Summary
Genekspression reguleres af interaktioner mellem genpromotorer med distale regulatoriske elementer. Her beskriver vi, hvordan lavt input Capture Hi-C (liCHi-C) gør det muligt at identificere disse interaktioner i sjældne celletyper, som tidligere var umålelige.
Abstract
Spatiotemporal gentranskription er tæt reguleret af distale regulatoriske elementer, såsom forstærkere og lyddæmpere, som er afhængige af fysisk nærhed med deres målgenpromotorer for at kontrollere transkription. Selvom disse regulatoriske elementer er lette at identificere, er deres målgener vanskelige at forudsige, da de fleste af dem er celletypespecifikke og kan adskilles af hundreder af kilobaser i den lineære genomsekvens og springe over andre ikke-målgener. I flere år har Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) været guldstandarden for sammenhængen mellem distale regulatoriske elementer og deres målgener. PCHi-C er imidlertid afhængig af tilgængeligheden af millioner af celler, hvilket forbyder undersøgelse af sjældne cellepopulationer som dem, der almindeligvis opnås fra primære væv. For at overvinde denne begrænsning er der udviklet Low Input Capture Hi-C (liCHi-C), en omkostningseffektiv og tilpasselig metode til at identificere repertoiret af distale regulatoriske elementer, der styrer hvert gen i genomet. liCHi-C er afhængig af en lignende eksperimentel og beregningsmæssig ramme som PCHi-C, men ved at anvende minimale rørændringer, ændre reagenskoncentrationen og volumenerne og bytte eller eliminere trin tegner det sig for minimalt materialetab under bibliotekskonstruktion. Samlet set muliggør liCHi-C studiet af genregulering og spatiotemporal genomorganisation i forbindelse med udviklingsbiologi og cellulær funktion.
Introduction
Temporal genekspression driver celledifferentiering og i sidste ende organismeudvikling, og dens ændring er tæt forbundet med en bred overflod af sygdomme 1,2,3,4,5. Gentranskription reguleres fint af virkningen af regulatoriske elementer, som kan klassificeres som proksimale (dvs. genpromotorer) og distale (f.eks. Forstærkere eller lyddæmpere), hvoraf sidstnævnte ofte er placeret langt fra deres målgener og fysisk interagerer med dem gennem kromatinsløjfe for at modulere genekspression 6,7,8.
Identifikation af distale regulatoriske regioner i genomet er et spørgsmål, der er bred enighed om, da disse regioner har specifikke histonmodifikationer 9,10,11 og indeholder specifikke transkriptionsfaktorgenkendelsesmotiver, der fungerer som rekrutteringsplatforme for dem12,13,14. Desuden har de i tilfælde af forstærkere og superforstærkere 15,16 også lav nukleosombelægning 17,18 og transkriberes til ikke-kodende eRNA'er 19,20.
Ikke desto mindre er hvert distalt regulatorisk elements målgener vanskeligere at forudsige. Oftere end ikke er interaktioner mellem distale regulatoriske elementer og deres mål celletype og stimulusspecifikke 21,22, spænder over hundreder af kilobaser, bygger bro over andre gener i enhver retning 23,24,25 og kan endda være placeret inden for introniske regioner af deres målgen eller andre ikke-intervenerende gener 26,27. Desuden kan distale regulatoriske elementer også kontrollere mere end et gen på samme tid og omvendt28,29. Denne positionelle kompleksitet forhindrer lokalisering af regulatoriske sammenhænge mellem dem, og derfor forbliver de fleste af hvert regulatorisk elements mål i hver celletype ukendte.
I de senere år har der været et betydeligt boom i udviklingen af kromosomkonformationsfangstteknikker (3C) til undersøgelse af kromatininteraktioner. Den mest anvendte af dem, Hi-C, gør det muligt at generere et kort over alle interaktioner mellem hvert fragment af en celles genom30. For at detektere signifikante interaktioner på restriktionsfragmentniveau er Hi-C imidlertid afhængig af ultradyb sekventering, der forbyder dets anvendelse til rutinemæssigt at studere det regulatoriske landskab af individuelle gener. For at overvinde denne økonomiske begrænsning er der opstået flere berigelsesbaserede 3C-teknikker, såsom ChIA-PET31, HiChIP 32 og dets lavinput-modstykke HiCuT33. Disse teknikker afhænger af brugen af antistoffer til at berige genom-dækkende interaktioner medieret af et specifikt protein. Ikke desto mindre er det unikke træk ved disse 3C-teknikker også bandet ved deres anvendelse; Brugere regner med tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet til proteinet af interesse og kan ikke sammenligne forhold, hvor proteinets binding er dynamisk.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) er en anden berigelsesbaseret 3C-teknik, der omgår disse begrænsninger34,35. Ved at anvende et biotinyleret RNA-sondeberigelsessystem er PCHi-C i stand til at generere genomdækkende højopløsningsbiblioteker af genomiske regioner, der interagerer med 28.650 menneske- eller 27.595 museannoterede genpromotorer, også kendt som promotorinteraktomet. Denne tilgang gør det muligt at detektere signifikante langtrækkende interaktioner ved opløsningen på restriktionsfragmentniveau for både aktive og inaktive promotorer og robust sammenligne promotorinteraktomer mellem enhver tilstand uafhængigt af dynamikken i histonmodifikationer eller proteinbinding. PCHi-C er blevet brugt i vid udstrækning i de senere år til at identificere promotorinteraktomreorganiseringer under celledifferentiering 36,37, identificere virkningsmekanismen for transkriptionsfaktorer38,39 og opdage nye potentielle gener og veje dereguleret i sygdom af ikke-kodende varianter 40,41,42,43,44,45,46,47,48, sammen med nye driver-ikke-kodende mutationer49,50. Desuden kan denne teknik ved blot at ændre fangstsystemet tilpasses i henhold til det biologiske spørgsmål for at forhøre ethvert interaktom (f.eks. Forstærkerinteraktomet 51 eller interaktomet af en samling ikke-kodende ændringer41,52).
PCHi-C er imidlertid afhængig af mindst 20 millioner celler til at udføre teknikken, hvilket forhindrer undersøgelse af knappe cellepopulationer som dem, der ofte bruges i udviklingsbiologi og kliniske applikationer. Af denne grund har vi udviklet Low Input Capture Hi-C (liCHi-C), en ny omkostningseffektiv og tilpasselig metode baseret på PCHi-C's eksperimentelle ramme til at generere promotorinteraktomer med høj opløsning med lavcelleinput. Ved at udføre eksperimentet med minimale rørændringer, bytte eller eliminere trin fra den originale PCHi-C-protokol, drastisk reducere reaktionsvolumener og ændre reagenskoncentrationer maksimeres bibliotekets kompleksitet, og det er muligt at generere biblioteker af høj kvalitet med så lidt som 50.000 celler53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) er blevet benchmarket mod PCHi-C og brugt til at belyse promotorinteraktom-rewiring under human hæmatopoietisk celledifferentiering, opdage potentielle nye sygdomsassocierede gener og veje dereguleret af ikke-kodende ændringer og detektere kromosomale abnormiteter53. Den trinvise protokol og de forskellige kvalitetskontroller gennem teknikken er detaljeret her indtil den endelige generation af bibliotekerne og deres beregningsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For at sikre minimalt materialetab skal du (1) arbejde med DNA-lavbindende rør og spidser (se materialetabellen), (2) placere reagenser på rørvæggen i stedet for at indføre spidsen inde i prøven og (3) om muligt blande prøven ved invertering i stedet for at pipettere prøven op og ned og dreje ned bagefter for at genvinde prøven.
1. Cellefiksering
- Celler, der vokser i suspension
- Høst 50.000 til en million celler og placer dem i et DNA-lavbindende 1,5 ml rør.
BEMÆRK: De celletyper, der er anvendt til denne undersøgelse, er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater. - Cellerne centrifugeres i 5 minutter ved 600 x g (ved 4 °C) ved hjælp af en rotorcentrifuge med fast vinkel, og supernatanten fjernes ved pipettering.
- Resuspender cellerne i 1 ml RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved stuetemperatur.
- Tilsæt 143 μL methanolfri 16% formaldehyd for at nå en koncentration på 2% og bland.
- Inkuber cellerne i 10 minutter, mens de roterer ved stuetemperatur for at fiksere cellerne.
BEMÆRK: Prøv at være så nøjagtig som muligt med 10 minutters inkubation. Over- eller underfiksering af cellerne kan føre til et fald i bibliotekets kvalitet. - Reaktionen slukkes ved at tilsætte 164 μL iskold 1 M glycin og blandes. Inkuber cellerne i 5 minutter, roterende ved stuetemperatur.
- Yderligere inkuberes cellerne i 15 minutter på is, blandes ved inversion hvert ~ 5 minut.
- Cellerne centrifugeres i 10 minutter ved 1 000 x g (ved 4 °C) ved hjælp af en rotorcentrifuge med fast vinkel, og supernatanten fjernes.
- Vask cellerne ved at resuspendere pelleten i 1 ml iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Cellerne centrifugeres i 10 minutter ved 1.000 x g (ved 4 °C), og supernatanten fjernes.
BEMÆRK: De pelleterede celler kan lynfryses i flydende nitrogen eller tøris og opbevares ved -80 °C.
- Høst 50.000 til en million celler og placer dem i et DNA-lavbindende 1,5 ml rør.
- Klæbende celler
- Cellerne i dyrkningsskålen vaskes med 1x PBS.
- Forbered nok RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og methanolfri 2% formaldehyd ved stuetemperatur til at dække kulturskålen.
- Tilsæt det supplerede medie til kulturskålen med cellerne og inkuber i 10 minutter, gyng ved stuetemperatur for at fikse cellerne.
BEMÆRK: Prøv at være så nøjagtig som muligt med 10 minutters inkubation. Over- eller underfiksering af cellerne kan føre til et fald i bibliotekets kvalitet. - Sluk reaktionen ved at tilsætte 1 M glycin indtil 0,125 M og bland ved at rocke.
- Inkuber cellerne i 5 min, gyng ved stuetemperatur.
- Yderligere inkuberes cellerne i 15 minutter ved 4 °C, blandes ved at rocke hvert 3.-4. minut.
- Fjern mediet og vask cellerne med kold 1x PBS.
- Skrab cellerne og overfør dem til et 1,5 ml DNA lavbindingsrør. Tør kulturskålen af med 0,5-1 ml kold 1x PBS.
- Cellerne centrifugeres i 10 minutter ved 1 000 x g (ved 4 °C) ved hjælp af en rotorcentrifuge med fast vinkel, og supernatanten fjernes. De pelleterede celler kan lynfryses i flydende nitrogen eller tøris og opbevares ved -80 °C.
2. Lysis og fordøjelse
- Resuspender cellerne i 1 ml kold lysisbuffer (tabel 1) for at forstyrre cellemembranen. Tilsætningen af bufferen alene bør være tilstrækkelig til at resuspendere cellerne, men de kan om nødvendigt resuspenderes yderligere ved let hvirvelstrøm.
- Inkuber på is i 30 minutter, bland ved inversion hver ~ 5 min. Kernerne centrifugeres i 10 minutter ved 1 000 x g (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Resuspender kernerne med 500 μL kold 1,25x restriktionsbuffer 2 (se materialetabel).
- Kernerne centrifugeres i 10 minutter ved 1 000 x g (ved 4 °C), og supernatanten fjernes. Resuspender kernerne i 179 μL af 1,25x restriktionsbuffer 2.
- Tilsæt 5,5 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS; se materialetabel) og bland. Cellerne kan danne klumper; Dette er normalt og skal opdeles så meget som muligt ved hvirvelstrøm. Prøven inkuberes i 1 time ved 37 °C i en termoblok under omrystning ved 950 o/min.
- Sluk SDS ved at tilsætte 37,5 μL 10% Triton X-100 og bland. Prøven inkuberes i 1 time ved 37 °C i en termoblok under omrystning ved 950 o/min.
- Kromatinet fordøjes ved tilsætning af 7,5 μL hindIII (100 E/μL; se materialetabel) og blandes. Prøven inkuberes natten over ved 37 °C i en termoblok under omrystning ved 950 o/min.
- Næste morgen tilsættes yderligere 2,5 μL HindIII (100 E/μL), og prøven inkuberes yderligere i 1 time ved 37 °C i en termoblok under omrystning ved 950 o/min for at sikre korrekt kromatinfordøjelse.
BEMÆRK: Som en del af fordøjelseseffektivitetskontrollerne (se trin 5.1) overføres det, der svarer til 20.000 til 40.000 kerner, til et andet rør for at repræsentere den ufordøjede kontrol. Efter fordøjelsen overføres det samme antal celler til et andet rør igen for at repræsentere den fordøjede kontrol. Det anbefales at teste fordøjelseseffektiviteten som et separat forsøg, hvis tilgængeligheden af udgangsmaterialet er knap.
3. Ligering og decrosslinking
- Afkøl prøven på is. Forbered en mastermix og tilsæt følgende reagenser for at udfylde og biotinylate restriktionsfragmentets overhæng: 3 μL 10x restriktionsbuffer 2, 1 μL nukleasefrit vand, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotin-14-dATP og 5 μL 5 U / μL Klenow (se materialetabel). Prøven inkuberes i 75 minutter ved 37 °C, blandes omvendt for hver ~15 minutter.
- Afkøl prøven på is. Forbered en mastermix og tilsæt følgende reagenser for at ligere de udfyldte DNA-ender: 50 μL 10x ligeringsbuffer, 2,5 μL 20 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 12,5 μL 1 U/μL T4 DNA-ligase og 173 μL nukleasefrit vand (se materialetabel).
- Prøven inkuberes i 4-6 timer ved 16 °C, blandes ved invertering hver ~1 time. Derefter inkuberes prøven i 30 minutter ved stuetemperatur. Chromatinet krydsbindes ved at tilsætte 30 μL 10 mg/ml proteinase K og blandes. Prøven inkuberes natten over ved 65 °C.
- Den følgende morgen tilsættes yderligere 15 μL 10 mg/ml proteinase K, og prøven inkuberes yderligere i 2 timer ved 65 °C for at sikre korrekt kromatintværbinding.
4. DNA-oprensning
- Prøven afkøles til stuetemperatur og overføres til et egnet rør til phenol-chloroformrensning.
- Der tilsættes 1 rumfang (545 μL) phenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) for at rense DNA'et og blandes ved kraftig omrystning.
- Centrifuger prøven i 5 minutter ved 12.000 x g ved stuetemperatur, og overfør den øvre vandige fase (545 μL) til et 2 ml DNA-lavbindingsglas.
- Følgende reagenser tilsættes for at udfælde DNA'et: 1,362,5 μL 100% ethanol nedkølet til -20 °C, 54,5 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 2 μL 15 mg/ml glykogen som coprecipitant.
- Der inkuberes i 1 time ved -80 °C eller natten over ved -20 °C.
- Prøven centrifugeres i 30 minutter ved 16.000-21.000 x g ved 4 °C, og supernatanten fjernes. DNA-pillen skal være synlig.
- Vask pillen ved at tilsætte 1 ml 70% ethanol, hvirvel og centrifugere i 10 min ved 16.000-21.000 x g ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes og pellets lufttørres. DNA-pellet resuspenderes i 130 μL nukleasefrit vand.
- Vurder koncentrationen ved fluorometrisk kvantificering (se materialetabel). Det rensede 3C-materiale opbevares ved -20 °C i flere måneder, før protokollen fortsættes.
5. Valgfri kvalitetskontrol
- Vurder fordøjelseseffektiviteten. Der udføres tværbinding og phenol:chloroform-DNA-oprensning som beskrevet tidligere til de ufordøjede og fordøjede kontroller, der er opnået i trin 2.13. DNA-pellet resuspenderes i 10 μL nukleasefrit vand. Koncentrationen kvantificeres, og det opnåede DNA fortyndes om nødvendigt til 4 ng/μL.
- Udfør kvantitativ PCR med 4 ng DNA fra både de ufordøjede og fordøjede kontroller, med primere, der spænder over et åbent kromatinsted med og uden et HindIII-mål (se tabel 2 for primerdesign). Beregn effektiviteten af fordøjelsen efter en tidligere offentliggjort rapport35.
BEMÆRK: Effektiviteten af ligering beregnes som en procentdel ved hjælp af formlen: fordøjelse (%) = 100 -100/(2^[(Ct fordøjet med HindIII - Ctdigested uden HindIII) - (Ct ufordøjet med HindIII - Ct ufordøjet uden HindIII)]) (se tabel 3), som tager højde for forskellen mellem de forskellige Cts opnået for hvert primerpar i de ufordøjede og fordøjede kontroller. - Vurder følsomheden af interaktionsdetekteringen ved at udføre konventionel polymerasekædereaktion (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm både F + R-primere, 0,1 og U / μL varmstartpolymerase) med primere, der spænder over både lang- og kortrækkende celle-invariante interaktioner (se tabel 2 for primerdesign). Brug 50-100 ng 3C-materiale (til henholdsvis kort- og langdistanceinteraktioner) og forstærk ved hjælp af følgende betingelser: 98 °C i 15 minutter efterfulgt af 37 cyklusser med 98 °C i 30 sekunder, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 min, og afslut med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
BEMÆRK: Hvis mængden af opnået DNA er mindre end 2 μg, skal du kun kontrollere en lang- og en kortrækkende interaktion i stedet for hele interaktionspanelet. - Kør produktet på 1x tris-borat-EDTA (TBE) ved hjælp af 1,6% agarosegel og se efter tilstedeværelsen af den tilsvarende PCR-amplikon54.
BEMÆRK: På grund af den uforudsigelige "klipning og indsættelse" af genomet kan der forekomme uspecifikke bånd. Så længe den korrekte båndstørrelse overholdes, tælles den som korrekt. - Vurder effektiviteten af biotinfyldning og ligering ved differentielt at fordøje et PCR-produkt med kort rækkevidde med HindIII, NheI (se materialetabel), begge enzymer eller ingen (vand) og køre produktet på en 1x TBE 1,6% agarosegel. En korrekt udfyldning og ligering eliminerer det tidligere HindIII-mål og opretter et nyt NheI-mål, så amplikonen skal kun skæres i nærværelse af NheI.
BEMÆRK: For at minimere materialetab skal du hente 2,5 μL af et PCR-produkt med kort rækkevidde fra interaktionskontrollerne og forstærke det fem gange for at udføre udfyldnings- og ligeringskontrollerne.
6. Sonikering
- Overfør 130 μL af prøven (fyld op med nukleasefrit vand, hvis noget blev brugt til kontrollerne) til en kuvette, der er egnet til sonikering.
- Opret en vandbad sonikator og sonikere ved hjælp af følgende parametre (optimeret til modellen og kuvetterne beskrevet i materialetabellen): driftsfaktor: 20%; maksimal indfaldseffekt: 50; cyklusser pr. burst: 200; tid: 65 s; og temperaturområde: 6-10 °C (8 °C optimalt).
- Overfør prøven til et nyt 1,5 ml DNA-lavbindingsrør.
7. Slutreparation
- Forbered en mastermix og tilsæt følgende reagenser for at reparere DNA-fragmenternes ujævne ender skabt under sonikeringen: 18 μL 10x ligeringsbuffer, 18 μL 2,5 mM dNTP-blanding hver, 6,5 μL 3 U / μL T4 DNA-polymerase, 6,5 μL 10 U / μL T4 PNK og 1,3 μL 5 U / μL Klenow (se materialetabel).
- Prøven inkuberes i 30 minutter ved 20 °C, og den fyldes op med Tris-lav EDTA-buffer (TLE) (se tabel 1) til 300 μL.
8. Biotin pull-down
- Overfør 150 μL C1 streptavidinperler (se materialetabel) pr. prøve til et 1,5 ml rør, læg dem på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen. Supernatanten fjernes og efterlader perlerne.
- Perlerne vaskes med 400 μL 1x Tween-buffer (TB; se tabel 1). For at vaske perlerne skal du tilføje bufferen og resuspendere dem ved blød hvirvelstrøm. Sæt røret tilbage i magneten og vent 2-3 min, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen. Supernatanten fjernes og efterlader perlerne.
- Perlerne vaskes med 300 μL 1x no Tween-buffer (NTB; se tabel 1). Opslæmm perlerne i 300 μL 2x NTB (se tabel 1).
BEMÆRK: Perlerne kan danne et støvet lag omkring rørvæggen, når de vaskes med buffere uden vaskemiddel. Dette er normalt og påvirker ikke resultatet af protokollen. - Disse 300 μL perler kombineres i 2x NTB med prøvens 300 μL. Inkuber i 15 minutter, drej ved stuetemperatur for at trække de informative DNA-fragmenter ned med biotin. Biblioteket sidder nu fast på C1 streptavidinperlerne.
- Vask perlerne med 400 μL 1x NTB. Puds perlerne med 100 μL TLE-buffer og opslæv dem derefter igen i 35,7 μL TLE-buffer.
9. dATP-tailing, adapterligering og PCR-forstærkning
- Der fremstilles en mastermix, og der tilsættes følgende reagenser til prøven for at dATP-hale enderne af de reparerede DNA-fragmenter: 5 μL 10x restriktionsbuffer 2, 2,3 μL 10 mM dATP og 7 μL 5 U/μL Klenow exo-. Prøven inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Inaktiver Klenow exo- ved yderligere at inkubere prøven i 10 minutter ved 65 °C. Afkøl prøven på is. Vask perlerne med 300 μL 1x TB. Vask perlerne med 300 μL 1x NTB.
- Vask perlerne med 100 μL 1x ligeringsbuffer og genophæng dem derefter i 50 μL 1x ligeringsbuffer. Der tilsættes 4 μL 15 μM forudglødet adapterblanding (se tabel 2) og 1 μL 2.000 E/μL T4 DNA-ligase (se materialetabel) til prøven.
- Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur. Vask perlerne med 400 μL 1x TB. Vask perlerne med 200 μL 1x NTB. Vask perlerne med 100 μl 1x restriktionsbuffer 2.
- Perlerne vaskes med 50 μL 1x restriktionsbuffer 2 og opslæmmes derefter igen i 50 μL 1x restriktionsbuffer 2.
- Bland følgende reagenser for at forberede PCR-reaktionen for at forstærke biblioteket: 50 μL perler med biblioteket, 250 μL 2x PCR-mastermix med enzym, 12 μL F + R-primere (25 μM hver; se tabel 2) og 188 μL nukleasefrit vand.
- Udfør PCR med følgende betingelser (opdel PCR-reagensblandingen i 50 μL reaktioner): 98 °C i 40 s, efterfulgt af X-cyklusser på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, og afslut med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
BEMÆRK: Brug følgende antal cyklusser som udgangspunkt for optimering af protokollen i diploide celler, der sigter mod et output på 500-1.000 ng før biblioteksoptagelse: en million celler i otte cyklusser; 250.000 celler i 10 cyklusser; 50.000 celler i 12 cyklusser. - Saml alle 50 μL reaktioner fra den samme prøve i et 1,5 ml DNA lavbindende rør, placer det på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen.
- Supernatanten indeholdende biblioteket (500 μL) overføres til et nyt 1,5 ml DNA-lavbindingsglas. Fyld op med TLE-buffer til 500 μL, hvis noget af supernatanten er gået tabt. C1 streptavidin perler er ikke længere nødvendige.
- Udfør et dobbeltsidet valg55 ved hjælp af paramagnetisk perlerensning (0,4-1 volumen). Dette muliggør selektiv eliminering af for store (>1.000 bp) og for små fragmenter eller PCR-primere (<200 bp) afhængigt af koncentrationen af polyethylenglycol og salt af de tilsatte paramagnetiske perler.
- Tilsæt 200 μL (0,4 volumen) lagerperler til biblioteket og bland ved hvirvelstrøm. Inkuber i 10 min, drej ved stuetemperatur.
- Sæt på en magnet, vent 2-3 min, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen, og overfør supernatanten indeholdende biblioteket (uden de større fragmenter) til et nyt 1,5 ml DNA lavbindingsrør.
- Koncentrer perlerne ved at tage 750 μL stamperler, læg dem i et 1,5 ml rør på en magnet, vent i 2-3 minutter, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen, fjern supernatanten, og ophæng perlerne igen ved hvirvlen i 300 μL nye stamperler.
- Der tilsættes disse 300 μL koncentrerede perler til prøven (1 volumen) og blandes ved hvirvelstrøm. Inkuber i 10 min, drej ved stuetemperatur. Sæt på en magnet, vent 2-3 min, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen, og fjern supernatanten (indeholdende de mindre fragmenter og PCR-primere).
- Vask perlerne tre gange med 1 ml 70% ethanol. For at gøre dette tilsættes ethanolen, mens røret med perlerne stadig er på magneten, forsøger ikke at forstyrre perlerne og vente i 30-60 s. Derefter fjernes supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Lad perlerne lufttørre, og opslæm dem igen i 21 μL TLE-buffer ved hvirvelstrøm.
BEMÆRK: Overdreven tørring af perlerne kan reducere udbyttet ved eluering af DNA'et. Målet er at resuspendere dem i TLE-buffer umiddelbart efter, at de ikke længere er "skinnende" fra ethanolen. - Prøven inkuberes i 10 minutter ved 37 °C i en termoblok for at eluere biblioteket fra perlerne. Tuben anbringes i en magnet, og supernatanten indeholdende biblioteket overføres til et nyt 1,5 ml DNA-lavbindingsglas.
- Kvantificer størrelse og koncentration ved automatiseret elektroforese (se materialetabel). Renset Hi-C-materiale kan opbevares ved -20 °C i flere måneder, før protokollen fortsættes.
10. Optagelse af bibliotek
- Arbejd med 500-1.000 ng af biblioteket. Koncentrer biblioteket ved at tørre DNA'et ved hjælp af en vakuumkoncentrator og resuspendere materialet i 3,4 μL nukleasefrit vand.
- Følgende blokkere fra målberigelsessættet (se materialetabellen) tilsættes prøven: 2,5 μL blokering 1, 2,5 μL blokering 2 og 0,6 μL brugerdefineret oligoblokker til adapterne.
- Resuspender grundigt, overfør opløsningen til en 0,2 ml PCR-strimmel og inkuber i en termocyklisk maskine i 5 minutter ved 95 °C, efterfulgt af 5 minutter ved 65 °C med et opvarmet låg. Røret inkuberes ved 65 °C.
- Hybridiseringsopløsningen fremstilles ved at kombinere følgende reagenser fra målberigelsessættet (se materialetabellen) pr. prøve (13 μL). Opbevares på bænken ved stuetemperatur: 6,63 μL Hyb 1, 0,27 μL Hyb 2, 2,65 μL Hyb 3 og 3,45 μL Hyb 4.
- 0,5 μL RNase-blok fortyndes fra målberigelsessættet med 1,5 μL nukleasefrit vand pr. prøve. 5 μL af det biotinylerede RNA pr. prøve på is optøs, og der tilsættes 2 μL af den fortyndede RNase-blok. Opbevares på bænken ved stuetemperatur.
- Tilsæt 13 μL af hybridiseringsopløsningen til 7 μL af det biotinylerede RNA med RNase og bland godt.
- Mens du er på termocykleren ved 65 °C, overføres hybridiseringsopløsningen med det biotinylerede RNA (20 μL) til det blokerede bibliotek. Luk rørlåget godt og inkuber i termocyklisten natten over ved 65 °C.
BEMÆRK: For at minimere prøvefordampning (hvilket kan føre til suboptimal RNA-DNA-hybridisering), når du udfører flere prøver på samme tid, skal du bruge en multikanalpipette til at overføre det biotinylerede RNA til hvert bibliotek på samme tid.
11. Biotin-pull-down og PCR-forstærkning
- Overfør 50 μL T1 streptavidinperler pr. prøve til et 1,5 ml DNA lavbindende rør, placer dem på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen. Supernatanten fjernes og efterlader perlerne. Perlerne vaskes tre gange med 200 μL af bindingsbufferen fra målberigelsessættet.
- Opslæmning af perlerne resuspenderes i 200 μL bindingsbuffer. Mens den er på termocyklisten ved 65 °C, overføres prøven til de resuspenderede T1 streptavidinperler og inkuberes i 30 minutter og roterer ved stuetemperatur.
- Vask perlerne med 200 μL vaskebuffer 1 fra målberigelsessættet. Inkuber i 15 min, drej ved stuetemperatur. Perlerne vaskes tre gange med 200 μL vaskebuffer 2 fra målberigelsessættet opvarmet til 65 °C. Der inkuberes i 10 minutter ved 65 °C i en termoblok under omrystning ved 300 o/min mellem vaskene.
- Perlerne vaskes med 200 μL 1x restriktionsbuffer 2 og resuspenderes derefter igen i 30 μL 1x restriktionsbuffer 2.
- Bland følgende reagenser for at forberede PCR-reaktionen for at forstærke biblioteket: 30 μL perler med biblioteket, 150 μL 2x PCR-mastermix med enzym, 7,2 μL F + R-primere (25 μM hver; se tabel 2) og 112,8 μL nukleasefrit vand.
- Udfør PCR med følgende betingelser (opdel PCR-reagensblandingen i 50 μL reaktioner): 98 °C i 40 s, efterfulgt af fire cyklusser på 98 °C i 10 s, 65 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, og afslut med 72 °C i 10 minutter. Hold ved 4 °C.
- Saml alle 50 μL reaktioner fra den samme prøve i et 1,5 ml DNA lavbindende rør, placer det på en 1,5 ml rørmagnet, og vent 2-3 minutter, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen.
- Supernatanten indeholdende biblioteket (300 μL) overføres til et nyt 1,5 ml DNA-lavbindingsglas. Fyld op med TLE-buffer til 300 μL, hvis noget af supernatanten er gået tabt. T1 streptavidin perler er ikke længere nødvendige.
- Udfør en DNA-oprensning ved hjælp af paramagnetiske perler (0,9 volumener; se materialetabel). Der tilsættes 270 μL stamperler til prøven og blandes ved hvirvelstrøm.
- Inkuber i 10 min, drej ved stuetemperatur.
- Sæt en magnet på, vent 2-3 min, eller indtil alle perlerne sidder fast på væggen, og fjern supernatanten.
- Vask perlerne tre gange med 1 ml 70% ethanol. For at gøre dette skal du tilføje ethanolen, mens røret med perlerne stadig er på magneten, forsøger ikke at forstyrre perlerne og vente 30-60 s. Derefter fjernes supernatanten uden at forstyrre perlerne.
- Lad perlerne lufttørre, og opslæm dem igen i 21 μL TLE-buffer ved hvirvelstrøm.
BEMÆRK: Overdreven tørring af perlerne kan reducere udbyttet ved eluering af DNA'et. Målet er at resuspendere dem i TLE-buffer umiddelbart efter, at de ikke længere er "skinnende" fra ethanolen. - Prøven inkuberes i 10 minutter ved 37 °C i en termoblok for at eluere biblioteket fra perlerne.
- Tuben anbringes i en magnet, og supernatanten indeholdende biblioteket overføres til et nyt 1,5 ml DNA-lavbindingsglas.
- Kvantificer størrelsen og koncentrationen ved automatiseret elektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
liCHi-C giver mulighed for at generere genominteraktombiblioteker af høj kvalitet og opløsning med hele genomet med så lidt som 50.000 celler53. Dette opnås ved – ud over den drastiske reduktion af reaktionsvolumener og brugen af DNA-lavbindende plastvarer i hele protokollen – at fjerne unødvendige trin fra den oprindelige protokol, hvor der forekommer betydelige materielle tab. Disse omfatter phenolrensning efter decrosslinking, biotinfjernelse og efterfølgende phenol-chloroformrensning og ethanoludfældning. Derudover giver omorganisering af trinnene i Hi-C-bibliotekets forberedelse (biotin-pulldown, A-tailing, adapterligering, PCR-forstærkning og dobbeltsidet paramagnetisk perlevalg - også som PCR-produktrensning) os mulighed for at fjerne endnu et unødvendigt DNA-oprensningstrin. En oversigt over den eksperimentelle arbejdsgang findes i figur 1A.
For at vurdere bibliotekskvaliteten udføres flere kontroller i hele protokollen, hvoraf den første er beregningen af genomfordøjelseseffektivitet; værdier over 80% betragtes som acceptable (tabel 3). Kontrol af fordøjelseseffektiviteten af celletypen i et separat eksperiment foreslås for ikke at miste en betydelig mængde materiale fra et enkelt liCHi-C-eksperiment. For det andet, før sonikering og slutreparation, anbefales det at kontrollere følsomheden af interaktionsdetektion ved at forstærke celletype invariante kromatininteraktioner ved konventionel PCR (figur 1B). Hvis det specifikke produkt detekteres, skal der udføres en tredje kontrol med fokus på effektiviteten af biotinylering og ligering ved differentiel fordøjelse af et af de tidligere opnåede PCR-produkter med hindIII og NheI (figur 1C, D). Når du fylder et fordøjet HindIII-begrænsningssted og ligerer det med en anden, genereres et nyt NheI-begrænsningssted i stedet for at regenerere det originale HindIII-sted. Derfor bør fordøjelsen af PCR-amplikon kun observeres, når NheI er til stede. Endelig, lige før og efter hele optagelsen, skal koncentrationen og størrelsesfordelingen kontrolleres ved hjælp af automatiseret elektroforese. Pre-capture biblioteksforstærkning skal sigte mod at opnå 500-1.000 ng Hi-C-materiale, den nøjagtige mængde, der er nødvendig for at udføre RNA-sondeoptagelsen, da overdreven forstærkning af både det præ- og post-fangede bibliotek fører til en høj procentdel af PCR-duplikater og det deraf følgende tab af sekventeringslæsninger under analysen. Biblioteker kan forstærkes igen under de samme betingelser, hvis der ikke opnås nok materiale under den første konservative PCR-forstærkning. Mængden af post-fanget biblioteksmateriale kan variere, men som tommelfingerregel bør det være cirka ti gange til 20 gange mindre end før optagelsen. Bibliotekets størrelsesfordeling bør falde omkring 450-550 bp (figur 2A, B), uforanderlig mellem præ- og post-fangede biblioteker. Samlet set sikrer korrekte resultater af disse kontroller generering af fremragende liCHi-C-biblioteker.
Færdige liCHi-C-biblioteker sekventeres og analyseres derefter (mindst) 100 bp parret. Rå sekventeringsdata53 behandles ved hjælp af HiCUP-pipeline56 til kortlægning og filtrering af artefakter. Den ideelle HiCUP-rapport viser en femdobbelt til ti gange stigning i fordelingen af cis (inde i det samme kromosom) sammenlignet med trans (mellem forskellige kromosomer) parrede endelæsninger, som beskrevet tidligere i henhold til in-nucleus ligation Hi-C57 (figur 3B). Opnåelsen af mere end 100 millioner unikke, gyldige læsninger efter fjernelse af PCR-duplikater er nok til at gå videre til følgende trin i analysen (figur 3B), som er at vurdere fangsteffektiviteten. Parrede aflæsninger, hvor ingen af deres ender kortlægges i et fanget restriktionsfragment af RNA-sondeberigelsessystemet, kasseres, idet kun dem, der repræsenterer cellens promotorinteraktom (dvs. de læsninger, hvor mindst en af deres ender kortlægges i restriktionsfragmenter, der indeholder en eller flere genpromotorer [figur 3C], ideelt set mere end 60%).
Endelig kaldes signifikante interaktioner med CHiCAGO-rørledningen, som beskrevet i58,59. To eller flere biologiske replikater er nødvendige for det endelige sæt signifikante promotorinteraktioner. Datakvaliteten kan også valideres ved hjælp af principal component analysis (PCA), da biologiske replikater skal klynge sig sammen, og celletyper skal adskilles. For eksempel ved at analysere liCHi-C-datasæt fra fire forskellige primære celletyper fra det humane hæmatopoietiske træ (almindelige myeloide forfædre, monocytter, megakaryocytter og erythroblaster) kan vi observere i en PCA, at liCHi-C-biblioteker klynger sig på en udviklingsbanereflekterende måde (figur 3D). En nærmere undersøgelse af de signifikante interaktioner, der er påvist for de fire celletyper, afslører, at promotorinteraktomer er celletypespecifikke og dynamiske under celleudvikling. For eksempel viser AHSP-genet, en nøglechaperon syntetiseret i erythroidforløbere, der overvåger den korrekte foldning af hæmoglobin60,61,62, en gevinst af interaktioner med potentielt aktive regulatoriske elementer (dvs. H3K27ac og H3K4me1 berigede regioner) i erythroblaster, men ikke i andre celletyper (figur 4). Dette viser, at liCHi-C-metoden kan afdække potentielle regulatoriske interaktioner i sjældne celletyper.
Figur 1: Protokoloversigt og kvalitetskontrol af prøven før sonikering . (A) Skematisk oversigt over liCHi-C-protokollen divideret med dage. B og blå hænder repræsenterer henholdsvis biotinmolekyler og trin, hvor man sikkert kan stoppe protokollen i en lang periode. B) Repræsentative resultater af 3C-interaktionskontrollerne. Begge interaktionssæt for menneske (venstre) og mus (højre) vises. De bånd, du kan forvente, er markeret med mørkeblå, mens et uspecifikt bånd er markeret med lyseblåt. (C) Repræsentative udfyldnings- og ligeringskontroller ved hjælp af "Dekker" humant interaktionsprimerpar. Båndet skæres kun i bane 2 og 3, hvor NheI tilføjes. (D) Skematisk gengivelse af genereringen af et nyt NheI-begrænsningssted under udfyldning og ligering af et hindIII-begrænsningssted. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative automatiserede elektroforeseprofiler fra biblioteker før og efter optagelse. (A) Automatiseret elektroforeseprofil fra et bibliotek lige før optagelse. Den samlede mængde DNA opnået er 994 ng (49,7 ng / μL i 20 μL). (B) Højfølsom automatiseret elektroforeseprofil fra et færdigt liCHi-C-bibliotek. Prøven fyldes halvt fortyndet for at bevare så meget materiale som muligt. Den samlede mængde DNA opnået er 61,2 ng (1,53 ng/μL i 20 μL x2 for at tage højde for fortyndingen). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativt HiCUP-pipelineoutput og prøvereplikat klyngedannelse ved PCA . (A) Klassificering af gyldigheden af læsepar i procent og samlet antal. Ugyldige læsepar underklassificeres efter den eksperimentelle artefakttype. B) Deduplikeringsprocenter og klassificering af interaktionstyperne. CIS-interaktioner er yderligere underklassificeret som cis-close (mindre end 10 kb) og cis-far (mere end 10 kb). C) Procentdel af opsamlingseffektivitet. Optagne læsepar underklassificeres yderligere, uanset om den ene ende, den anden eller begge indeholder en eller flere promotorer. (D) Hovedkomponentanalyse af CHiCAGO-signifikante interaktionsscorer fra begge replikater af liCHi-C-biblioteker fra almindelige myeloide progenitorer (CMP), erythroblaster, megakaryocytter og monocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: AHSP-interaktionslandskab i humane primære hæmatopoietiske celler. Repræsentativt eksempel på AHSP-promotorcentreret interaktionslandskab i almindelige myeloide stamfædre (CMP), erythroblaster (Ery), megakaryocytter (MK) og monocytter (Mon) som set i WashU Epigenome Browser63. Buer repræsenterer betydelige interaktioner. Den mørkeblå skygge viser AHSP-genpromotoren, mens de lyseblå nuancer overlapper potentielle aktive regulatoriske elementer, der interagerer specifikt med AHSP-promotoren i erythroblaster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Buffersammensætning og -forberedelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: PCR-primere og adaptersekvenser. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Eksempel på beregning af fordøjelseseffektiviteten. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
liCHi-C giver mulighed for at generere interaktombiblioteker med høj opløsning ved hjælp af en lignende eksperimentel ramme fra PCHi-C'er, men med et stærkt reduceret celleantal. Dette opnås i høj grad ved at eliminere unødvendige trin, såsom phenolrensning og biotinfjernelse. I den klassiske in-nucleus ligation Hi-C protokol57 og dens efterfølgende afledte teknik PCHi-C fjernes biotin fra ikke-ligerede restriktionsfragmenter for at undgå at trække DNA-fragmenter ned, der efterfølgende er uinformative. At springe denne del over og dens efterfølgende DNA-oprensning oversættes ikke til en signifikant reduktion i procentdelen af gyldige aflæsninger (figur 3A), mens potentielle DNA-spildende trin, som er DNA-oprensninger, skæres ud. Omorganiseringen af Hi-C-bibliotekets forberedelse efter sonikering gør det muligt at springe endnu en unødvendig rensning over ved at bruge det dobbeltsidede valg som selve rensningstrinnet. Alt dette forbedrer hele protokollens ydeevne ved at anvende minimale rørændringer, og sammen med reduktionen i reaktionsvolumen, ændringer i reagenskoncentration og brugen af DNA-lavbindende plastvarer er det, der tillader generering af biblioteker af høj kvalitet ved hjælp af så lidt som 50.000 celler. Det er vigtigt at huske på, at startcellenummeret delvist bestemmer antallet af signifikante interaktioner på grund af bibliotekets kompleksitet. Selvom biblioteker, der genereres med 50.000 celler, bevarer de celletypespecifikke og invariante topologiske træk ved mere komplekse biblioteker53, er vores anbefaling at bruge, hvis det er muligt, over 100.000 celler pr. biologisk replikat for at fange et højere antal signifikante promotorinteraktioner.
Opløsningen af de interaktioner, der påvises i 3C-teknikker, er i det væsentlige givet af det anvendte restriktionsenzym. Her beskrives anvendelsen af liCHi-C ved hjælp af HindIII, et 6 bp-skærende enzym, der giver en teoretisk middelopløsning på 4.096 bp. liCHi-C gør det muligt at erstatte restriktionsenzymet for eksempel mod et 4 bp-skærende enzym eller endda en mikrokoknukylase, hvilket øger opløsningen af de detekterede signifikante interaktioner. Genereringen af liCHi-C-biblioteker, der skifter HindIII-restriktionsenzymet til det 4 bp-skærende MboI-enzym, er blevet rapporteret at levere fremragende resultater, der detekterer næsten det dobbelte af de samlede interaktioner, omend med forskydningen af den gennemsnitlige lineære afstand af interaktionerne detekteret ned til halvdelen af afstanden53.
Med hensyn til det faktiske RNA-sondeberigelsessystem er en af de største fordele ved at anvende denne type indfangning frem for en antistofbaseret, såsom HiChIP32 eller HiCuT33, blandt andre, evnen til at sammenligne betingelser uafhængigt af proteinets binding samt ikke at skulle stole på tilgængeligheden af et arbejdsantistof for proteinet af interesse. Desuden kan RNA-berigelsessystemet skræddersys til at fange alle specifikke regioner genomdækkende, så de passer til hver forskers behov (designet diskuteres i35,64).
Ud over antistofbaserede indfangningsmetoder er der i de senere år udviklet flere fremragende enkeltcellemetoder (såsom scHi-C 65, Dip-C 66 eller Sci-Hi-C 67) eller lavinputmetoder (såsom Low-C 68 eller Easy Hi-C 69) til at undersøge 3D-genomarkitekturen. Disse genererer imidlertid sparsomme kontaktkort med lav opløsning, der ikke tillader identifikation af kontakter mellem distale regulatoriske elementer og målgener. liCHi-C er en metode, der er i stand til at overvinde denne begrænsning, hvilket åbner muligheden for at studere promotorcentreret genomarkitektur i knappe celletyper og giver mulighed for at fremme vores forståelse af cellulær og udviklingsbiologi og sygdomsudvikling.
På trods af alle dens funktioner er liCHi-C ikke fritaget for begrænsninger. For det første er behandling af de rå sekventeringsdata ikke triviel, og retfærdige beregningsmæssige færdigheder er nødvendige for at analysere dataene og fortolke resultaterne. Desuden diskriminerer liCHi-C ikke mellem funktionelle og strukturelle interaktioner; det kræves, at liCHi-C-dataene integreres med epigenetiske data og/eller funktionelle analyser for at validere de potentielle funktionelle interaktioner mellem genpromotorer og deres målregulerende elementer. Endelig ofres bibliotekets kompleksitet, når man arbejder i den nedre ende af cellenumre. Dette afspejles i mængden af unikke interaktioner, der registreres sammenlignet med højere celleantal liCHi-C-biblioteker og deres deduplikeringshastighed, som kan nå op til 80%. Imidlertid bevarer liCHi-C-biblioteker med lavt cellenummer de topologiske træk ved biblioteker med højere celletal på en mere fokal måde53, hvilket viser, at det er muligt at udføre liCHi-C-biblioteker, der rekapitulerer cellens promotorinteraktom med så lidt som 50.000 celler.
Samlet set er liCHi-C en omkostningseffektiv og tilpasselig metode til at generere interactome-biblioteker af høj kvalitet og høj opløsning i knappe celletyper. Det er den første metode med lavt input til at kortlægge promotorens interaktom og kræve betydelige sløjfer ved begrænsningsfragmentopløsningen. Vi forudser, at dette nye værktøj, som dets forgænger PCHi-C, vil give ny indsigt i celledifferentiering og organismeudvikling, både inden for sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker resten af medlemmerne fra Javierre-laboratoriet for deres feedback på manuskriptet. Vi takker CERCA Program, Generalitat de Catalunya og Josep Carreras Foundation for institutionel støtte. Dette arbejde blev finansieret af FEDER/det spanske ministerium for videnskab og innovation (RTI2018-094788-A-I00), European Hematology Association (4823998) og den spanske sammenslutning mod kræft (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ finansieres af La Caixa Banking Foundation Junior Leader-projektet (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR finansieres af et AGAUR FI-stipendium (2019FI-B00017), og LT-D finansieres af et FPI-stipendium (PRE2019-088005). Vi takker biokemi og molekylærbiologi ph.d.-programmet fra Universitat Autònoma de Barcelona for sin støtte. Ingen af bidragyderne var på noget tidspunkt involveret i det eksperimentelle design eller manuskriptskrivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
References
- Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
- Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
- Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
- Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
- Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
- Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P.
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
- He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
- Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
- Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
- Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
- Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
- Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
- Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
- Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Fullwood, M. J., et al.
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
- Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
- Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
- Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
- Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
- Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
- Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
- Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
- Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
- Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
- Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
- Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
- Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
- Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
- Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
- Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
- Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
- Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
- Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
- Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
- Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
- Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
- Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
- Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
- Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
- Ramani, V., et al.
- Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
- Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).
