Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ett integrerat arbetsflöde för att studera den promotorcentrerade spatio-temporala genomarkitekturen i knappa cellpopulationer

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65316
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 2,3, 1,4
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Summary

Genuttryck regleras av interaktioner mellan genpromotorer med distala reglerande element. Här beskriver vi hur lågt inmatat Capture Hi-C (liCHi-C) möjliggör identifiering av dessa interaktioner i sällsynta celltyper, som tidigare var omätbara.

Abstract

Spatiotemporal gentranskription regleras tätt av distala reglerande element, såsom förstärkare och ljuddämpare, som förlitar sig på fysisk närhet med sina målgenpromotorer för att kontrollera transkription. Även om dessa reglerande element är lätta att identifiera är deras målgener svåra att förutsäga, eftersom de flesta av dem är celltypspecifika och kan separeras av hundratals kilobaser i den linjära genomsekvensen och hoppa över andra icke-målgener. Under flera år har Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) varit guldstandarden för associering av distala reglerande element till deras målgener. PCHi-C förlitar sig emellertid på tillgången på miljontals celler, vilket förbjuder studier av sällsynta cellpopulationer som de som vanligtvis erhålls från primära vävnader. För att övervinna denna begränsning har Capture Hi-C (liCHi-C), en kostnadseffektiv och anpassningsbar metod för att identifiera repertoaren av distala regulatoriska element som styr varje gen i genomet, utvecklats. liCHi-C bygger på ett liknande experimentellt och beräkningsmässigt ramverk som PCHi-C, men genom att använda minimala rörbyten, modifiera reagenskoncentrationen och volymerna och byta eller eliminera steg står det för minimal materialförlust under bibliotekskonstruktionen. Sammantaget möjliggör liCHi-C studier av genreglering och spatiotemporal genomorganisation i samband med utvecklingsbiologi och cellulär funktion.

Introduction

Temporalt genuttryck driver celldifferentiering och i slutändan organismutveckling, och dess förändring är nära besläktad med en stor mängd sjukdomar 1,2,3,4,5. Gentranskription regleras fint av verkan av reglerande element, som kan klassificeras som proximala (dvs. genpromotorer) och distala (t.ex. förstärkare eller ljuddämpare), varav de senare ofta ligger långt från sina målgener och fysiskt interagerar med dem genom kromatinslingning för att modulera genuttryck 6,7,8.

Identifieringen av distala reglerande regioner i genomet är en fråga som är allmänt accepterad, eftersom dessa regioner har specifika histonmodifieringar 9,10,11 och innehåller specifika transkriptionsfaktorigenkänningsmotiv, som fungerar som rekryteringsplattformar för dem12,13,14. Dessutom, när det gäller förstärkare och superförstärkare 15,16, har de också låg nukleosombeläggning 17,18 och transkriberas till icke-kodande eRNA 19,20.

Ändå är varje distalt reglerande elements målgener svårare att förutsäga. Oftare än inte är interaktioner mellan distala reglerande element och deras mål celltyp- och stimulansspecifika 21,22, spänner över hundratals kilobaser, överbryggar över andra gener i vilken riktning som helst 23,24,25 och kan till och med lokaliseras inom introniska regioner av deras målgen eller andra icke-mellanliggande gener 26,27. Dessutom kan distala reglerande element också styra mer än en gen samtidigt och vice versa28,29. Denna positionskomplexitet hindrar att man identifierar regleringsföreningar mellan dem, och därför förblir de flesta av varje regleringselements mål i varje celltyp okända.

Under de senaste åren har det skett en betydande boom i utvecklingen av kromosomkonformationsfångst (3C) tekniker för att studera kromatininteraktioner. Den mest använda av dem, Hi-C, gör det möjligt att generera en karta över alla interaktioner mellan varje fragment av en cells genom30. Men för att upptäcka signifikanta interaktioner på restriktionsfragmentnivå förlitar sig Hi-C på ultradjup sekvensering, vilket förbjuder dess användning för att rutinmässigt studera det reglerande landskapet för enskilda gener. För att övervinna denna ekonomiska begränsning har flera anrikningsbaserade 3C-tekniker uppstått, såsom ChIA-PET31, HiChIP 32 och dess låginsatsmotsvarighet HiCuT33. Dessa tekniker är beroende av användningen av antikroppar för att anrika för genomomfattande interaktioner medierade av ett specifikt protein. Ändå är den unika egenskapen hos dessa 3C-tekniker också banan för deras tillämpning; Användare räknar med tillgången på högkvalitativa antikroppar för proteinet av intresse och kan inte jämföra förhållanden där bindningen av proteinet är dynamisk.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) är en annan anrikningsbaserad 3C-teknik som kringgår dessa begränsningar34,35. Genom att använda ett biotinylerat RNA-sondanrikningssystem kan PCHi-C generera genomomfattande högupplösta bibliotek av genomiska regioner som interagerar med 28 650 humana eller 27 595 mus-annoterade genpromotorer, även kända som promotorinteraktomet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att upptäcka signifikanta långväga interaktioner vid restriktionsfragmentnivåupplösningen för både aktiva och inaktiva promotorer och robust jämföra promotorinteraktomer mellan vilket tillstånd som helst oberoende av dynamiken i histonmodifieringar eller proteinbindning. PCHi-C har använts i stor utsträckning under de senaste åren för att identifiera promotorinteraktomomorganisationer under celldifferentiering 36,37, identifiera verkningsmekanismen för transkriptionsfaktorer38,39 och upptäcka nya potentiella gener och vägar som avregleras vid sjukdom av icke-kodande varianter 40,41,42,43,44,45,46,47,48, tillsammans med nya drivrutinsicke-kodande mutationer49,50. Dessutom, genom att bara modifiera fångstsystemet, kan denna teknik anpassas enligt den biologiska frågan för att förhöra alla interaktomer (t.ex. förstärkaren interactome 51 eller interactome av en samling icke-kodande ändringar41,52).

PCHi-C förlitar sig dock på minst 20 miljoner celler för att utföra tekniken, vilket förhindrar studier av knappa cellpopulationer som de som ofta används i utvecklingsbiologi och kliniska tillämpningar. Av denna anledning har vi utvecklat Capture Hi-C (liCHi-C) med låg inmatning, en ny kostnadseffektiv och anpassningsbar metod baserad på det experimentella ramverket för PCHi-C för att generera högupplösta promotorinteraktomer med lågcellingång. Genom att utföra experimentet med minimala rörbyten, byta eller eliminera steg från det ursprungliga PCHi-C-protokollet, drastiskt minska reaktionsvolymerna och modifiera reagenskoncentrationer, maximeras bibliotekskomplexiteten och det är möjligt att generera högkvalitativa bibliotek med så lite som 50 000 celler53.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) har jämförts med PCHi-C och använts för att belysa promotorinteraktomkoppling under human hematopoetisk celldifferentiering, upptäcka potentiella nya sjukdomsassocierade gener och vägar som avregleras av icke-kodande förändringar och upptäcka kromosomavvikelser53. Steg-för-steg-protokollet och de olika kvalitetskontrollerna genom tekniken beskrivs här fram till den slutliga generationen av biblioteken och deras beräkningsanalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

För att säkerställa minimal materialförlust, (1) arbeta med DNA-lågbindande rör och spetsar (se materialförteckning), (2) placera reagens på rörväggen istället för att införa spetsen inuti provet och, (3) om möjligt, blanda provet genom inversion istället för att pipettera provet upp och ner och snurra ner efteråt för att återvinna provet.

1. Cellfixering

  1. Celler som växer i suspension
    1. Skörda 50 000 till en miljon celler och placera dem i ett DNA-lågbindande 1,5 ml rör.
      OBS: De celltyper som används för den aktuella studien beskrivs i avsnittet representativa resultat.
    2. Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 600 x g (vid 4 °C) med hjälp av en rotorcentrifug med fast vinkel och avlägsna supernatanten genom pipettering.
    3. Resuspendera cellerna i 1 ml RPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt 143 μL metanolfri 16% formaldehyd för att nå en koncentration på 2% och blanda.
    5. Inkubera cellerna i 10 minuter medan du roterar vid rumstemperatur för att fixera cellerna.
      OBS: Försök att vara så noggrann som möjligt med 10 minuters inkubation. Över- eller underfixering av cellerna kan leda till en minskning av bibliotekets kvalitet.
    6. Släck reaktionen genom att tillsätta 164 μL iskall 1 M glycin och blanda. Inkubera cellerna i 5 minuter och rotera vid rumstemperatur.
    7. Inkubera cellerna ytterligare i 15 minuter på is, blanda genom inversion var ~ 5: e minut.
    8. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 1 000 x g (vid 4 °C) med hjälp av en rotorcentrifug med fast vinkel och avlägsna supernatanten.
    9. Tvätta cellerna genom att återsuspendera pelleten i 1 ml iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    10. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 1 000 x g (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten.
      OBS: De pelleterade cellerna kan snabbfrysas i flytande kväve eller torris och förvaras vid -80 °C.
  2. Vidhäftande celler
    1. Tvätta cellerna i odlingsskålen med 1x PBS.
    2. Förbered tillräckligt med RPMI 1640 kompletterat med 10% FBS och metanolfri 2% formaldehyd vid rumstemperatur för att täcka odlingsskålen.
    3. Tillsätt det kompletterade mediet i odlingsskålen med cellerna och inkubera i 10 minuter, gunga vid rumstemperatur för att fixera cellerna.
      OBS: Försök att vara så noggrann som möjligt med 10 minuters inkubation. Över- eller underfixering av cellerna kan leda till en minskning av bibliotekets kvalitet.
    4. Släck reaktionen genom att tillsätta 1 M glycin tills 0,125 M och blanda genom gungning.
    5. Inkubera cellerna i 5 minuter, gunga vid rumstemperatur.
    6. Inkubera cellerna ytterligare i 15 minuter vid 4 °C, blanda genom att gunga var 3–4:e minut.
    7. Ta bort mediet och tvätta cellerna med kall 1x PBS.
    8. Skrapa cellerna och överför dem till ett 1,5 ml DNA-lågbindande rör. Torka av odlingsskålen med 0,5-1 ml kall 1x PBS.
    9. Centrifugera cellerna i 10 minuter vid 1 000 x g (vid 4 °C) med hjälp av en rotorcentrifug med fast vinkel och avlägsna supernatanten. De pelleterade cellerna kan snabbfrysas i flytande kväve eller torris och förvaras vid -80 °C.

2. Lys och matsmältning

  1. Resuspendera cellerna i 1 ml kalllysbuffert (tabell 1) för att störa cellmembranet. Tillsatsen av bufferten ensam bör vara tillräcklig för att återsuspendera cellerna, men de kan återsuspenderas ytterligare vid behov genom lätt virvelning.
  2. Inkubera på is i 30 minuter, blanda genom inversion var ~ 5 minut. Centrifugera kärnorna i 10 minuter vid 1 000 x g (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Återsuspendera kärnorna med 500 μL kall 1,25x restriktionsbuffert 2 (se materialtabell).
  3. Centrifugera kärnorna i 10 minuter vid 1 000 x g (vid 4 °C) och avlägsna supernatanten. Resuspendera kärnorna i 179 μL 1,25x restriktionsbuffert 2.
  4. Tillsätt 5,5 μl 10% natriumdodecylsulfat (SDS; se materialförteckning) och blanda. Cellerna kan bilda klumpar; Detta är normalt och måste disaggregeras så mycket som möjligt genom virvelning. Inkubera provet i 1 timme vid 37 °C i ett termoblock med skakning vid 950 varv/min.
  5. Släck SDS genom att tillsätta 37,5 μL 10% Triton X-100 och blanda. Inkubera provet i 1 timme vid 37 °C i ett termoblock med skakning vid 950 varv/min.
  6. Smält kromatin genom att tillsätta 7,5 μL HindIII (100 E/μL; se Materialtabell) och blanda. Inkubera provet över natten vid 37 °C i ett termoblock med skakning vid 950 varv/min.
  7. Nästa morgon, tillsätt ytterligare 2,5 μL HindIII (100 E/μL) och inkubera provet ytterligare i 1 timme vid 37 °C i ett termoblock, med skakning vid 950 rpm för att säkerställa korrekt kromatinuppslutning.
    OBS: Som en del av kontrollerna av rötningseffektiviteten (se steg 5.1), överför motsvarande 20 000 till 40 000 kärnor till ett annat rör för att representera den osmälta kontrollen. Efter matsmältningen, överför samma antal celler till ett annat rör igen för att representera den smälta kontrollen. Det rekommenderas att testa rötningseffektiviteten som ett separat experiment om tillgången på utgångsmaterialet är knapp.

3. Ligering och tvärbindning

  1. Kyl provet på is. Bered en mastermix och tillsätt följande reagens för att fylla i och biotinylera restriktionsfragmentets överhäng: 3 μL 10x restriktionsbuffert 2, 1 μL nukleasfritt vatten, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotin-14-dATP och 5 μL 5 U/μL Klenow (se Materialtabell). Inkubera provet i 75 minuter vid 37 °C, blanda genom inversion var ~15:e minut.
  2. Kyl provet på is. Bered en mastermix och tillsätt följande reagens för att ligera de ifyllda DNA-ändarna: 50 μL 10x ligeringsbuffert, 2,5 μL 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 12,5 μL 1 E/μL T4 DNA-ligas och 173 μL nukleasfritt vatten (se materialtabell).
  3. Inkubera provet i 4–6 timmar vid 16 °C och blanda genom inversion var ~1:e timme. Inkubera vidare provet i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvärbind kromatinet genom att tillsätta 30 μl 10 mg/ml proteinas K och blanda. Inkubera provet vid 65 °C över natten.
  4. Följande morgon tillsätts ytterligare 15 μl 10 mg/ml proteinas K och inkuberas provet ytterligare i 2 timmar vid 65 °C för att säkerställa korrekt tvärbindning av kromatin.

4. DNA-rening

  1. Kyl provet till rumstemperatur och överför det till ett lämpligt rör för fenolkloroformrening.
  2. Tillsätt 1 volym (545 μL) fenol:kloroform:isoamylalkohol (25:24:1) för att rena DNA och blanda genom kraftig skakning.
  3. Centrifugera provet i 5 minuter vid 12 000 x g vid rumstemperatur och överför den övre vattenfasen (545 μl) till ett 2 ml lågbindande DNA-rör.
  4. Tillsätt följande reagenser för att fälla ut DNA: 1 362,5 μl 100 % etanol kyld till -20 °C, 54,5 μl 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 2 μl 15 mg/ml glykogen som koprecipitant.
  5. Inkubera i 1 timme vid -80 °C eller över natten vid -20 °C.
  6. Centrifugera provet i 30 minuter vid 16 000–21 000 x g vid 4 °C och avlägsna supernatanten. DNA-pelleten måste vara synlig.
  7. Tvätta pelleten genom att tillsätta 1 ml 70% etanol, virvla och centrifugera i 10 minuter vid 16 000-21 000 x g vid rumstemperatur.
  8. Ta bort supernatanten och låt pelleten lufttorka. Återsuspendera DNA-pelleten i 130 μl nukleasfritt vatten.
  9. Bedöm koncentrationen genom fluorometrisk kvantifiering (se materialtabell). Förvara det renade 3C-materialet vid -20 °C i flera månader innan du fortsätter med protokollet.

5. Valfria kvalitetskontroller

  1. Bedöm matsmältningseffektiviteten. Utför decrosslinking och fenol:kloroform DNA-rening, som beskrivits tidigare, till de osmälta och smälta kontrollerna erhållna i steg 2.13. Återsuspendera DNA-pelleten i 10 μl nukleasfritt vatten. Kvantifiera koncentrationen och späd vid behov det erhållna DNA:t till 4 ng/μl.
  2. Utför kvantitativ PCR med 4 ng DNA från både de osmälta och smälta kontrollerna, med primrar som spänner över en öppen kromatinplats med och utan ett HindIII-mål (se tabell 2 för primerdesign). Beräkna effektiviteten i matsmältningen enligt en tidigare publicerad rapport35.
    OBS: Effektiviteten av ligering beräknas i procent med formeln: matsmältning (%) = 100 -100 / (2 ^ [(Ct smält med HindIII - Ctdigested utan HindIII) - (Ct osmält med HindIII - Ct osmält utan HindIII)]) (se tabell 3), som tar hänsyn till skillnaden mellan de olika Cts som erhållits för varje primerpar i de osmälta och smälta kontrollerna.
  3. Bedöma känsligheten för interaktionsdetektion genom att utföra konventionell polymeraskedjereaktion (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm både F + R-primrar, 0,1 och U / μL varmstartpolymeras), med primrar som spänner över både lång- och kortdistanscellinvarianta interaktioner (se tabell 2 för primerdesign). Använd 50–100 ng 3C-material (för interaktion på kort respektive lång sträcka) och förstärk under följande förhållanden: 98 °C i 15 minuter, följt av 37 cykler vid 98 °C i 30 sekunder, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 minut och avslutas med 72 °C i 10 minuter. Håll i 4 °C.
    OBS: Om mängden DNA som erhålls är mindre än 2 μg, kontrollera endast en lång- och en kortdistansinteraktion istället för hela interaktionspanelen.
  4. Kör produkten på 1x tris-borat-EDTA (TBE) med 1,6% agarosgel och leta efter närvaron av motsvarande PCR-amplikon54.
    OBS: På grund av den oförutsägbara "klipp-och-klistra" av genomet kan ospecifika band visas. Så länge rätt bandstorlek observeras räknas den som korrekt.
  5. Bedöm effektiviteten av biotinfyllning och ligering genom att differentiellt smälta en kortdistans PCR-produkt med HindIII, NheI (se materialtabell), båda enzymerna eller ingen (vatten) och köra produkten på en 1x TBE 1,6% agarosgel. En korrekt fyllning och ligering eliminerar det tidigare HindIII-målet och skapar ett nytt NheI-mål, så amplikonen ska endast skäras i närvaro av NheI.
    OBS: För att minimera materialförlust, hämta 2,5 μL av en PCR-produkt med kort räckvidd från interaktionskontrollerna och förstärka den fem gånger för att utföra fyllnings- och ligeringskontrollerna.

6. Ultraljudsbehandling

  1. Överför 130 μL av provet (fyll på med nukleasfritt vatten om något användes för kontrollerna) till en kyvett som är lämplig för ultraljudsbehandling.
  2. Ställ in ett vattenbad sonicator och sonicate med hjälp av följande parametrar (optimerad för modell och kyvetter som beskrivs i materialtabellen): Duty faktor: 20%; toppincidenseffekt: 50; cykler per burst: 200; tid: 65 s; och temperaturområde: 6-10 °C (8 °C optimalt).
  3. Överför provet till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör.

7. Slutreparation

  1. Förbered en mastermix och tillsätt följande reagens för att reparera DNA-fragmentens ojämna ändar som skapats under ultraljudsbehandling: 18 μL 10x ligeringsbuffert, 18 μL 2,5 mM dNTP-blandning vardera, 6,5 μL 3 U / μL T4 DNA-polymeras, 6,5 μL 10 U / μL T4 PNK och 1,3 μL 5 U / μL Klenow (se materialtabell).
  2. Inkubera provet i 30 minuter vid 20 °C och fyll på med Tris-low EDTA (TLE) buffert (se tabell 1) till 300 μl.

8. Neddragning av biotin

  1. Överför 150 μL C1 streptavidinpärlor (se materialförteckning) per prov till ett 1,5 ml rör, placera dem på en 1,5 ml rörmagnet och vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen. Ta bort supernatanten och lämna pärlorna bakom.
  2. Tvätta pärlorna med 400 μl 1x interpoleringsbuffert (TB; se tabell 1). För att tvätta pärlorna, tillsätt bufferten och återsuspendera dem genom mjuk virvelning. Sätt tillbaka röret i magneten och vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen. Ta bort supernatanten och lämna pärlorna bakom.
  3. Tvätta pärlorna med 300 μL 1x ingen interpoleringsbuffert (NTB; se tabell 1). Återsuspendera pärlorna i 300 μL 2x NTB (se tabell 1).
    OBS: Pärlorna kan bilda ett dammigt lager runt tubväggen vid tvätt med buffertar utan tvättmedel. Detta är normalt och påverkar inte resultatet av protokollet.
  4. Kombinera dessa 300 μL pärlor i 2x NTB med 300 μL av provet. Inkubera i 15 minuter, rotera vid rumstemperatur för att dra ner de informativa DNA-fragmenten med biotin. Biblioteket sitter nu fast vid C1 streptavidinpärlorna.
  5. Tvätta pärlorna med 400 μL 1x NTB. Tvätta pärlorna med 100 μL TLE-buffert och suspendera dem sedan igen i 35,7 μL TLE-buffert.

9. dATP-tailing, adapterligering och PCR-förstärkning

  1. Bered en mastermix och tillsätt följande reagens till provet för att dATP-svansa ändarna på de reparerade DNA-fragmenten: 5 μL 10x restriktionsbuffert 2, 2,3 μL 10 mM dATP och 7 μL 5 U / μL Klenow exo-. Inkubera provet i 30 minuter vid 37 °C.
  2. Inaktivera Klenow exo- genom att inkubera provet ytterligare i 10 minuter vid 65 °C. Kyl provet på is. Tvätta pärlorna med 300 μL 1x TB. Tvätta pärlorna med 300 μL 1x NTB.
  3. Tvätta pärlorna med 100 μL 1x ligeringsbuffert och suspendera dem sedan igen i 50 μL 1x ligeringsbuffert. Tillsätt 4 μL 15 μM förglödgad adapterblandning (se tabell 2) och 1 μl 2 000 E/μL T4 DNA-ligas (se materialtabell) till provet.
  4. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur. Tvätta pärlorna med 400 μL 1x TB. Tvätta pärlorna med 200 μL 1x NTB. Tvätta pärlorna med 100 μl 1x restriktionsbuffert 2.
  5. Tvätta pärlorna med 50 μL 1x restriktionsbuffert 2 och suspendera dem sedan igen i 50 μL 1x restriktionsbuffert 2.
  6. Blanda följande reagens för att förbereda PCR-reaktionen för att förstärka biblioteket: 50 μL pärlor med biblioteket, 250 μL 2x PCR-mastermix med enzym, 12 μL F + R-primrar (25 μM vardera, se tabell 2) och 188 μL nukleasfritt vatten.
  7. Utför PCR med följande betingelser (dela upp PCR-reagensblandningen i 50 μl-reaktioner): 98 °C i 40 s, följt av X-cykler på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s och avsluta med 72 °C i 10 minuter. Håll i 4 °C.
    OBS: Använd följande antal cykler som utgångspunkt för att optimera protokollet i diploida celler som syftar till en 500-1,000 ng-utgång före biblioteksfångst: en miljon celler i åtta cykler; 250 000 celler i 10 cykler; 50 000 celler i 12 cykler.
  8. Slå samman alla 50 μL-reaktioner från samma prov i ett 1,5 ml DNA-lågbindande rör, placera det på en 1,5 ml rörmagnet och vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen.
  9. Överför supernatanten som innehåller biblioteket (500 μl) till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör. Fyll på TLE-buffert till 500 μL om något av supernatanten förlorades. C1 streptavidinpärlorna behövs inte längre.
  10. Utför ett dubbelsidigt val55 med paramagnetisk pärlrening (0,4-1 volym). Detta möjliggör selektiv eliminering av för stora (>1 000 bp) och för små fragment eller PCR-primrar (<200 bp), beroende på koncentrationen av polyetylenglykol och salt av de paramagnetiska pärlorna som tillsätts.
  11. Tillsätt 200 μL (0,4 volymer) lagerpärlor till biblioteket och blanda genom virvelning. Inkubera i 10 minuter och rotera vid rumstemperatur.
  12. Placera på en magnet, vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen och överför supernatanten som innehåller biblioteket (utan de större fragmenten) till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör.
  13. Koncentrera pärlorna genom att ta 750 μL lagerpärlor, placera dem i ett 1,5 ml rör på en magnet, vänta i 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen, ta bort supernatanten och återsuspendera pärlorna genom att virvla i 300 μL nya lagerpärlor.
  14. Tillsätt dessa 300 μL koncentrerade pärlor till provet (1 volym) och blanda genom virvelning. Inkubera i 10 minuter och rotera vid rumstemperatur. Placera på en magnet, vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen och ta bort supernatanten (som innehåller de mindre fragmenten och PCR-primrarna).
  15. Tvätta pärlorna tre gånger med 1 ml 70% etanol. För att göra detta, tillsätt etanolen medan röret med pärlorna fortfarande är på magneten, försök att inte störa pärlorna och vänta på 30-60 s. Ta sedan bort supernatanten utan att störa pärlorna.
  16. Låt kulorna lufttorka och suspendera dem igen i 21 μL TLE-buffert genom virvelning.
    OBS: Överdriven torkning av pärlorna kan minska utbytet vid eluering av DNA. Sikta på att återsuspendera dem i TLE-buffert omedelbart efter att de inte längre är "glänsande" från etanolen.
  17. Inkubera provet i 10 minuter vid 37 °C i ett termoblock för att eluera biblioteket från pärlorna. Placera röret i en magnet och överför supernatanten som innehåller biblioteket till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör.
  18. Kvantifiera storlek och koncentration genom automatiserad elektrofores (se materialförteckning). Renat Hi-C-material kan förvaras vid -20 °C i flera månader innan protokollet följs.

10. Biblioteksfångst

  1. Arbeta med 500-1 000 ng av biblioteket. Koncentrera biblioteket genom att torka DNA med hjälp av en vakuumkoncentrator och återsuspendera materialet i 3,4 μL nukleasfritt vatten.
  2. Lägg till följande blockerare från målanrikningssatsen (se Materialförteckning) i provet: 2,5 μL Blocker 1, 2,5 μL Blocker 2 och 0,6 μL anpassad oligoblockerare för adaptrarna.
  3. Suspendera upp ordentligt, överför lösningen till en 0,2 ml PCR-remsa och inkubera i en termocykler i 5 minuter vid 95 °C, följt av 5 minuter vid 65 °C med uppvärmt lock. Låt röret inkubera vid 65 °C.
  4. Bered hybridiseringslösningen genom att kombinera följande reagens från målanrikningssatsen (se Materialförteckning) per prov (13 μl). Håll på bänken vid rumstemperatur: 6,63 μL Hyb 1, 0,27 μL Hyb 2, 2,65 μL Hyb 3 och 3,45 μL Hyb 4.
  5. Späd 0,5 μl RNas-block från målanrikningssatsen med 1,5 μL nukleasfritt vatten per prov. Tina 5 μL av det biotinylerade RNA per prov på is och tillsätt 2 μL av det utspädda RNas-blocket. Håll på bänken vid rumstemperatur.
  6. Tillsätt 13 μL hybridiseringslösning till 7 μL biotinylerat RNA med RNas och blanda väl.
  7. När du är på termocykler vid 65 °C, överför hybridiseringslösningen med det biotinylerade RNA (20 μL) till det blockerade biblioteket. Stäng locket ordentligt och inkubera i termocykler över natten vid 65 °C.
    OBS: För att minimera provindunstning (vilket kan leda till suboptimal RNA-DNA-hybridisering) när du utför flera prover samtidigt, använd en flerkanalig pipett för att överföra det biotinylerade RNA till varje bibliotek samtidigt.

11. Neddragning av biotin och PCR-amplifiering

  1. Överför 50 μL T1 streptavidinpärlor per prov till ett 1,5 ml DNA-lågbindande rör, placera dem på en 1,5 ml rörmagnet och vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen. Ta bort supernatanten och lämna pärlorna bakom. Tvätta pärlorna tre gånger med 200 μL av bindningsbufferten från målanrikningssatsen.
  2. Återsuspendera pärlorna i 200 μL bindningsbuffert. Medan termocykler används vid 65 °C, överför provet till de återsuspenderade T1-streptavidinpärlorna och inkubera i 30 minuter och rotera vid rumstemperatur.
  3. Tvätta pärlorna med 200 μL tvättbuffert 1 från målanrikningssatsen. Inkubera i 15 minuter och rotera vid rumstemperatur. Tvätta pärlorna tre gånger med 200 μl tvättbuffert 2 från målanrikningssatsen uppvärmd till 65 °C. Inkubera i 10 minuter vid 65 °C i ett termoblock och skaka vid 300 varv/min mellan tvättarna.
  4. Tvätta pärlorna med 200 μL 1x restriktionsbuffert 2 och suspendera dem sedan igen i 30 μL 1x restriktionsbuffert 2.
  5. Blanda följande reagens för att förbereda PCR-reaktionen för att förstärka biblioteket: 30 μL pärlor med biblioteket, 150 μL 2x PCR-mastermix med enzym, 7,2 μL F + R-primrar (25 μM vardera, se tabell 2) och 112,8 μL nukleasfritt vatten.
  6. Utför PCR med följande betingelser (dela PCR-reagensblandningen i 50 μl-reaktioner): 98 °C i 40 s, följt av fyra cykler på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s och avsluta med 72 °C i 10 minuter. Håll i 4 °C.
  7. Slå samman alla 50 μL-reaktioner från samma prov i ett 1,5 ml DNA-lågbindande rör, placera det på en 1,5 ml rörmagnet och vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen.
  8. Överför supernatanten som innehåller biblioteket (300 μl) till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör. Fyll på TLE-buffert till 300 μL om något av supernatanten förlorades. T1 streptavidinpärlorna behövs inte längre.
  9. Utför en DNA-rening med paramagnetiska pärlor (0,9 volymer; se materialförteckning). Tillsätt 270 μl lagerpärlor till provet och blanda genom virvelning.
  10. Inkubera i 10 minuter och rotera vid rumstemperatur.
  11. Placera på en magnet, vänta 2-3 minuter eller tills alla pärlor sitter fast på väggen och ta bort supernatanten.
  12. Tvätta pärlorna tre gånger med 1 ml 70% etanol. För att göra detta, tillsätt etanolen medan röret med pärlorna fortfarande är på magneten, försök att inte störa pärlorna och vänta 30-60 s. Ta sedan bort supernatanten utan att störa pärlorna.
  13. Låt kulorna lufttorka och suspendera dem igen i 21 μL TLE-buffert genom virvelning.
    OBS: Överdriven torkning av pärlorna kan minska utbytet vid eluering av DNA. Sikta på att återsuspendera dem i TLE-buffert omedelbart efter att de inte längre är "glänsande" från etanolen.
  14. Inkubera provet i 10 minuter vid 37 °C i ett termoblock för att eluera biblioteket från pärlorna.
  15. Placera röret i en magnet och överför supernatanten som innehåller biblioteket till ett nytt 1,5 ml DNA-lågbindande rör.
  16. Kvantifiera storlek och koncentration genom automatiserad elektrofores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

liCHi-C erbjuder möjligheten att generera högkvalitativa och upplösningsgenomomfattande promotorinteraktombibliotek med så lite som 50 000 celler53. Detta uppnås genom att - förutom den drastiska minskningen av reaktionsvolymer och användningen av DNA-lågbindande plastvaror i hela protokollet - ta bort onödiga steg från det ursprungliga protokollet, där betydande materialförluster uppstår. Dessa inkluderar fenolrening efter tvärbindning, avlägsnande av biotin och efterföljande fenol-kloroformrening och etanolutfällning. Förutom det, omorganisering av stegen i Hi-C-biblioteksberedningen (biotinneddragning, A-tailing, adapterligering, PCR-amplifiering och dubbelsidigt paramagnetiskt pärlval - även som PCR-produktrening) gör det möjligt för oss att ta bort ännu ett onödigt DNA-reningssteg. En översikt över det experimentella arbetsflödet finns i figur 1A.

För att bedöma bibliotekskvaliteten utförs flera kontroller i hela protokollet, varav den första är beräkningen av genomets matsmältningseffektivitet; Värden över 80 % anses godtagbara (tabell 3). Kontroll av celltypens matsmältningseffektivitet i ett separat experiment föreslås för att inte förlora en betydande mängd material från ett enda liCHi-C-experiment. För det andra, före ultraljudsbehandling och slutreparation, rekommenderas att kontrollera känsligheten för interaktionsdetektering genom att förstärka invarianta kromatininteraktioner av celltyp med konventionell PCR (figur 1B). Om den specifika produkten detekteras bör en tredje kontroll utföras, med fokus på effektiviteten av biotinylering och ligering genom differentiell nedbrytning av en av de tidigare erhållna PCR-produkterna med HindIII och NheI (figur 1C, D). När du fyller en smält HindIII-restriktionsplats och trubbigt ligerar den med en annan, genereras en ny NheI-begränsningsplats istället för att regenerera den ursprungliga HindIII-restriktionen. Därför bör matsmältningen av PCR-amplikonen endast observeras när NheI är närvarande. Slutligen, strax före och efter hela fångsten, bör koncentrationen och storleksfördelningen kontrolleras med hjälp av automatiserad elektrofores. Förstärkning av bibliotek före infångning måste syfta till att erhålla 500-1 000 ng Hi-C-material, den exakta mängd som behövs för att utföra RNA-sondinfångningen, eftersom överdriven amplifiering av både det för- och efterfångade biblioteket leder till en hög andel PCR-dubbletter och därmed förlust av sekvenseringsläsningar under analysen. Bibliotek kan förstärkas igen under samma förhållanden om inte tillräckligt med material erhålls under den första konservativa PCR-förstärkningen. Mängden post-inspelat biblioteksmaterial kan variera, men som en tumregel bör det vara ungefär tiofaldigt till 20 gånger mindre än före fångsten. Bibliotekets storleksfördelning bör ligga runt 450-550 bp (figur 2A, B), oföränderlig mellan för- och efterfångade bibliotek. Sammantaget säkerställer korrekta resultat av dessa kontroller generering av utmärkta liCHi-C-bibliotek.

Färdiga liCHi-C-bibliotek sekvenseras och analyseras sedan (minst) 100 bp paired-end. Råsekvenseringsdata53 bearbetas med hjälp av HiCUP-pipeline56 för mappning och filtrering av artefakter. Den ideala HiCUP-rapporten visar en femfaldig till tiofaldig ökning av fördelningen av cis (inuti samma kromosom) jämfört med trans (mellan olika kromosomer) parade ändläsningar, som beskrivits tidigare enligt in-nucleus ligation Hi-C57 (Figur 3B). Att få mer än 100 miljoner unika, giltiga läsningar efter borttagning av PCR-dubbletter räcker för att gå vidare till följande steg i analysen (figur 3B), vilket är att bedöma fångsteffektiviteten. Parade ändläsningar där ingen av deras ändar mappas till ett fångat restriktionsfragment av RNA-sondanrikningssystemet, kasseras och behåller endast de som representerar cellens promotorinteraktom (dvs. de läsningar där minst en av deras ändar mappas till restriktionsfragment innehållande en eller flera genpromotorer [figur 3C], helst mer än 60%).

Slutligen kallas betydande interaktioner med CHiCAGO-rörledningen, som beskrivs i58,59. Två eller flera biologiska replikat behövs för den slutliga uppsättningen signifikanta promotorinteraktioner. Datakvaliteten kan också valideras med hjälp av principalkomponentanalys (PCA), eftersom biologiska replikat måste kluster tillsammans och celltyper måste separeras. Genom att analysera liCHi-C-dataset från fyra olika primära celltyper från det humana hematopoetiska trädet (vanliga myeloida stamfäder, monocyter, megakaryocyter och erytroblaster) kan vi till exempel observera i en PCA att liCHi-C-bibliotek kluster på ett utvecklingsbanreflekterande sätt (figur 3D). En närmare undersökning av de signifikanta interaktioner som detekterats för de fyra celltyperna avslöjar att promotorinteraktomer är celltypspecifika och dynamiska under cellutveckling. Till exempel visar AHSP-genen, en nyckelchaperon syntetiserad i erytroida prekursorer som övervakar korrekt vikning av hemoglobin60,61,62, en vinst av interaktioner med potentiellt aktiva reglerande element (dvs H3K27ac och H3K4me1 anrikade regioner) i erytroblaster, men inte i andra celltyper (figur 4). Detta visar att liCHi-C-metoden kan avslöja potentiella regulatoriska interaktioner i sällsynta celltyper.

Figure 1
Figur 1: Protokollöversikt och kvalitetskontroller av provet före ultraljudsbehandling . (A) Schematisk översikt över liCHi-C-protokollet dividerat med dagar. B och blå händer representerar respektive biotinmolekyler och steg där man säkert kan stoppa protokollet under en lång tid. b) Representativa resultat av 3C-interaktionskontroller. Båda interaktionsuppsättningarna för människa (vänster) och mus (höger) visas. Banden att förvänta sig är markerade i mörkblått, medan ett ospecifikt band är markerat i ljusblått. (C) Representativa fyllnings- och ligeringskontroller med hjälp av "Dekker" human interaction primer-paret. Bandet skärs endast i banorna 2 och 3, där NheI läggs till. (D) Schematisk representation av genereringen av ett nytt NheI-restriktionsställe under fyllning och ligering av ett HindIII-restriktionsställe. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa automatiserade elektroforesprofiler från bibliotek före och efter fångst. (A) Automatiserad elektroforesprofil från ett bibliotek strax före fångst. Den totala mängden DNA som erhållits är 994 ng (49,7 ng / μL i 20 μL). (B) Högkänslig automatiserad elektroforesprofil från ett färdigt liCHi-C-bibliotek. Provet laddas halvspätt för att bevara så mycket material som möjligt. Den totala mängden DNA som erhålls är 61,2 ng (1,53 ng / μL i 20 μL x2 för att redogöra för utspädningen). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Representativa HiCUP-pipelineutdata och exempel replikerar klustring efter PCA . (A) Klassificering av giltigheten för läspar i procent och totalt antal. Ogiltiga läspar klassificeras efter experimentell artefakttyp. (B) Dedupliceringsprocent och klassificering av interaktionstyperna. Cis-interaktioner klassificeras vidare som cis-nära (mindre än 10 kb) och cis-far (mer än 10 kb). c) Procentandel av fångsteffektiviteten. Fångade läspar delas vidare in oavsett om den ena änden, den andra eller båda innehåller en eller flera promotorer. (D) Huvudkomponentanalys av CHiCAGO signifikanta interaktionspoäng från båda replikaten av liCHi-C-bibliotek från vanliga myeloida progenitorer (CMP), erytroblaster, megakaryocyter och monocyter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: AHSP-interaktionslandskap i humana primära hematopoetiska celler. Representativt exempel på det AHSP-promotorcentrerade interaktionslandskapet hos vanliga myeloida föregångare (CMP), erytroblaster (Ery), megakaryocyter (MK) och monocyter (Mon) som ses i WashU Epigenome Browser63. Bågar representerar betydande interaktioner. Den mörkblå nyansen visar AHSP-genpromotorn, medan de ljusblå nyanserna överlappar potentiella aktiva reglerande element som interagerar specifikt med AHSP-promotorn i erytroblaster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Buffertens sammansättning och beredning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: PCR-primrar och adaptersekvenser. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Exempel på beräkning av rötningseffektivitet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

liCHi-C erbjuder möjligheten att generera högupplösta promotorinteraktombibliotek med hjälp av ett liknande experimentellt ramverk från PCHi-C men med ett kraftigt reducerat cellantal. Detta uppnås i hög grad genom att eliminera onödiga steg, såsom fenolrening och borttagning av biotin. I det klassiska in-nucleus ligation Hi-C protokollet57 och dess efterföljande derivatteknik PCHi-C avlägsnas biotin från icke-ligerade restriktionsfragment för att undvika att dra ner DNA-fragment som efteråt är informativa. Att hoppa över denna del och dess efterföljande DNA-rening innebär inte en signifikant minskning av andelen giltiga läsningar (figur 3A) samtidigt som man skär ut potentiella DNA-slösande steg, som är DNA-reningar. Omorganisationen av Hi-C-bibliotekets förberedelse efter ultraljudsbehandling gör det möjligt att hoppa över ännu en onödig rening genom att använda det dubbelsidiga urvalet som själva reningssteget. Allt detta förbättrar hela protokollets prestanda genom att använda minimala rörbyten, och tillsammans med minskningen av reaktionsvolymen, förändringar i reagenskoncentrationen och användningen av DNA-lågbindande plastvaror är det som möjliggör generering av högkvalitativa bibliotek med så lite som 50 000 celler. Det är viktigt att komma ihåg att startcellnumret delvis bestämmer antalet signifikanta interaktioner på grund av bibliotekets komplexitet. Även om bibliotek som genereras med 50 000 celler behåller de celltypspecifika och invarianta topologiska egenskaperna hos mer komplexa bibliotek53, är vår rekommendation att om möjligt använda över 100 000 celler per biologiskt replikat för att fånga ett högre antal signifikanta promotorinteraktioner.

Upplösningen av de interaktioner som detekteras i 3C-tekniker ges huvudsakligen av det använda restriktionsenzymet. Här beskrivs tillämpningen av liCHi-C med användning av HindIII, ett 6 bp-skärande enzym som ger en teoretisk medelupplösning på 4 096 bp. liCHi-C gör det möjligt att ersätta restriktionsenzymet till exempel mot ett 4 bp-skärande enzym eller till och med ett mikrokocknukleas, vilket ökar upplösningen av de signifikanta interaktioner som detekteras. Genereringen av liCHi-C-bibliotek, som byter HindIII-restriktionsenzymet för det 4 bp-skärande MboI-enzymet, har rapporterats ge utmärkta resultat som detekterar nästan dubbelt så många totala interaktioner, om än med förskjutning av det genomsnittliga linjära avståndet för interaktionerna detekterade ner till halva avståndet53.

När det gäller det faktiska RNA-sondanrikningssystemet är en av de främsta fördelarna med att använda denna typ av infångning över en antikroppsbaserad, såsom HiChIP32 eller HiCuT33, bland andra, förmågan att jämföra förhållanden oberoende av bindningen av proteinet, liksom att inte behöva förlita sig på tillgången på en fungerande antikropp för proteinet av intresse. Dessutom kan RNA-anrikningssystemet skräddarsys för att fånga alla specifika regioner genomomfattande för att passa varje utredares behov (designen diskuteras i35,64).

Förutom antikroppsbaserade infångningsmetoder har flera enastående encellsmetoder (såsom scHi-C 65, Dip-C 66 eller Sci-Hi-C 67 bland andra) eller låginmatningsmetoder (såsom Low-C 68 eller Easy Hi-C 69) för att undersöka 3D-genomarkitekturen utvecklats under de senaste åren. Dessa genererar emellertid glesa kontaktkartor med låg upplösning som inte tillåter identifiering av kontakter mellan distala reglerande element och målgener. liCHi-C är en metod som kan övervinna denna begränsning, vilket öppnar möjligheten att studera den promotorcentrerade genomarkitekturen i knappa celltyper och ger möjlighet att fördjupa vår förståelse för cell- och utvecklingsbiologi och sjukdomsutveckling.

Trots alla dess funktioner är liCHi-C inte undantagen från begränsningar. För det första är bearbetning av råsekvenseringsdata inte trivial, och rättvisa beräkningsfärdigheter behövs för att analysera data och tolka dess resultat. Dessutom diskriminerar liCHi-C inte mellan funktionella och strukturella interaktioner; Det krävs att liCHi-C-data integreras med epigenetiska data och/eller funktionell analys för att validera de potentiella funktionella interaktionerna mellan genpromotorer och deras målreglerande element. Slutligen offras bibliotekskomplexiteten när man arbetar i den nedre änden av cellnummer. Detta återspeglas i mängden unika interaktioner som detekteras jämfört med liCHi-C-bibliotek med högre cellantal och deras dedupliceringshastighet, som kan nå upp till 80%. LiCHi-C-bibliotek med lågt celltal behåller dock de topologiska egenskaperna hos bibliotek med högre cellnummer på ett mer brännvidd53, vilket visar att det är möjligt att utföra liCHi-C-bibliotek som rekapitulerar cellens promotorinteraktom med så lite som 50 000 celler.

Sammantaget är liCHi-C en kostnadseffektiv och anpassningsbar metod för att generera högkvalitativa och högupplösta promotorinteraktombibliotek i knappa celltyper. Det är den första metoden med låg inmatning som mappar promotorinteraktomet och anropar signifikanta loopar vid begränsningsfragmentupplösningen. Vi förutser att detta nya verktyg, som sin föregångare PCHi-C, kommer att ge nya insikter i celldifferentiering och organismutveckling, både inom hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar resten av medlemmarna från Javierre-labbet för deras feedback på manuskriptet. Vi tackar CERCA-programmet, Generalitat de Catalunya och Josep Carreras Foundation för institutionellt stöd. Detta arbete finansierades av FEDER/spanska ministeriet för vetenskap och innovation (RTI2018-094788-A-I00), European Hematology Association (4823998) och Spanish Association against Cancer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ finansieras av La Caixa Banking Foundation Junior Leader-projektet (LCF/BQ/PI19/11690001), LR finansieras av ett AGAUR FI-stipendium (2019FI-B00017) och LT-D finansieras av ett FPI-stipendium (PRE2019-088005). Vi tackar forskarutbildningen i biokemi och molekylärbiologi från Universitat Autònoma de Barcelona för sitt stöd. Ingen av finansiärerna var inblandad vid något tillfälle i den experimentella designen eller manuskriptskrivningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies - Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies -
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Tags

Genetik utgåva 194
Ett integrerat arbetsflöde för att studera den promotorcentrerade spatio-temporala genomarkitekturen i knappa cellpopulationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L.,… More

Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter