Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En integrert arbeidsflyt for å studere promotor-sentriske romlig-temporale genomarkitektur i knappe cellepopulasjoner

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

Genuttrykk reguleres av interaksjoner av genpromotorer med distale regulatoriske elementer. Her beskriver vi hvor lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C) tillater identifisering av disse interaksjonene i sjeldne celletyper, som tidligere ikke var målbare.

Abstract

Spatiotemporal gentranskripsjon er tett regulert av distale regulatoriske elementer, for eksempel forsterkere og lyddempere, som er avhengige av fysisk nærhet med målgenpromotorene for å kontrollere transkripsjon. Selv om disse regulatoriske elementene er enkle å identifisere, er deres målgener vanskelige å forutsi, siden de fleste av dem er celletypespesifikke og kan skilles av hundrevis av kilobaser i den lineære genomsekvensen, og hopper over andre ikke-målgener. I flere år har Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) vært gullstandarden for assosiasjon av distale regulatoriske elementer til deres målgener. Imidlertid er PCHi-C avhengig av tilgjengeligheten av millioner av celler, og forbyr studiet av sjeldne cellepopulasjoner som de som vanligvis oppnås fra primære vev. For å overvinne denne begrensningen har lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C), en kostnadseffektiv og tilpassbar metode for å identifisere repertoaret av distale regulatoriske elementer som styrer hvert gen i genomet, blitt utviklet. liCHi-C er avhengig av et lignende eksperimentelt og beregningsorientert rammeverk som PCHi-C, men ved å bruke minimale rørendringer, modifisere reagenskonsentrasjonen og volumene, og bytte eller eliminere trinn, står det for minimalt materialtap under bibliotekkonstruksjon. Samlet muliggjør liCHi-C studiet av genregulering og spatiotemporal genomorganisasjon i sammenheng med utviklingsbiologi og cellulær funksjon.

Introduction

Temporal genuttrykk driver celledifferensiering og til slutt organismeutvikling, og endringen er nært knyttet til en bred mengde sykdommer 1,2,3,4,5. Gentranskripsjon er fint regulert av virkningen av regulatoriske elementer, som kan klassifiseres som proksimale (dvs. genpromotorer) og distale (f.eks. Forsterkere eller lyddempere), hvorav sistnevnte ofte ligger langt fra deres målgener og fysisk interagerer med dem gjennom kromatinsløyfing for å modulere genuttrykk 6,7,8.

Identifiseringen av distale regulatoriske regioner i genomet er et spørsmål som det er bred enighet om, siden disse regionene har spesifikke histonmodifikasjoner 9,10,11 og inneholder spesifikke transkripsjonsfaktorgjenkjenningsmotiver, som fungerer som rekrutteringsplattformer for dem12,13,14. Dessuten, når det gjelder forsterkere og superforsterkere 15,16, har de også lavt nukleosombelegg 17,18 og transkriberes til ikke-kodende eRNA 19,20.

Ikke desto mindre er hvert distale regulatoriske elements målgener vanskeligere å forutsi. Oftere enn ikke er interaksjoner mellom distale regulatoriske elementer og deres mål celletype og stimulusspesifikke 21,22, spenner over hundrevis av kilobaser, bygger bro over andre gener i hvilken som helst retning 23,24,25, og kan til og med lokaliseres inne i introniske regioner av deres målgen eller andre ikke-intervenerende gener 26,27. Videre kan distale regulatoriske elementer også kontrollere mer enn ett gen samtidig, og omvendt28,29. Denne posisjonelle kompleksiteten hindrer å finne regulatoriske assosiasjoner mellom dem, og derfor forblir de fleste av hvert regulatoriske elements mål i hver celletype ukjente.

I løpet av de siste årene har det vært en betydelig boom i utviklingen av kromosomkonformasjonsfangst (3C) teknikker for å studere kromatininteraksjoner. Den mest brukte av dem, Hi-C, gjør det mulig å generere et kart over alle interaksjonene mellom hvert fragment av en celles genom30. For å oppdage betydelige interaksjoner på restriksjonsfragmentnivået, er Hi-C imidlertid avhengig av ultradyp sekvensering, og forbyr bruken av den til rutinemessig å studere det regulatoriske landskapet til individuelle gener. For å overvinne denne økonomiske begrensningen har flere anrikningsbaserte 3C-teknikker dukket opp, for eksempel ChIA-PET31, HiChIP 32 og dens motstykke HiCuT33 med lav inngang. Disse teknikkene er avhengige av bruk av antistoffer for å berike for genom-brede interaksjoner mediert av et spesifikt protein. Ikke desto mindre er den unike egenskapen til disse 3C-teknikkene også bane for deres anvendelse; Brukere regner med tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet for proteinet av interesse og kan ikke sammenligne forhold der bindingen av proteinet er dynamisk.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) er en annen anrikningsbasert 3C-teknikk som omgår disse begrensningene34,35. Ved å bruke et biotinylert RNA-proberikelsessystem, er PCHi-C i stand til å generere genombrede høyoppløselige biblioteker av genomiske regioner som interagerer med 28 650 human- eller 27 595 musekommenterte genpromotorer, også kjent som promotorinteraktomet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å oppdage signifikante langdistanseinteraksjoner ved restriksjonsfragmentnivåoppløsningen til både aktive og inaktive promotorer, og robust sammenligne promotorinteraktomer mellom enhver tilstand uavhengig av dynamikken til histonmodifikasjoner eller proteinbinding. PCHi-C har blitt mye brukt de siste årene for å identifisere promotorinteraktomreorganiseringer under celledifferensiering 36,37, identifisere virkningsmekanismen til transkripsjonsfaktorer38,39, og oppdage nye potensielle gener og veier deregulert i sykdom av ikke-kodende varianter 40,41,42,43,44,45,46,47,48, sammen med nye driver-ikke-kodende mutasjoner49,50. Dessuten, ved bare å modifisere fangstsystemet, kan denne teknikken tilpasses i henhold til det biologiske spørsmålet for å forhøre ethvert interaktom (f.eks. forsterkerinteraktomet 51 eller interaktomet til en samling ikke-kodende endringer41,52).

Imidlertid er PCHi-C avhengig av minst 20 millioner celler for å utføre teknikken, noe som forhindrer studiet av knappe cellepopulasjoner som de som ofte brukes i utviklingsbiologi og kliniske applikasjoner. Av denne grunn har vi utviklet lav inngang Capture Hi-C (liCHi-C), en ny kostnadseffektiv og tilpassbar metode basert på det eksperimentelle rammeverket til PCHi-C for å generere høyoppløselige promotorinteraktomer med lavcelleinngang. Ved å utføre eksperimentet med minimale rørendringer, bytte eller eliminere trinn fra den opprinnelige PCHi-C-protokollen, drastisk redusere reaksjonsvolumer og modifisere reagenskonsentrasjoner, maksimeres bibliotekets kompleksitet og det er mulig å generere biblioteker av høy kvalitet med så lite som 50 000 celler53.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) har blitt benchmarked mot PCHi-C og brukt til å belyse promotorinteraktomomkobling under human hematopoietisk celledifferensiering, oppdage potensielle nye sykdomsassosierte gener og veier deregulert av ikke-kodende endringer, og oppdage kromosomale abnormiteter53. Den trinnvise protokollen og de forskjellige kvalitetskontrollene gjennom teknikken er detaljert her til den endelige generasjonen av bibliotekene og deres beregningsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For å sikre minimalt materialtap, (1) arbeid med DNA lavbindende rør og spisser (se materialfortegnelse), (2) plasser reagenser på rørveggen i stedet for å introdusere spissen inne i prøven, og (3) bland om mulig prøven ved inversjon i stedet for å pipetere prøven opp og ned, og spinn ned etterpå for å gjenopprette prøven.

1. Cell fiksering

  1. Celler som vokser i suspensjon
    1. Høst 50 000 til en million celler og plasser dem i et DNA lavbindende 1,5 ml rør.
      MERK: Celletypene som brukes for denne studien er detaljert i den representative resultatdelen.
    2. Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 600 x g (ved 4 °C) ved hjelp av en rotorsentrifuge med fast vinkel og fjern supernatanten ved pipettering.
    3. Resuspender cellene i 1 ml RPMI 1640 supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) ved romtemperatur.
    4. Tilsett 143 μL metanolfritt 16% formaldehyd for å nå en konsentrasjon på 2% og bland.
    5. Inkuber cellene i 10 minutter mens du roterer ved romtemperatur for å fikse cellene.
      MERK: Prøv å være så nøyaktig som mulig med 10 min inkubasjon. Over- eller underfiksering av cellene kan føre til en reduksjon i kvaliteten på biblioteket.
    6. Slukk reaksjonen ved å tilsette 164 μL iskaldt 1 M glycin og bland. Inkuber cellene i 5 minutter, roter ved romtemperatur.
    7. Videre inkubere cellene i 15 min på is, bland ved inversjon hver ~ 5 min.
    8. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 1000 x g (ved 4 °C) ved hjelp av en rotorsentrifuge med fast vinkel og fjern supernatanten.
    9. Vask cellene ved å resuspendere pelleten i 1 ml iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
    10. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 1000 x g (ved 4 °C) og fjern supernatanten.
      MERK: De pelleterte cellene kan flashfryses i flytende nitrogen eller tørris og lagres ved -80 °C.
  2. Tilstøtende celler
    1. Vask cellene i dyrkningsfatet med 1x PBS.
    2. Forbered nok RPMI 1640 supplert med 10% FBS og metanolfritt 2% formaldehyd ved romtemperatur for å dekke kulturretten.
    3. Legg det supplerte mediet til kulturfatet med cellene og inkuber i 10 minutter, gyng ved romtemperatur for å fikse cellene.
      MERK: Prøv å være så nøyaktig som mulig med 10 min inkubasjon. Over- eller underfiksering av cellene kan føre til en reduksjon i kvaliteten på biblioteket.
    4. Slukk reaksjonen ved å tilsette 1 M glycin til 0,125 M og bland ved å rocke.
    5. Inkuber cellene i 5 minutter, gyng ved romtemperatur.
    6. Inkuber cellene videre i 15 minutter ved 4 °C, bland ved å vugge hvert 3-4 min.
    7. Fjern mediet og vask cellene med kald 1x PBS.
    8. Skrap cellene og overfør dem til et 1,5 ml DNA lavbindende rør. Tørk kulturfatet rent med 0,5-1 ml kald 1x PBS.
    9. Sentrifuger cellene i 10 minutter ved 1000 x g (ved 4 °C) ved hjelp av en rotorsentrifuge med fast vinkel og fjern supernatanten. De pelleterte cellene kan flashfryses i flytende nitrogen eller tørris og lagres ved -80 °C.

2. Lyse og fordøyelse

  1. Resuspender cellene i 1 ml kald lysisbuffer (tabell 1) for å forstyrre cellemembranen. Tilsetningen av bufferen alene bør være nok til å resuspendere cellene, men de kan resuspenderes ytterligere om nødvendig ved lett virvel.
  2. Inkuber på is i 30 min, bland ved inversjon hver ~ 5 min. Sentrifuger kjernene i 10 minutter ved 1000 x g (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Resuspender kjernene med 500 μL kald 1,25x restriksjonsbuffer 2 (se materialtabell).
  3. Sentrifuger kjernene i 10 minutter ved 1000 x g (ved 4 °C) og fjern supernatanten. Resuspender kjernene i 179 μL med 1,25x restriksjonsbuffer 2.
  4. Tilsett 5,5 μL 10 % natriumdodecylsulfat (SDS; se materialfortegnelse) og bland. Cellene kan danne klumper; Dette er normalt og må disaggregeres så mye som mulig ved vortexing. Inkuber prøven i 1 time ved 37 °C i en termoblokk, med risting ved 950 o / min.
  5. Slukk SDS ved å tilsette 37,5 μL 10% Triton X-100 og bland. Inkuber prøven i 1 time ved 37 °C i en termoblokk, med risting ved 950 o / min.
  6. Fordøy kromatinet ved å tilsette 7,5 μL HindIII (100 U / μL; se materialtabell) og bland. Inkuber prøven over natten ved 37 °C i en termoblokk, med risting ved 950 o / min.
  7. Neste morgen, tilsett en ekstra 2,5 μL HindIII (100 U / μL) og inkuber prøven ytterligere i 1 time ved 37 ° C i en termoblokk, med risting ved 950 o / min for å sikre riktig kromatinfordøyelse.
    MERK: Som en del av fordøyelseseffektivitetskontrollene (se trinn 5.1), overfør tilsvarende 20 000 til 40 000 kjerner til et annet rør for å representere den ufordøyde kontrollen. Etter fordøyelsen, overfør samme antall celler til et annet rør igjen for å representere den fordøyde kontrollen. Det anbefales å teste fordøyelseseffektiviteten som et separat eksperiment hvis tilgjengeligheten av utgangsmaterialet er lite.

3. Ligering og decrosslinking

  1. Avkjøl prøven på is. Forbered en mastermix og tilsett følgende reagenser for å fylle ut og biotylere restriksjonsfragmentoverhengene: 3 μL 10x restriksjonsbuffer 2, 1 μL nukleasefritt vann, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotin-14-dATP og 5 μL 5 U/μL Klenow (se materialfortegnelse). Inkuber prøven i 75 minutter ved 37 °C, bland ved inversjon hver ~15 min.
  2. Avkjøl prøven på is. Forbered en mastermix og tilsett følgende reagenser for å ligere de utfylte DNA-endene: 50 μL 10x ligeringsbuffer, 2,5 μL 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 12,5 μL 1 U/μL T4 DNA-ligase og 173 μL nukleasefritt vann (se materialtabell).
  3. Inkuber prøven i 4-6 timer ved 16 °C, bland ved inversjon hver ~1 time. Videre inkuberer prøven i 30 minutter ved romtemperatur. Kryssbind kromatinet ved å tilsette 30 μL 10 mg / ml Proteinase K og bland. Inkuber prøven over natten ved 65 °C.
  4. Neste morgen tilsettes 15 μL ekstra 10 mg/ml proteinase K og inkuberer prøven ytterligere i 2 timer ved 65 °C for å sikre riktig kromatin-tverrbinding.

4. DNA-rensing

  1. Avkjøl prøven til romtemperatur og overfør den til et egnet rør for fenol-kloroformrensing.
  2. Tilsett 1 volum (545 μL) fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) for å rense DNA og bland ved kraftig risting.
  3. Sentrifuger prøven i 5 minutter ved 12 000 x g ved romtemperatur og overfør den øvre vandige fasen (545 μL) til et 2 ml DNA lavbindingsrør.
  4. Tilsett følgende reagenser for å utfelle DNA: 1 362,5 μL 100 % etanol nedkjølt til -20 °C, 54,5 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2 μL 15 mg/ml glykogen som kopresipitant.
  5. Inkuber i 1 time ved -80 °C eller over natten ved -20 °C.
  6. Sentrifuger prøven i 30 minutter ved 16 000-21 000 x g ved 4 °C og fjern supernatanten. DNA-pelleten må være synlig.
  7. Vask pelleten ved å tilsette 1 ml 70% etanol, vortexing og sentrifuging i 10 min ved 16.000-21.000 x g ved romtemperatur.
  8. Fjern supernatanten og la pelleten lufttørke. Resuspender DNA-pelleten i 130 μL nukleasefritt vann.
  9. Vurder konsentrasjonen ved fluorometrisk kvantifisering (se materialtabell). Oppbevar det rensede 3C-materialet ved -20 °C i flere måneder før du fortsetter med protokollen.

5. Valgfrie kvalitetskontroller

  1. Vurder fordøyelseseffektiviteten. Utfør decrosslinking og fenol: kloroform DNA-rensing, som beskrevet tidligere, til de ufordøyde og fordøyde kontrollene oppnådd i trinn 2.13. Resuspender DNA-pelleten i 10 μL nukleasefritt vann. Kvantifiser konsentrasjonen og fortynn det oppnådde DNA, om nødvendig, til 4 ng / μL.
  2. Utfør kvantitativ PCR med 4 ng DNA av både ufordøyd og fordøyd kontroll, med primere som spenner over et åpent kromatinlokus med og uten et HindIII-mål (se tabell 2 for primerdesign). Beregn effektiviteten av fordøyelsen etter en tidligere publisert rapport35.
    MERK: Ligeringseffektiviteten beregnes som en prosentandel ved hjelp av formelen: fordøyelse (%) = 100 -100/(2^[(Ct fordøyd med HindIII - Ctfordøyd uten HindIII) - (Ct ufordøyd med HindIII - Ct ufordøyd uten HindIII)]) (se tabell 3), som tar hensyn til differensialet til de forskjellige Cts oppnådd for hvert primerpar i de ufordøyde og fordøyde kontrollene.
  3. Vurder sensitiviteten til interaksjonsdeteksjonen ved å utføre konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm både F + R-primere, 0,1 og U / μL varmstartpolymerase), med primere som spenner over både lang- og kortdistanse celleinvariante interaksjoner (se tabell 2 for primerdesign). Bruk 50–100 ng 3C-materiale (for henholdsvis kort- og langdistanseinteraksjoner) og forsterk ved hjelp av følgende betingelser: 98 °C i 15 minutter, etterfulgt av 37 sykluser på 98 °C i 30 s, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 min, og avslutt med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
    MERK: Hvis mengden DNA oppnådd er mindre enn 2 μg, må du bare sjekke en lang- og en kortdistanseinteraksjon i stedet for hele interaksjonspanelet.
  4. Kjør produktet på 1x tris-borat-EDTA (TBE) ved bruk av 1,6% agarosegel og se etter tilstedeværelsen av den tilsvarende PCR-amplikon54.
    MERK: På grunn av den uforutsigbare "klipping og liming" av genomet, kan uspesifikke bånd vises. Så lenge riktig båndstørrelse overholdes, regnes den som riktig.
  5. Vurder effektiviteten av biotinutfylling og ligering ved differensielt å fordøye et kortdistanse PCR-produkt med HindIII, NheI (se materialtabell), begge enzymer eller ingen (vann), og kjøre produktet på en 1x TBE 1,6% agarosegel. En korrekt utfylling og ligering eliminerer det tidligere HindIII-målet og oppretter et nytt NheI-mål, slik at amplikonen bare skal kuttes i nærvær av NheI.
    MERK: For å minimere materialtap, hent 2,5 μL av et kortdistanse PCR-produkt fra interaksjonskontrollene og forsterk det fem ganger for å utføre utfyllings- og ligeringskontrollene.

6. Sonikering

  1. Overfør 130 μL av prøven (fyll opp med nukleasefritt vann hvis noen ble brukt til kontrollene) til en kyvette egnet for sonikering.
  2. Sett opp en vannbad sonikator og sonicate ved hjelp av følgende parametere (optimalisert for modellen og kyvettene beskrevet i materialfortegnelsen): driftsfaktor: 20%; maksimal forekomst effekt: 50; sykluser per serie: 200; Tid: 65 s; og temperaturområde: 6-10 °C (8 °C optimalt).
  3. Overfør prøven til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør.

7. Slutt reparasjon

  1. Forbered en mastermix og tilsett følgende reagenser for å reparere DNA-fragmentets ujevne ender opprettet under sonikeringen: 18 μL 10x ligeringsbuffer, 18 μL 2,5 mM dNTP-blanding hver, 6,5 μL 3 U / μL T4 DNA-polymerase, 6,5 μL av 10 U / μL T4 PNK og 1,3 μL av 5 U / μL Klenow (se materialtabell).
  2. Inkuber prøven i 30 minutter ved 20 °C og fyll på med Tris-lav EDTA (TLE) buffer (se tabell 1) til 300 μL.

8. Nedtrekk av biotin

  1. Overfør 150 μL C1 streptavidinperler (se materialfortegnelse) per prøve til et 1,5 ml rør, plasser dem på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter eller til alle perlene sitter fast på veggen. Fjern supernatanten, og la perlene ligge igjen.
  2. Vask kulene med 400 μL 1x Tween buffer (TB; se tabell 1). For å vaske perlene, legg til bufferen og resuspender dem ved myk vortexing. Plasser røret tilbake i magneten og vent 2-3 min eller til alle perlene sitter fast på veggen. Fjern supernatanten, og la perlene ligge igjen.
  3. Vask kulene med 300 μL 1x ingen mellombuffer (NTB; se tabell 1). Resuspender perlene i 300 μL 2x NTB (se tabell 1).
    MERK: Perlene kan danne et støvete lag rundt rørveggen når du vasker med buffere uten vaskemiddel. Dette er normalt og påvirker ikke utfallet av protokollen.
  4. Kombiner disse 300 μL perlene i 2x NTB med 300 μL av prøven. Inkuber i 15 minutter, roter ved romtemperatur for å trekke ned de informative DNA-fragmentene med biotin. Biblioteket er nå klistret til C1 streptavidin-perlene.
  5. Vask perlene med 400 μL 1x NTB. Vask perlene med 100 μL TLE-buffer og resuspender dem deretter i 35,7 μL TLE-buffer.

9. dATP-tailing, adapterligering og PCR-forsterkning

  1. Forbered en mastermix og tilsett følgende reagenser til prøven for å dATP-hale endene av de reparerte DNA-fragmentene: 5 μL med 10x restriksjonsbuffer 2, 2,3 μL med 10 mM dATP og 7 μL av 5 U / μL Klenow exo-. Inkuber prøven i 30 minutter ved 37 °C.
  2. Inaktiver Klenow exo- ved å inkubere prøven ytterligere i 10 minutter ved 65 °C. Avkjøl prøven på is. Vask perlene med 300 μL 1x TB. Vask perlene med 300 μL 1x NTB.
  3. Vask perlene med 100 μL 1x ligeringsbuffer og resuspender dem deretter i 50 μL 1x ligeringsbuffer. Tilsett 4 μL 15 μM forhåndsglødet adapterblanding (se tabell 2) og 1 μL 2000 U/μL T4 DNA-ligase (se materialfortegnelse) til prøven.
  4. Inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Vask perlene med 400 μL 1x TB. Vask perlene med 200 μL 1x NTB. Vask perlene med 100 μl 1x restriksjonsbuffer 2.
  5. Vask kulene med 50 μL 1x restriksjonsbuffer 2 og resuspender dem deretter i 50 μL med 1x begrensningsbuffer 2.
  6. Bland følgende reagenser for å forberede PCR-reaksjonen for å forsterke biblioteket: 50 μL perler med biblioteket, 250 μL 2x PCR mastermix med enzym, 12 μL F + R primere (25 μM hver; se tabell 2) og 188 μL nukleasefritt vann.
  7. Utfør PCR med følgende betingelser (del PCR-reagensblandingen i 50 μL-reaksjoner): 98 °C i 40 s, etterfulgt av X-sykluser på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, og avslutt med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
    MERK: Bruk følgende antall sykluser som utgangspunkt for å optimalisere protokollen i diploide celler som tar sikte på en 500-1,000 ng utgang før bibliotekopptak: en million celler i åtte sykluser; 250 000 celler i 10 sykluser; 50 000 celler i 12 sykluser.
  8. Samle alle 50 μL-reaksjonene fra samme prøve i et 1,5 ml DNA lavbindingsrør, plasser det på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter eller til alle perlene sitter fast på veggen.
  9. Overfør supernatanten som inneholder biblioteket (500 μL) til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør. Fyll på med TLE-buffer til 500 μL hvis noe av supernatanten gikk tapt. C1 streptavidin-perlene er ikke lenger nødvendige.
  10. Utfør et dobbeltsidig valg55 ved hjelp av paramagnetisk perlerensing (0,4-1 volum). Dette muliggjør selektiv eliminering av for store (>1000 bp) og for små fragmenter eller PCR-primere (<200 bp), avhengig av konsentrasjonen av polyetylenglykol og salt av de paramagnetiske perlene tilsatt.
  11. Tilsett 200 μL (0,4 volumer) lagerperler til biblioteket og bland ved virvel. Inkuber i 10 minutter, roter ved romtemperatur.
  12. Plasser på en magnet, vent 2-3 min eller til alle kulene sitter fast på veggen, og overfør supernatanten som inneholder biblioteket (uten de større fragmentene) til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør.
  13. Konsentrer kulene ved å ta 750 μL lagerperler, plasser dem i et 1,5 ml rør på en magnet, vent i 2-3 minutter eller til alle perlene sitter fast på veggen, fjern supernatanten og resuspender perlene ved å virvle i 300 μL nye lagerperler.
  14. Legg denne 300 μL konsentrerte perler til prøven (1 volum) og bland ved vortexing. Inkuber i 10 minutter, roter ved romtemperatur. Plasser på en magnet, vent 2-3 min eller til alle kulene sitter fast på veggen, og fjern supernatanten (som inneholder de mindre fragmentene og PCR-primerne).
  15. Vask perlene tre ganger med 1 ml 70% etanol. For å gjøre dette, tilsett etanolen mens røret med perlene fortsatt er på magneten, prøv å ikke forstyrre perlene, og vent i 30-60 s. Fjern deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
  16. La kulene lufttørke og resuspendere dem i 21 μL TLE-buffer ved å virvle.
    MERK: Overdreven tørking av perlene kan redusere utbyttet når du eluerer DNA. Ta sikte på å resuspendere dem i TLE-buffer umiddelbart etter at de ikke lenger er "skinnende" fra etanolen.
  17. Inkuber prøven i 10 minutter ved 37 °C i en termoblokk for å eluere biblioteket fra perlene. Plasser røret i en magnet og overfør supernatanten som inneholder biblioteket til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør.
  18. Kvantifiser størrelsen og konsentrasjonen ved automatisert elektroforese (se materialtabell). Renset Hi-C-materiale kan lagres ved -20 °C i flere måneder før protokollen fortsetter.

10. Opptak av bibliotek

  1. Arbeid med 500-1000 ng av biblioteket. Konsentrer biblioteket ved å tørke DNA ved hjelp av en vakuumkonsentrator og resuspendere materialet i 3,4 μl nukleasefritt vann.
  2. Legg til følgende blokkere fra målanrikningssettet (se materialfortegnelse) i prøven: 2,5 μl blokkering 1, 2,5 μl blokkering 2 og 0,6 μl tilpasset oligoblokkering for adapterne.
  3. Resuspender grundig, overfør oppløsningen til en 0,2 ml PCR-stripe, og inkuber i en termosyklist i 5 minutter ved 95 °C, etterfulgt av 5 minutter ved 65 °C med et oppvarmet lokk. La tuben inkubere ved 65 °C.
  4. Forbered hybridiseringsløsningen ved å kombinere følgende reagenser fra målanrikningssettet (se materialtabell) per prøve (13 μL). Oppbevares på benken ved romtemperatur: 6,63 μL Hyb 1, 0,27 μL Hyb 2, 2,65 μL Hyb 3 og 3,45 mikrol Hyb 4.
  5. Fortynn 0,5 μL RNase-blokk fra målanrikningssettet med 1,5 μL nukleasefritt vann per prøve. Tine 5 μL av det biotinylerte RNA per prøve på is og tilsett 2 μL av den fortynnede RNase-blokken. Hold på benken ved romtemperatur.
  6. Tilsett 13 μL av hybridiseringsløsningen til 7 μL av det biotinylerte RNA med RNase og bland godt.
  7. Mens du er på termosyklisten ved 65 ° C, overfør hybridiseringsløsningen med det biotinylerte RNA (20 μL) til det blokkerte biblioteket. Lukk slangelokket godt og rug i termosyklisten over natten ved 65 °C.
    MERK: For å minimere prøvefordampning (som kan føre til suboptimal RNA-DNA-hybridisering) når du utfører flere prøver samtidig, bruk en flerkanals pipette for å overføre det biotinylerte RNA til hvert bibliotek samtidig.

11. Biotin-nedtrekk og PCR-amplifisering

  1. Overfør 50 μL T1 streptavidinperler per prøve til et 1,5 ml DNA lavbindingsrør, plasser dem på en 1,5 ml rørmagnet og vent 2-3 minutter eller til alle perlene sitter fast på veggen. Fjern supernatanten, og la perlene ligge igjen. Vask perlene tre ganger med 200 μL av bindingsbufferen fra målanrikningssettet.
  2. Suspender perlene i 200 μL bindingsbuffer. Mens du er på termosyklisten ved 65 °C, overfør prøven til de resuspenderte T1-streptapavidinperlene og inkuber i 30 minutter og roter ved romtemperatur.
  3. Vask perlene med 200 μL vaskebuffer 1 fra målanrikningssettet. Inkuber i 15 minutter, roter ved romtemperatur. Vask kulene tre ganger med 200 μL vaskebuffer 2 fra målanrikningssettet oppvarmet til 65 °C. Inkuber i 10 minutter ved 65 °C i en termoblokk, rist ved 300 o / min mellom vask.
  4. Vask kulene med 200 μL 1x begrensningsbuffer 2 og resuspender dem deretter i 30 μL 1x begrensningsbuffer 2.
  5. Bland følgende reagenser for å forberede PCR-reaksjonen for å forsterke biblioteket: 30 μL perler med biblioteket, 150 μL 2x PCR mastermix med enzym, 7,2 μL F + R primere (25 μM hver; se tabell 2) og 112,8 μL nukleasefritt vann.
  6. Utfør PCR med følgende betingelser (del PCR-reagensblandingen i 50 μL-reaksjoner): 98 °C i 40 s, etterfulgt av fire sykluser på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, og avslutt med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
  7. Samle alle 50 μL-reaksjonene fra samme prøve i et 1,5 ml DNA lavbindingsrør, plasser det på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter eller til alle perlene sitter fast på veggen.
  8. Overfør supernatanten som inneholder biblioteket (300 μL) til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør. Fyll på med TLE-buffer til 300 μL hvis noe av supernatanten gikk tapt. T1 streptavidin-perlene er ikke lenger nødvendige.
  9. Utfør en DNA-rensing ved hjelp av paramagnetiske perler (0,9 volumer; se materialfortegnelse). Tilsett 270 μL kraftperler i prøven og bland ved virvel.
  10. Inkuber i 10 minutter, roter ved romtemperatur.
  11. Plasser på en magnet, vent 2-3 min eller til alle perlene sitter fast på veggen, og fjern supernatanten.
  12. Vask perlene tre ganger med 1 ml 70% etanol. For å gjøre dette, tilsett etanolen mens røret med perlene fortsatt er på magneten, prøv å ikke forstyrre perlene, og vent 30-60 s. Fjern deretter supernatanten uten å forstyrre perlene.
  13. La kulene lufttørke og resuspendere dem i 21 μL TLE-buffer ved å virvle.
    MERK: Overdreven tørking av perlene kan redusere utbyttet når du eluerer DNA. Ta sikte på å resuspendere dem i TLE-buffer umiddelbart etter at de ikke lenger er "skinnende" fra etanolen.
  14. Inkuber prøven i 10 minutter ved 37 °C i en termoblokk for å eluere biblioteket fra perlene.
  15. Plasser røret i en magnet og overfør supernatanten som inneholder biblioteket til et nytt 1,5 ml DNA lavbindingsrør.
  16. Kvantifiser størrelsen og konsentrasjonen ved automatisert elektroforese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

liCHi-C tilbyr muligheten til å generere høykvalitets og oppløsning genombrede promotor-interaktombiblioteker med så lite som 50.000 celler53. Dette oppnås ved - i tillegg til den drastiske reduksjonen av reaksjonsvolumer og bruk av DNA lavbindende plastikk gjennom hele protokollen - å fjerne unødvendige trinn fra den opprinnelige protokollen, der betydelige materielle tap oppstår. Disse inkluderer fenolrensing etter decrosslinking, fjerning av biotin og påfølgende fenol-kloroformrensing og etanolutfelling. Dessuten kan omorganisering av trinnene i Hi-C-bibliotekforberedelsen (biotin-nedtrekk, A-tailing, adapterligering, PCR-amplifikasjon og dobbeltsidig paramagnetisk perlevalg - også som PCR-produktrensing) tillate oss å fjerne enda et unødvendig DNA-rensingstrinn. En oversikt over den eksperimentelle arbeidsflyten finnes i figur 1A.

For å vurdere bibliotekkvaliteten utføres flere kontroller gjennom hele protokollen, hvorav den første er beregningen av genomfordøyelseseffektiviteten; verdier over 80 % anses som akseptable (tabell 3). Kontroll av fordøyelseseffektiviteten av celletypen i et separat eksperiment foreslås for ikke å miste en betydelig mengde materiale fra et enkelt liCHi-C-eksperiment. For det andre, før sonikering og sluttreparasjon, anbefales det å kontrollere følsomheten til interaksjonsdeteksjon ved å forsterke celletype invariante kromatininteraksjoner ved konvensjonell PCR (figur 1B). Hvis det spesifikke produktet oppdages, bør en tredje kontroll utføres, med fokus på effektiviteten av biotinylering og ligering ved differensielt å fordøye et av de tidligere oppnådde PCR-produktene med HindIII og NheI (figur 1C,D). Når du fyller et fordøyd HindIII-restriksjonssted og stump ende ligerer det med et annet, genereres et nytt NheI-begrensningssted i stedet for å regenerere det opprinnelige HindIII-et. Derfor bør fordøyelsen av PCR-amplikon bare observeres når NheI er tilstede. Til slutt, like før og etter hele fangsten, bør konsentrasjonen og størrelsesfordelingen kontrolleres ved hjelp av automatisert elektroforese. Forsterkning av biblioteket før opptak må ta sikte på å skaffe 500-1000 ng Hi-C-materiale, den nøyaktige mengden som trengs for å utføre RNA-sondefangsten, siden overdreven forsterkning av både det forhånds- og etterfangede biblioteket fører til en høy prosentandel av PCR-duplikater og det påfølgende tapet av sekvenseringsavlesninger under analysen. Biblioteker kan fornyes igjen under de samme forholdene hvis ikke nok materiale er oppnådd under den første konservative PCR-forsterkningen. Mengden etterfanget bibliotekmateriale kan variere, men som en tommelfingerregel bør det være omtrent ti ganger til 20 ganger mindre enn før fangsten. Størrelsesfordelingen på biblioteket bør falle rundt 450-550 bp (figur 2A,B), uforanderlig mellom før- og etterfangede biblioteker. Samlet sikrer korrekte resultater av disse kontrollene generering av utmerkede liCHi-C-biblioteker.

Ferdige liCHi-C-biblioteker blir deretter (minst) 100 bp paret-end sekvensert og analysert. Rå sekvenseringsdata53 behandles ved hjelp av HiCUP-rørledningen56 for kartlegging og filtrering av artefakter. Den ideelle HiCUP-rapporten viser en femdobling til ti ganger økning i fordelingen av cis (inne i samme kromosom) sammenlignet med trans (mellom forskjellige kromosomer) parede endeavlesninger, som beskrevet tidligere i henhold til in-nucleus ligation Hi-C57 (figur 3B). Obtensjonen av mer enn 100 millioner unike, gyldige avlesninger etter fjerning av PCR-duplikater er nok til å gå videre til neste trinn i analysen (figur 3B), som er å vurdere fangsteffektiviteten. Parvise avlesninger der ingen av endene deres kartlegges i et fanget restriksjonsfragment av RNA-proberikelsessystemet, forkastes, og beholder bare de som representerer promotorinteraktomet til cellen (dvs. de leser der minst en av endene deres kartlegges i restriksjonsfragmenter som inneholder en eller flere genpromotorer [figur 3C], Helst mer enn 60%).

Til slutt kalles betydelige interaksjoner med CHiCAGO-rørledningen, som beskrevet i58,59. To eller flere biologiske replikater er nødvendig for det endelige settet med signifikante promotorinteraksjoner. Datakvaliteten kan også valideres ved hjelp av prinsipal komponentanalyse (PCA), siden biologiske replikater må klynges sammen og celletyper må separeres. For eksempel, ved å analysere liCHi-C-datasett fra fire forskjellige primære celletyper fra det humane hematopoietiske treet (vanlige myeloide progenitorer, monocytter, megakaryocytter og erytroblaster), kan vi observere i en PCA at liCHi-C-biblioteker klynger på en utviklingsbanereflekterende måte (figur 3D). En nærmere undersøkelse av de signifikante interaksjonene som er oppdaget for de fire celletypene, avslører at promotorinteraktomer er celletypespesifikke og dynamiske under celleutvikling. For eksempel viser AHSP-genet, en nøkkelanstand syntetisert i erytroide forløpere som overvåker riktig folding av hemoglobin60,61,62, en gevinst av interaksjoner med potensielt aktive regulatoriske elementer (dvs. H3K27ac og H3K4me1-berikede regioner) i erytroblaster, men ikke i andre celletyper (figur 4). Dette viser at liCHi-C-metoden kan avdekke potensielle regulatoriske interaksjoner i sjeldne celletyper.

Figure 1
Figur 1: Protokolloversikt og kvalitetskontroller av prøven før sonikering . (A) Skjematisk oversikt over liCHi-C-protokollen delt på dager. B og blå hender representerer henholdsvis biotinmolekyler og trinn der man trygt kan stoppe protokollen i en stor periode. (B) Representative resultater av 3C-interaksjonskontrollene. Begge samhandlingssettene for menneske (venstre) og mus (høyre) vises. Båndene som kan forvente er markert i mørkeblått, mens et uspesifikt bånd er markert i lyseblått. (C) Representative utfyllings- og ligeringskontroller ved bruk av primerparet "Dekker" for menneskelig interaksjon. Båndet kuttes bare i felt 2 og 3, der NheI er lagt til. (D) Skjematisk fremstilling av genereringen av et nytt NheI-restriksjonssted under utfylling og ligering av et HindIII-restriksjonssted. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative automatiserte elektroforeseprofiler fra bibliotek før og etter opptak. (A) Automatisert elektroforeseprofil fra et bibliotek like før opptak. Den totale mengden DNA oppnådd er 994 ng (49,7 ng / μL i 20 μL). (B) Automatisert elektroforeseprofil med høy følsomhet fra et ferdig liCHi-C-bibliotek. Prøven lastes halvt fortynnet for å bevare så mye materiale som mulig. Den totale mengden DNA oppnådd er 61,2 ng (1,53 ng / μL i 20 μL x2 for å ta hensyn til fortynningen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativ HiCUP-pipeline-utgang og prøvereplikatklynger etter PCA . (A) Klassifisering av gyldigheten av lesepar etter prosentandeler og totalantall. Ugyldige lesepar klassifiseres etter den eksperimentelle artefakttypen. (B) Dedupliseringsprosenter og klassifisering av interaksjonstypene. Cis-interaksjoner er videre underklassifisert som cis-close (mindre enn 10 kb) og cis-far (mer enn 10 kb). (C) Prosentandel av fangsteffektivitet. Registrerte lesepar blir videre underklassifisert enten den ene enden, den andre eller begge inneholder en eller flere promotorer. (D) Hovedkomponentanalyse av CHiCAGO signifikante interaksjonspoeng fra begge replikater av liCHi-C-biblioteker fra vanlige myeloide progenitorer (CMP), erytroblaster, megakaryocytter og monocytter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: AHSP-interaksjonslandskap i humane primære hematopoietiske celler. Representativt eksempel på AHSP-promotorsentrert interaksjonslandskap i vanlige myeloide progenitorer (CMP), erytroblaster (Ery), megakaryocytter (MK) og monocytter (Mon) som sett i WashU Epigenome Browser63. Buer representerer betydelige interaksjoner. Den mørkeblå nyansen viser AHSP-genpromotoren, mens de lyseblå nyansene overlapper potensielle aktive regulatoriske elementer som samhandler spesifikt med AHSP-promotoren i erytroblaster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Buffersammensetning og -forberedelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: PCR-primere og adaptersekvenser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Eksempel på beregning for fordøyelseseffektiviteten. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

liCHi-C tilbyr muligheten til å generere høyoppløselige promotor-interaktombiblioteker ved hjelp av et lignende eksperimentelt rammeverk fra PCHi-C, men med et sterkt redusert cellenummer. Dette oppnås i stor grad ved å eliminere unødvendige trinn, for eksempel fenolrensing og fjerning av biotin. I den klassiske in-nucleus ligation Hi-C protokoll57 og dens påfølgende derivatteknikk PCHi-C, fjernes biotin fra ikke-ligerte restriksjonsfragmenter for å unngå å trekke ned DNA-fragmenter som etterpå er uinformative. Å hoppe over denne delen og dens påfølgende DNA-rensing oversetter ikke til en signifikant reduksjon i prosentandelen av gyldige avlesninger (figur 3A) mens du kutter ut potensielle DNA-sløsende trinn, som er DNA-rensinger. Omorganiseringen av Hi-C-bibliotekets forberedelse etter sonikering gjør det mulig å hoppe over enda en unødvendig rensing ved å bruke dobbeltsidig valg som selve rensingstrinnet. Alt dette forbedrer ytelsen til hele protokollen ved å bruke minimale rørendringer, og sammen med reduksjonen i reaksjonsvolum, endringer i reagenskonsentrasjon og bruk av DNA-lavbindende plastvarer, er det som gjør det mulig å generere biblioteker av høy kvalitet som bruker så lite som 50.000 celler. Det er viktig å huske på at startcellenummeret delvis bestemmer antall signifikante interaksjoner på grunn av bibliotekets kompleksitet. Selv om biblioteker generert med 50 000 celler beholder celletypespesifikke og invariante topologiske trekk fra mer komplekse biblioteker53, er vår anbefaling å bruke, om mulig, over 100 000 celler per biologisk replikat for å fange et høyere antall signifikante promotorinteraksjoner.

Oppløsningen av interaksjonene detektert i 3C-teknikker er i hovedsak gitt av restriksjonsenzymet som brukes. Her beskrives anvendelsen av liCHi-C ved hjelp av HindIII, et 6 bp-skjærende enzym som gir en teoretisk gjennomsnittlig oppløsning på 4,096 bp. liCHi-C gjør det mulig å erstatte restriksjonsenzymet, for eksempel mot et 4 bp-skjærende enzym eller til og med en mikrokokknuklease, og dermed øke oppløsningen av de signifikante interaksjonene som er oppdaget. Genereringen av liCHi-C-biblioteker, som bytter HindIII-restriksjonsenzymet for 4 bp-skjærende MboI-enzymet, har blitt rapportert å levere gode resultater som oppdager nesten dobbelt så mange totale interaksjoner, om enn med forskyvningen av den gjennomsnittlige lineære avstanden til interaksjonene oppdaget ned til halvparten av avstanden53.

Når det gjelder selve RNA-proberikelsessystemet, er en av hovedfordelene ved å bruke denne typen fangst over en antistoffbasert, for eksempel HiChIP32 eller HiCuT33, blant andre, muligheten til å sammenligne forhold uavhengig av bindingen av proteinet, samt ikke å måtte stole på tilgjengeligheten av et arbeidsantistoff for proteinet av interesse. Videre kan RNA-anrikningssystemet skreddersys for å fange opp spesifikke regioner genom-wide for å passe hver etterforskers behov (designet er diskutert i35,64).

I tillegg til antistoffbaserte fangstmetoder, har flere fremragende enkeltcellede (som scHi-C 65, Dip-C 66 eller Sci-Hi-C 67 blant andre) eller lavinngangsmetoder (som Low-C 68 eller Easy Hi-C 69) for å undersøke 3D-genomarkitekturen blitt utviklet de siste årene. Disse genererer imidlertid sparsomme kontaktkart med lav oppløsning som ikke tillater identifisering av kontakter mellom distale regulatoriske elementer og målgener. liCHi-C er en metode som er i stand til å overvinne denne begrensningen, åpne muligheten for å studere promotorsentrisk genomarkitektur i knappe celletyper og gi muligheten til å fremme vår forståelse av cellulær og utviklingsbiologi og sykdomsutvikling.

Til tross for alle funksjonene, er liCHi-C ikke fritatt for begrensninger. For det første er behandling av de rå sekvenseringsdataene ikke triviell, og det er behov for rettferdige beregningsevner for å analysere dataene og tolke resultatene. Videre diskriminerer liCHi-C ikke mellom funksjonelle og strukturelle interaksjoner; det er nødvendig at liCHi-C-dataene integreres med epigenetiske data og/eller funksjonsanalyse for å validere potensielle funksjonelle interaksjoner mellom genpromotorer og deres målregulerende elementer. Til slutt ofres bibliotekets kompleksitet når du arbeider i den nedre enden av cellenumre. Dette gjenspeiles i mengden unike interaksjoner oppdaget sammenlignet med høyere cellenummer liCHi-C-biblioteker og deres dedupliseringshastighet, som kan nå opptil 80%. Imidlertid beholder liCHi-C-biblioteker med lavt celletall de topologiske egenskapene til høyere celletallbiblioteker på en mer fokusert måte 53, noe som viser at det er mulig å utføre liCHi-C-biblioteker som rekapitulerer cellens promotorinteraksjon med så lite som50 000 celler.

Samlet sett er liCHi-C en kostnadseffektiv og tilpassbar metode for å generere høykvalitets og høyoppløselige promotor-interaktombiblioteker i knappe celletyper. Det er den første lavinngangsmetoden for å kartlegge promotorens interaktom og kreve signifikante sløyfer ved restriksjonsfragmentoppløsningen. Vi forutser at dette nye verktøyet, som forgjengeren PCHi-C, vil gi ny innsikt i celledifferensiering og organismeutvikling, både innen helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker resten av medlemmene fra Javierre-laboratoriet for tilbakemeldinger på manuskriptet. Vi takker CERCA-programmet, Generalitat de Catalunya og Josep Carreras-stiftelsen for institusjonell støtte. Dette arbeidet ble finansiert av FEDER / det spanske departementet for vitenskap og innovasjon (RTI2018-094788-A-I00), European Hematology Association (4823998) og den spanske foreningen mot kreft (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ er finansiert av La Caixa Banking Foundation Junior Leader-prosjektet (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR er finansiert av et AGAUR FI-fellesskap (2019FI-B00017), og LT-D er finansiert av et FPI Fellowship (PRE2019-088005). Vi takker biokjemi og molekylærbiologi PhD-programmet fra Universitat Autònoma de Barcelona for støtten. Ingen av finansiørene var involvert på noe tidspunkt i eksperimentell design eller manuskriptskriving.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Tags

Genetikk utgave 194
En integrert arbeidsflyt for å studere promotor-sentriske romlig-temporale genomarkitektur i knappe cellepopulasjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L.,… More

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter