटिनीलेटेड आरएनए (20 μL) के साथ संकरण समाधान को अवरुद्ध पुस्तकालय में स्थानांतरित करें। ट्यूब ढक्कन को मजबूती से बंद करें और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थर्मोसाइकलर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक ही समय में कई नमूने लेते समय नमूना वाष्पीकरण (जो उप-आरएनए-डीएनए संकरण का कारण बन सकता है) को कम करने के लिए, एक ही समय में प्रत्येक पुस्तकालय में बायोटिनीलेटेड आरएनए को स्थानांतरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।

11. बायोटिन पुल-डाउन और पीसीआर प्रवर्धन

  1. प्रति नमूने टी 1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के 50 μL को 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें, उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब चुंबक पर रखें, और 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं। मोतियों को पीछे छोड़ते हुए सुपरनैटेंट को हटा दें। लक्ष्य संवर्धन किट से बाइंडिंग बफर के 200 μL के साथ मोतियों को तीन बार धोएं।
  2. बाइंडिंग बफर के 200 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें। 65 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइकलर पर रहते हुए, नमूने को पुन: निलंबित टी 1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर घूमते हुए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. लक्ष्य संवर्धन किट से 200 μL वॉश बफर 1 के साथ मोतियों को धो लें। कमरे के तापमान पर घूमते हुए 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। लक्ष्य संवर्धन किट से 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए 200 μL वॉश बफर 2 के साथ मोतियों को तीन बार धोएं। एक थर्मोब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, धोने के बीच 300 आरपीएम पर हिलाएं।
  4. मोतियों को 1x प्रतिबंध बफर 2 के 200 μL के साथ धोएं और बाद में उन्हें 1x प्रतिबंध बफर 2 के 30 μL में फिर से निलंबित करें।
  5. लाइब्रेरी को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों को मिलाएं: लाइब्रेरी के साथ 30 μL मोती, एंजाइम के साथ 2x PCR मास्टरमिक्स के 150 μL, F + R प्राइमरों के 7.2 μL (25 μM प्रत्येक; तालिका 2 देखें), और 112.8 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी।
  6. निम्नलिखित स्थितियों के साथ पीसीआर निष्पादित करें (पीसीआर अभिकर्मक मिश्रण को 50 μL प्रतिक्रियाओं में विभाजित करें): 40 s के लिए 98 °C, इसके बाद 10 s के लिए 98 °C के चार चक्र, 30 s के लिए 65 °C, 30 s के लिए 72 °C, और 10 मिनट के लिए 72 °C के साथ समाप्त करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  7. एक ही नमूने से सभी 50 μL प्रतिक्रियाओं को 1.5 मिलीलीटर डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में पूल करें, इसे 1.5 एमएल ट्यूब चुंबक पर रखें, और 2-3 मिनट तक प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं।
  8. लाइब्रेरी (300 μL) युक्त सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 एमएल डीएनए कम-बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि कुछ सतह पर तैरनेवाला खो गया था तो 300 μL तक TLE बफर के साथ टॉप अप करें। टी 1 स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों की अब आवश्यकता नहीं है।
  9. पैरामैग्नेटिक मोतियों (0.9 वॉल्यूम; सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके डीएनए शुद्धिकरण करें। नमूने में 270 μL स्टॉक मोती जोड़ें और भंवर द्वारा मिलाएं।
  10. कमरे के तापमान पर घूमते हुए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. एक चुंबक पर रखें, 2-3 मिनट प्रतीक्षा करें या जब तक कि सभी मोती दीवार से चिपक न जाएं, और सतह पर तैरने वाला को हटा दें।
  12. मोतियों को 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं। ऐसा करने के लिए, इथेनॉल जोड़ें, जबकि मोतियों के साथ ट्यूब अभी भी चुंबक पर है, मोतियों को परेशान नहीं करने की कोशिश कर रहा है, और 30-60 सेकंड प्रतीक्षा करें। बाद में, मोतियों को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
  13. मोतियों को हवा में सूखने दें और उन्हें भंवर द्वारा 21 μL TLE बफर में फिर से निलंबित करें।
    नोट: मोतियों के अत्यधिक सूखने से डीएनए को सलाम करते समय उपज कम हो सकती है। इथेनॉल से "चमकदार" नहीं होने के तुरंत बाद उन्हें टीईएल बफर में फिर से निलंबित करने का लक्ष्य रखें।
  14. मोतियों से पुस्तकालय को निकालने के लिए थर्मोब्लॉक में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
  15. ट्यूब को एक चुंबक में रखें और पुस्तकालय वाले सुपरनैटेंट को एक नए 1.5 एमएल डीएनए कम-बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  16. स्वचालित वैद्युतकणसंचलन द्वारा आकार और एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।

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Representative Results

LICHI-C 50,000कोशिकाओं के साथ उच्च-गुणवत्ता और रिज़ॉल्यूशन जीनोम-वाइड प्रमोटर इंटरएक्टोम लाइब्रेरी उत्पन्न करने की संभावना प्रदान करता है। यह प्रतिक्रिया की मात्रा में भारी कमी और प्रोटोकॉल में डीएनए कम-बाध्यकारी प्लास्टिकवेयर के उपयोग के अलावा - मूल प्रोटोकॉल से अनावश्यक कदमों को हटाकर पूरा किया जाता है, जिसमें महत्वपूर्ण सामग्री नुकसान होते हैं। इनमें डीक्रॉसलिंकिंग के बाद फिनोल शुद्धिकरण, बायोटिन हटाने और बाद में फिनोल-क्लोरोफॉर्म शुद्धिकरण और इथेनॉल वर्षा शामिल है। इसके अलावा, हाई-सी लाइब्रेरी तैयारी के चरणों को पुनर्गठित करना (बायोटिन पुलडाउन, ए-टेलिंग, एडेप्टर लिगेशन, पीसीआर प्रवर्धन, और डबल-पक्षीय पैरामैग्नेटिक बीड चयन- पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण के रूप में भी) हमें एक और अनावश्यक डीएनए शुद्धिकरण चरण को हटाने की अनुमति देता है। प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो का अवलोकन चित्रा 1 ए में पाया जा सकता है।

पुस्तकालय की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, पूरे प्रोटोकॉल में कई नियंत्रण किए जाते हैं, जिनमें से पहला जीनोम पाचन दक्षता की गणना है; 80% से अधिक मूल्यों को स्वीकार्य माना जाता है (तालिका 3)। एक अलग प्रयोग में सेल प्रकार की पाचन दक्षता की जांच करने का सुझाव दिया जाता है ताकि एकल एलआईसीएचआई-सी प्रयोग से सामग्री की एक महत्वपूर्ण मात्रा न खोई जा सके। दूसरा, सोनिकेशन और अंत-मरम्मत से पहले, पारंपरिक पीसीआर (चित्रा 1 बी) द्वारा सेल-प्रकार अपरिवर्तनीय क्रोमैटिन इंटरैक्शन को बढ़ाकर इंटरैक्शन डिटेक्शन की संवेदनशीलता की जांच करने की सिफारिश की जाती है। यदि विशिष्ट उत्पाद का पता लगाया जाता है, तो एक तीसरा नियंत्रण किया जाना चाहिए, जो हिंद III और NHEI (चित्रा 1 सी, डी) के साथ पहले से प्राप्त पीसीआर उत्पादों में से एक को अलग-अलग पचाकर बायोटिनाइलेशन और लिगेशन की दक्षता पर ध्यान केंद्रित करता है। जब एक पचे हुए हिंद-III प्रतिबंध साइट को भरते हैं और इसे दूसरे के साथ जोड़ते हैं, तो मूल हिंद III को पुन: उत्पन्न करने के बजाय एक नई एनएचईआई प्रतिबंध साइट उत्पन्न होती है। इसलिए, पीसीआर एम्पलीकॉन का पाचन केवल तभी देखा जाना चाहिए जब एनएचईआई मौजूद हो। अंत में, पूरे कैप्चर से ठीक पहले और बाद में, स्वचालित वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एकाग्रता और आकार वितरण की जांच की जानी चाहिए। प्री-कैप्चर लाइब्रेरी प्रवर्धन का उद्देश्य 500-1,000 एनजी हाई-सी सामग्री प्राप्त करना होना चाहिए, जो आरएनए जांच कैप्चर करने के लिए आवश्यक सटीक राशि है, क्योंकि प्री-और पोस्ट-कैप्चर किए गए पुस्तकालय दोनों के अत्यधिक प्रवर्धन से पीसीआर डुप्लिकेट का उच्च प्रतिशत होता है और परिणामस्वरूप विश्लेषण के दौरान अनुक्रमण का नुकसान होता है। पुस्तकालयों को उन्हीं परिस्थितियों में फिर से प्रवर्धित किया जा सकता है यदि पहले रूढ़िवादी पीसीआर प्रवर्धन के दौरान पर्याप्त सामग्री प्राप्त नहीं होती है। कैप्चर की गई लाइब्रेरी सामग्री की मात्रा अलग-अलग हो सकती है, लेकिन अंगूठे के एक नियम के रूप में, यह कैप्चर से पहले की तुलना में लगभग दस गुना से 20 गुना कम होना चाहिए। पुस्तकालय का आकार वितरण लगभग 450-550 बीपी (चित्रा 2 ए, बी) के आसपास गिरना चाहिए, जो पूर्व और बाद के कैप्चर किए गए पुस्तकालयों के बीच अपरिवर्तनीय है। सामूहिक रूप से, इन नियंत्रणों के सही परिणाम उत्कृष्ट LICHI-C पुस्तकालयों की पीढ़ी सुनिश्चित करते हैं।

तैयार LICHI-C पुस्तकालयों को तब (कम से कम) 100 बीपी युग्मित-अंत अनुक्रम और विश्लेषण किया जाता है। कच्चे अनुक्रमण डेटा53 को कलाकृतियों के मानचित्रण और छानने के लिए हाईकप पाइपलाइन56 का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। आदर्श एचआईकप रिपोर्ट ट्रांस (विभिन्न गुणसूत्रों के बीच) युग्मित-अंत की तुलना में सीआईएस (एक ही गुणसूत्र के अंदर) के वितरण में पांच गुना से दस गुना वृद्धि दिखाती है, जैसा कि इन-न्यूक्लियस लिगेशन हाई-सी57 (चित्रा 3 बी) के अनुसार पहले वर्णित है। पीसीआर डुप्लिकेट को हटाने के बाद 100 मिलियन से अधिक अद्वितीय, वैध पठन का अवलोकन विश्लेषण में निम्नलिखित चरण (चित्रा 3 बी) पर आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त है, जो कैप्चर दक्षता का आकलन करना है। युग्मित-अंत पढ़ता है जिसमें आरएनए जांच संवर्धन प्रणाली द्वारा कैप्चर किए गए प्रतिबंध टुकड़े में उनके किसी भी छोर के नक्शे को छोड़ दिया जाता है, केवल सेल के प्रमोटर इंटरैक्शन का प्रतिनिधित्व करने वाले लोगों को रखा जाता है (यानी, वे पढ़ते हैं जिसमें उनके कम से कम एक छोर एक या अधिक जीन प्रमोटरों वाले प्रतिबंध टुकड़ों में मैप करते हैं [चित्रा 3 सी], आदर्श रूप से 60% से अधिक।

अंत में,58,59 में वर्णित के रूप में CHiCAGO पाइपलाइन के साथ महत्वपूर्ण इंटरैक्शन कहा जाता है। महत्वपूर्ण प्रमोटर इंटरैक्शन के अंतिम सेट के लिए दो या अधिक जैविक प्रतिकृति की आवश्यकता होती है। डेटा की गुणवत्ता को प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करके भी मान्य किया जा सकता है, क्योंकि जैविक प्रतिकृतियों को एक साथ क्लस्टर करना चाहिए और सेल प्रकारों को अलग किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, मानव हेमटोपोइएटिक पेड़ (सामान्य माइलॉयड पूर्वजों, मोनोसाइट्स, मेगाकारियोसाइट्स और एरिथ्रोब्लास्ट्स) से चार अलग-अलग प्राथमिक सेल प्रकारों से लिची-सी डेटासेट का विश्लेषण करके, हम पीसीए में देख सकते हैं कि एलआईसीएचआई-सी पुस्तकालय ों को एक विकासात्मक प्रक्षेपवक्र-प्रतिबिंबित फैशन (चित्रा 3 डी) में क्लस्टर किया जाता है। चार सेल प्रकारों के लिए पता लगाए गए महत्वपूर्ण इंटरैक्शन की बारीकी से जांच से पता चलता है कि सेल विकास के दौरान प्रमोटर इंटरैक्शन सेल-प्रकार विशिष्ट और गतिशील हैं। उदाहरण के लिए, एएचएसपी जीन, एरिथ्रोइड अग्रदूतों में संश्लेषित एक प्रमुख चैपरोन जो हीमोग्लोबिन60,61,62 की सही तह की देखरेख करता है, एरिथ्रोब्लास्ट्स में संभावित सक्रिय नियामक तत्वों (यानी, H3K27ac और H3K4me1 समृद्ध क्षेत्रों) के साथ बातचीत का लाभ दिखाता है, लेकिन अन्य सेल प्रकारों में नहीं (चित्रा 4)। यह दर्शाता है कि LIChi-C विधि दुर्लभ सेल प्रकारों में संभावित नियामक इंटरैक्शन को उजागर कर सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: सोनिकेशन से पहले नमूने का प्रोटोकॉल अवलोकन और गुणवत्ता नियंत्रण । (ए) दिनों से विभाजित लिची-सी प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। बी और नीले हाथ क्रमशः, बायोटिन अणुओं और चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसमें कोई बड़ी अवधि के लिए प्रोटोकॉल को सुरक्षित रूप से रोक सकता है। (बी) 3 सी इंटरैक्शन नियंत्रण के प्रतिनिधि परिणाम। मानव (बाएं) और माउस (दाएं) के लिए दोनों इंटरैक्शन सेट दिखाए गए हैं। उम्मीद करने के लिए बैंड को गहरे नीले रंग में चिह्नित किया गया है, जबकि एक अस्पष्ट बैंड को हल्के नीले रंग में चिह्नित किया गया है। (सी) "डेकर" मानव इंटरैक्शन प्राइमर जोड़ी का उपयोग करके प्रतिनिधि फिल-इन और लिगेशन नियंत्रण। बैंड को केवल लेन 2 और 3 में काटा जाता है, जहां एनएचईआई जोड़ा जाता है। (घ) हिंद-III प्रतिबंध स्थल के भराव और बंधाव के दौरान एक नए एनएचईआई प्रतिबंध स्थल के सृजन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्री-और पोस्ट-कैप्चर पुस्तकालयों से प्रतिनिधि स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रोफाइल। (ए) कैप्चर से ठीक पहले एक पुस्तकालय से स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल। प्राप्त डीएनए की कुल मात्रा 994 एनजी (20 μL में 49.7 ng / μL) है। (बी) एक तैयार लिची-सी लाइब्रेरी से उच्च संवेदनशीलता स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रोफ़ाइल। जितना संभव हो उतना सामग्री संरक्षित करने के लिए नमूना आधा पतला लोड किया जाता है। प्राप्त डीएनए की कुल मात्रा 61.2 एनजी (कमजोर पड़ने के लिए जिम्मेदार 20 μL x2 में 1.53 ng / μL) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पीसीए द्वारा प्रतिनिधि हाइकप पाइपलाइन आउटपुट और नमूना प्रतिकृति क्लस्टरिंग । (ए) प्रतिशत और कुल गणना द्वारा पढ़े गए जोड़े की वैधता का वर्गीकरण। अमान्य पठन जोड़े प्रयोगात्मक विरूपण साक्ष्य प्रकार द्वारा उपवर्गीकृत हैं। (बी) डीडुप्लिकेशन प्रतिशत और इंटरैक्शन प्रकारों का वर्गीकरण। सीआईएस इंटरैक्शन को सीआईएस-क्लोज (10 केबी से कम) और सीआईएस-फार (10 केबी से अधिक) के रूप में उप-वर्गीकृत किया गया है। (ग) अभिग्रहण दक्षता का प्रतिशत। कैप्चर किए गए रीड-जोड़े को आगे उप-वर्गीकृत किया जाता है चाहे एक छोर, दूसरे या दोनों में एक या अधिक प्रमोटर हों। (डी) सामान्य माइलॉयड पूर्वजों (सीएमपी), एरिथ्रोब्लास्ट्स, मेगाकारियोसाइट्स और मोनोसाइट्स से लिची-सी पुस्तकालयों की दोनों प्रतिकृतियों से सीएचआईसीएजीओ के प्रमुख घटक विश्लेषण महत्वपूर्ण इंटरैक्शन स्कोर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मानव प्राथमिक हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में एएचएसपी इंटरैक्शन परिदृश्य। सामान्य माइलॉयड पूर्वजों (सीएमपी), एरिथ्रोब्लास्ट्स (एरी), मेगाकारियोसाइट्स (एमके), और मोनोसाइट्स (मोन) में एएचएसपी प्रमोटर-केंद्रित इंटरैक्शन परिदृश्य का प्रतिनिधि उदाहरण जैसा कि वाशु एपिजीनोम ब्राउज़र63 में देखा गया है। आर्क महत्वपूर्ण बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं। गहरे नीले रंग की छाया एएचएसपी जीन प्रमोटर को दिखाती है, जबकि हल्के नीले रंग के रंग संभावित सक्रिय नियामक तत्वों को ओवरलैप करते हैं जो विशेष रूप से एरिथ्रोब्लास्ट्स में एएचएसपी प्रमोटर के साथ बातचीत करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: बफर संरचना और तैयारी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: पीसीआर प्राइमर और एडाप्टर अनुक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: पाचन दक्षता के लिए गणना का उदाहरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

LICHI-C PCHI-C से एक समान प्रयोगात्मक ढांचे का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर इंटरएक्टोम लाइब्रेरी बनाने की क्षमता प्रदान करता है, लेकिन बहुत कम सेल संख्या के साथ। यह अनावश्यक चरणों को समाप्त करके बहुत प्राप्त किया जाता है, जैसे कि फिनोल शुद्धिकरण और बायोटिन हटाना। शास्त्रीय इन-न्यूक्लियस लिगेशन हाई-सी प्रोटोकॉल57 और इसके बाद की व्युत्पन्न तकनीक पीसीएचआई-सी में, बायोटिन को गैर-लिगेटेड प्रतिबंध टुकड़ों से हटा दिया जाता है ताकि डीएनए टुकड़ों को नीचे खींचने से बचा जा सके जो बाद में असूचनात्मक होते हैं। इस हिस्से को छोड़ने और इसके बाद के डीएनए शुद्धिकरण से वैध पठन (चित्रा 3 ए) के प्रतिशत में महत्वपूर्ण कमी नहीं आती है, जबकि संभावित डीएनए-बर्बाद करने वाले चरणों को काट दिया जाता है, जो डीएनए शुद्धिकरण हैं। सोनिकेशन के बाद हाई-सी लाइब्रेरी की तैयारी का पुनर्गठन शुद्धिकरण चरण के रूप में डबल-पक्षीय चयन का उपयोग करके एक और अनावश्यक शुद्धिकरण को छोड़ने की अनुमति देता है। यह सब न्यूनतम ट्यूब परिवर्तनों को नियोजित करके पूरे प्रोटोकॉल के प्रदर्शन को बढ़ाता है, और प्रतिक्रिया की मात्रा में कमी, अभिकर्मक एकाग्रता में परिवर्तन और डीएनए कम-बाध्यकारी प्लास्टिकवेयर के उपयोग के साथ, वह है जो 50,000 कोशिकाओं का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों की पीढ़ी की अनुमति देता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रारंभिक सेल संख्या, आंशिक रूप से, पुस्तकालय की जटिलता के कारण महत्वपूर्ण इंटरैक्शन की संख्या निर्धारित करती है। यद्यपि 50,000 कोशिकाओं के साथ उत्पन्न पुस्तकालय अधिक जटिल पुस्तकालयों की सेल-प्रकार विशिष्ट और अपरिवर्तनीय टोपोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखते हैं, हमारी सिफारिश है, यदि संभव हो, तो महत्वपूर्ण प्रमोटर इंटरैक्शन की अधिक संख्या को पकड़ने के लिए प्रति जैविक प्रतिकृति 100,000 से अधिक कोशिकाओं का उपयोग करें।

3 सी तकनीकों में पाए गए इंटरैक्शन का रिज़ॉल्यूशन अनिवार्य रूप से उपयोग किए गए प्रतिबंध एंजाइम द्वारा दिया जाता है। यहां, LICHI-C के अनुप्रयोग को हिंदIII का उपयोग करके वर्णित किया गया है, एक 6 बीपी-कटिंग एंजाइम जो 4,096 बीपी का सैद्धांतिक औसत रिज़ॉल्यूशन देता है। 4 बीपी-कटिंग एमबीओआई एंजाइम के लिए हिंदIII प्रतिबंध एंजाइम को बदलने वाले लिची-सी पुस्तकालयों की पीढ़ी को कुल इंटरैक्शन के लगभग दोगुने का पता लगाने वाले उत्कृष्ट परिणाम देने की सूचना दी गई है, हालांकि इंटरैक्शन की औसत रैखिक दूरी को53 की आधी दूरी तक स्थानांतरित करने के साथ।

वास्तविक आरएनए जांच संवर्धन प्रणाली के बारे में, एंटीबॉडी-आधारित पर इस प्रकार के कैप्चर का उपयोग करने के मुख्य लाभों में से एक, जैसे कि HiChIP32 या HiCuT33, दूसरों के बीच, प्रोटीन के बंधन से स्वतंत्र रूप से स्थितियों की तुलना करने की क्षमता है, साथ ही साथ रुचि के प्रोटीन के लिए एक कामकाजी एंटीबॉडी की उपलब्धता पर भरोसा नहीं करना है। इसके अलावा, आरएनए संवर्धन प्रणाली को प्रत्येक अन्वेषक की आवश्यकता के अनुरूप किसी भी विशिष्ट क्षेत्र जीनोम-वाइड को पकड़ने के लिए तैयार किया जा सकता है (डिजाइन पर35,64 में चर्चा की गई है)।

एंटीबॉडी-आधारित कैप्चर विधियों के अलावा, हाल के वर्षों में 3 डी जीनोम आर्किटेक्चर की जांच के लिए कई उत्कृष्ट एकल-कोशिका (जैसे एससीआई-सी 65, डिप-सी 66, या साई-हाई-सी 67) या कम-इनपुट विधियां (जैसे लो-सी 68 या ईज़ी हाई-सी 69) विकसित की गई हैं। हालांकि, ये कम-रिज़ॉल्यूशन के साथ विरल संपर्क मानचित्र उत्पन्न करते हैं जो डिस्टल नियामक तत्वों और लक्ष्य जीन के बीच संपर्कों की पहचान की अनुमति नहीं देते हैं। LiCHi-C एक ऐसी विधि है जो इस सीमा को दूर करने में सक्षम है, दुर्लभ सेल प्रकारों में प्रमोटर केंद्रित जीनोम आर्किटेक्चर का अध्ययन करने की संभावना खोलती है और सेलुलर और विकासात्मक जीव विज्ञान और रोग विकास की हमारी समझ को आगे बढ़ाने का अवसर प्रदान करती है।

इसकी सभी विशेषताओं के बावजूद, LICHI-C सीमाओं से मुक्त नहीं है। सबसे पहले, कच्चे अनुक्रमण डेटा को संसाधित करना तुच्छ नहीं है, और डेटा का विश्लेषण करने और इसके परिणामों की व्याख्या करने के लिए निष्पक्ष कम्प्यूटेशनल कौशल की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, LICHI-C कार्यात्मक और संरचनात्मक इंटरैक्शन के बीच भेदभाव नहीं करता है; यह आवश्यक है कि एलआईसीएचआई-सी डेटा को एपिजेनेटिक डेटा और / या कार्यात्मक विश्लेषण के साथ एकीकृत किया जाए ताकि जीन प्रमोटरों के उनके लक्षित नियामक तत्वों के साथ संभावित कार्यात्मक बातचीत को मान्य किया जा सके। अंत में, सेल संख्याओं के निचले छोर पर काम करते समय पुस्तकालय जटिलता का त्याग किया जाता है। यह उच्च सेल संख्या LiCHi-C पुस्तकालयों की तुलना में पता लगाए गए अद्वितीय इंटरैक्शन की मात्रा और उनके डिडुप्लिकेशन दर पर परिलक्षित होता है, जो 80% तक पहुंच सकता है। हालांकि, कम-सेल संख्या लिची-सी पुस्तकालय उच्च सेल संख्या पुस्तकालयों की टोपोलॉजिकल विशेषताओं को अधिक फोकलतरीके से बनाए रखते हैं, यह दर्शाता है कि लिची-सी पुस्तकालयों का प्रदर्शन करना संभव है जो सेल के प्रमोटर इंटरैक्शन को 50,000 कोशिकाओं के साथ पुन: उत्पन्न करते हैं।

कुल मिलाकर, LiCHi-C दुर्लभ सेल प्रकारों में उच्च-गुणवत्ता और उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर इंटरएक्टोम पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक लागत प्रभावी और अनुकूलन योग्य विधि है। यह प्रमोटर इंटरैक्शन को मैप करने और प्रतिबंध टुकड़ा संकल्प पर महत्वपूर्ण लूप के लिए कॉल करने वाली पहली कम-इनपुट विधि है। हम उम्मीद करते हैं कि यह नया उपकरण, अपने पूर्ववर्ती पीसीएचआई-सी के रूप में, स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में सेल भेदभाव और जीव विकास में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए जेवियर प्रयोगशाला के बाकी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम संस्थागत समर्थन के लिए सीईआरसीए कार्यक्रम, जनरलिट डी कैटालोन्या और जोसेप कैरेरस फाउंडेशन को धन्यवाद देते हैं। स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय (RTI2018-094788-ए-आई00), यूरोपीय हेमेटोलॉजी एसोसिएशन (4823998), और स्पेनिश एसोसिएशन अगेंस्ट कैंसर (एईसीसी) LABAE21981JAVI द्वारा वित्त पोषित किया गया था। बीएमजे को ला कैक्सा बैंकिंग फाउंडेशन जूनियर लीडर प्रोजेक्ट (एलसीएफ/बीक्यू/पीआई19/11690001) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, एलआर को अगौर एफआई फैलोशिप (2019एफआई-बी00017) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, और एलटी-डी को एफपीआई फैलोशिप (PRE2019-088005) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम अपने समर्थन के लिए Universitat Autónoma de बार्सिलोना से जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान पीएचडी कार्यक्रम का धन्यवाद करते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन या पांडुलिपि लेखन में किसी भी बिंदु पर कोई भी फंड शामिल नहीं था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

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References

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जेनेटिक्स अंक 194
दुर्लभ सेल आबादी में प्रमोटर-केंद्रित स्थानिक-अस्थायी जीनोम आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए एक एकीकृत वर्कफ़्लो
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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L.,… More

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

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