Summary
Præsenteret her er en ny version af ekspansionsmikroskopi (ExM), Magnify, der er modificeret til op til 11 gange ekspansion, bevarer et omfattende udvalg af biomolekyleklasser og er kompatibel med en bred vifte af vævstyper. Det muliggør forhør af nanoskalakonfigurationen af biomolekyler ved hjælp af konventionelle diffraktionsbegrænsede mikroskoper.
Abstract
Nanoskala billeddannelse af biologiske prøver kan forbedre forståelsen af sygdomspatogenese. I de senere år har ekspansionsmikroskopi (ExM) vist sig at være et effektivt og billigt alternativ til optisk superopløsningsmikroskopi. Det har imidlertid været begrænset af behovet for specifikke og ofte brugerdefinerede forankringsmidler til at bevare forskellige biomolekyleklasser i gelen og af vanskeligheder med at udvide standard kliniske prøveformater, såsom formalinfikseret paraffinindlejret væv, især hvis der ønskes større ekspansionsfaktorer eller konserverede proteinepitoper. Her beskriver vi Magnify, en ny ExM-metode til robust ekspansion op til 11 gange i en lang række vævstyper. Ved at bruge methacrolein som det kemiske anker mellem vævet og gelen bevarer Magnify flere biomolekyler, såsom proteiner, lipider og nukleinsyrer, i gelen, hvilket muliggør bred nanoskala billeddannelse af væv på konventionelle optiske mikroskoper. Denne protokol beskriver bedste praksis for at sikre robust og revnefri vævsudvidelse samt tip til håndtering og billeddannelse af stærkt ekspanderede geler.
Introduction
Biologiske systemer udviser strukturel heterogenitet, fra lemmerne og organerne ned til proteinniveauerne på nanoskala. Derfor kræver en fuldstændig forståelse af driften af disse systemer visuel undersøgelse på tværs af disse størrelsesskalaer. Imidlertid forårsager diffraktionsgrænsen for lys udfordringer med at visualisere strukturer mindre end ~ 200-300 nm på et konventionelt fluorescensmikroskop. Derudover giver optiske superopløsningsmetoder 1,2,3, såsom stimuleret emissionsudtømning (STED), fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) og struktureret belysningsmikroskopi (SIM), selvom de er kraftfulde, deres egne udfordringer, da de kræver dyr hardware og reagenser og ofte har langsomme anskaffelsestider og en dårlig evne til at afbilde store mængder i 3D.
Ekspansionsmikroskopi4 (ExM) giver et alternativt middel til at omgå diffraktionsgrænsen for lys ved kovalent forankring af biomolekyler i en vandopsvulmelig polymergel og fysisk trække dem fra hinanden, hvilket gør dem opløselige på konventionelle optiske mikroskoper. Et væld af ExM-protokolvarianter er blevet udviklet siden den oprindelige offentliggørelse af ExM for mindre end et årti siden, og disse protokoller tillader direkte inkorporering af proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 ind i gelnetværket ved at ændre det kemiske anker eller udvide prøven yderligere (hvilket forbedrer den effektive opløsning) enten i et enkelt trin14 eller flere iterative trin15,16. Indtil for nylig kunne ingen enkelt ExM-protokol bevare disse tre biomolekyleklasser med et enkelt kommercielt tilgængeligt kemisk anker, samtidig med at der blev tilvejebragt en mekanisk robust gel, der kunne udvide ~ 10 gange i en enkelt ekspansionsrunde.
Her præsenterer vi Magnify17, en nylig tilføjelse til ExM-arsenalet, der bruger methacrolein som biomolekyleanker. Methacrolein danner kovalente bindinger med væv som paraformaldehyd, hvilket sikrer, at flere klasser af biomolekyler kan bevares inden for gelnetværket uden at kræve forskellige specifikke eller brugerdefinerede forankringsmidler. Derudover kan denne teknik udvide et bredt spektrum af væv op til 11 gange, herunder notorisk udfordrende prøver såsom formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) kliniske prøver. Tidligere metoder til udvidelse af sådanne mekanisk stive prøver krævede hård proteasefordøjelse, hvilket gjorde antistofmærkning af proteiner af interesse umulig, efter at prøven var blevet udvidet. I modsætning hertil opnår denne teknik udvidelsen af FFPE kliniske prøver ved hjælp af en varm denatureringsopløsning, hvorved hele proteinepitoper bevares i gelen, som kan målrettes mod billeddannelse efter ekspansion (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer, der involverede dyr, blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Carnegie Mellon University. Humane vævsprøver blev kommercielt opnået.
1. Fremstilling af lagerreagenser og -opløsninger
BEMÆRK: Se materialetabellen for en liste over de anvendte reagenser.
- Forbered geleringsstamopløsningerne. Disse kombineres umiddelbart før geleringstrinnet.
- Stamopløsningen af monomeren (4 g/100 mL N,N-dimethylacrylamidsyre [DMAA], 50 g/100 ml natriumacrylat [SA], 66,7 g/100 ml acrylamid [AA], 0,10 g/100 mL N,N′-methylenbisacrylamid [Bis], 33 g/100 ml natriumchlorid [NaCl], 1x phosphatbufret saltvand; PBS) ved hjælp af de komponenter, der er anført i tabel 1. Alle stamopløsningerne opløses eller fortyndes i vand. Monomerstamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i mindst 3 måneder.
- Følgende stamopløsninger fremstilles separat i vand: 0,5% (w / w) 4-hydroxy-TEMPO (4HT), som hæmmer gelering under monomerdiffusion i vævene, og 10% (w / w) tetramethylethylendiamin (TEMED), som fremskynder den radikale generation initieret af ammoniumpersulfat (APS) og fremstilles ved 10% (w / w).
BEMÆRK: Stamopløsningerne kan fordeles i 1-2 ml alikvoter og opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder; APS fremstilles dog umiddelbart før tilberedning af geleringsopløsningen.
- Forbered homogeniseringsbufferen (1% w / v SDS, 8 M urinstof, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8 ved stuetemperatur [RT]) ved at kombinere 1 g SDS, 48,048 g urinstof, 5 ml EDTA (0,5M, pH 8), 20 ml 10x PBS, 25 ml Tris (2 M) og 0,75 g glycin. Tilsæt vand til et samlet volumen på 100 ml. Løsningen kan skaleres op eller ned efter behov og kan opbevares hos R.T.
2. Vævsforberedelse til arkiverede og frisklavede kliniske vævsdias
BEMÆRK: Vævsforbehandlingstrinnene varierer afhængigt af, hvordan prøverne forberedes.
- For formaldehydfikserede paraffinindlejrede (FFPE) kliniske prøver skal du følge nedenstående trin.
- Anbring prøverne i en sekventiel serie af opløsninger (et glasglasfarveglas eller 50 ml konisk rør kan anvendes): xylen, 95% ethanol, 70% ethanol og 50% ethanol efterfulgt af dobbelt deioniseret vand. Brug hver opløsning to gange i mindst 3 minutter hver gang. Brug tang til at placere diaset i beholderen, og tilsæt 15 ml af den respektive opløsning (nok til at dække prøven). Placer det lukkede koniske rør vandret på en ryster ved stuetemperatur.
- For prøver, der er farvet og monteret på permanente dias, skal du følge nedenstående trin.
- Placer objektglasset kortvarigt i xylen, og fjern forsigtigt dæksedlerne med et passende værktøj, såsom et barberblad. Hvis dæksedlen forbliver fast, skal du sætte objektglassene i xylen tilbage til stuetemperatur, indtil dækselen løsner sig.
- Behandl derefter prøverne som FFPE-prøver (trin 2.1.1).
BEMÆRK: For hæmatoxylin og eosin (H&E) -farvede dias går hæmatoxylin- og eosinpletten tabt under ekspansionsprocessen.
- For ikke-fikserede frosne vævsglas i optimal skæretemperatur (OCT) opløsning fastgøres vævene i acetone ved -20 °C i 10 minutter, før prøverne vaskes med 1x PBS-opløsning tre gange i 10 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- For tidligere faste frosne kliniske vævsglas smeltes OCT ved at inkubere diasene i 2 minutter ved stuetemperatur og vaskes derefter med 1x PBS-opløsning tre gange i 5 minutter hver gang ved stuetemperatur.
3. Vævsforberedelse til paraformaldehydfikseret musehjerne
- Følg denne protokol for musehjernesektioner, der er 30-50 μm tykke.
BEMÆRK: Succes kan findes med større sektioner, men længere tid kan være nødvendig for monomer opløsningsdiffusion og homogenisering. - Hvis sektionerne ikke i øjeblikket opbevares i en 1x PBS-opløsning (f.eks. i en 30% [v/v] glycerol og 30% [v/v] ethylenglycolopløsning i 1x PBS), vaskes tre gange i mindst 10 minutter hver gang ved stuetemperatur i 1x PBS i en plade med 6 til 24 huller.
- Få et ubelagt glasmikroskopiglas. Hvis den ene side af glasglasset er belagt, skal du bruge en våd pensel til at kontrollere for den ubelagte side (ofte vil etiketten på den belagte side være lavet af malet glas og bliver mindre uigennemsigtig, når den er våd).
- Brug en pensel til at gøre det ubelagte dias vådt. Fjern musens hjernevæv fra brøndpladen med penslen, og placer det forsigtigt på diaset ved hjælp af en rullende bevægelse for at sikre, at vævet er fladt. Lad overskydende PBS forblive på vævet, indtil alle sektioner er monteret.
BEMÆRK: Mens et enkelt glasglas kan bruges til flere vævssektioner, skal der tages mere omhu for at sikre, at de ikke tørrer helt ud, når flere vævssektioner geleres på én gang (selv på separate dias). - Brug en laboratoriepapirklud til at fjerne størstedelen af det overskydende PBS fra diaset. Efterlad en lille væskering omkring hver vævssektion, men lad resten af diaset være for det meste tørt. Denne resterende væske dækker vævet, mens gelmonomeropløsningen fremstilles.
4. Gelering
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til alle vævstyper, der er forberedt til brug med denne teknik.
- Påfør afstandsstykker på begge sider af vævssektionen (figur 2A) for at forhindre vævskompression. For at gøre det skal du lave afstandsstykkerne ved tyndt at skære stykker dækglas ved hjælp af en diamantspidspen og derefter fastgøre dem til diaset ved hjælp af små mængder vand eller 1x PBS eller fastgøre dem ved hjælp af en lille mængde superlim. Placer derefter forsigtigt afstandsstykkerne på hver side af vævet.
- Forbered den endelige geleringsopløsning. Generelt er ~ 200 μL tilstrækkelig pr. Vævssektion, men volumenet bør ikke overstige 800 μL pr. Dias. Enhver mere geleringsopløsning vil resultere i spillover.
BEMÆRK: Methacrolein bruges til at forankre biomolekyler i gelen. Der kræves dog ikke noget separat forankringstrin, og methacrolein kan tilsættes direkte til den endelige geleringsopløsning.- Pr. sektion kombineres følgende i rækkefølge: 200 μL monomeropløsning, 0,5 μL 0,5% 4HT-stamopløsning (1:400 fortynding), 0,2-0,5 μL methacrolein (1:400-1:1.000 fortynding afhængigt af vævstypen; generelt anvendes en 1:1.000 fortynding for paraformaldehyd [PFA]-faste prøver og 1:400 for FFPE kliniske prøver), 2 μL 10% TEMED stamopløsning (1:100 fortynding), og 5 μL 10 % APS-stamopløsning (1:40 fortynding).
BEMÆRK: Forbered den endelige geleringsopløsning umiddelbart før brug. For at forhindre for tidlig gelering tilsættes APS-opløsningen sidst.
- Pr. sektion kombineres følgende i rækkefølge: 200 μL monomeropløsning, 0,5 μL 0,5% 4HT-stamopløsning (1:400 fortynding), 0,2-0,5 μL methacrolein (1:400-1:1.000 fortynding afhængigt af vævstypen; generelt anvendes en 1:1.000 fortynding for paraformaldehyd [PFA]-faste prøver og 1:400 for FFPE kliniske prøver), 2 μL 10% TEMED stamopløsning (1:100 fortynding), og 5 μL 10 % APS-stamopløsning (1:40 fortynding).
- Fjern overskydende opløsning fra vævssektionen, og læg diaset i en petriskål. Prøven tilsættes hele den frisklavede, koldgeleringsopløsning, og blandingen inkuberes på vævet i 30 minutter ved 4 °C for at tillade diffusion i vævet.
- Læg et andet ubelagt glasglas forsigtigt over vævet og gelopløsningen. Luftbobler bør undgås (figur 2B).
BEMÆRK: Hvis luftbobler bliver fanget over vævet, kan glaslåget forsigtigt løftes og placeres ned igen. Derudover kan enhver monomeropløsning, der spildes ud, trimmes af efter polymerisation og vil ikke forårsage problemer for vævet. - Sørg for, at polymerisationen er afsluttet. Denne polymerisation kan udføres på to måder, der hver producerer lignende resultater. Først inkuberes prøverne ved 37 °C i et befugtet miljø (f.eks. en lukket petriskål med et fugtigt køkkenrulle) natten over. Alternativt inkuberes prøverne i den befugtede atmosfære i 2 timer ved 37 °C efterfulgt af 1 time ved 60 °C for at opnå hurtigere polymerisation.
5. Prøvefordøjelse og vævsudvidelse
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til alle vævstyper.
- Brug øjenbeskyttelse, skub et barberblad mellem de to glasskinner i geleringskammeret for at adskille dem.
BEMÆRK: Glasrutsjebanerne skal adskilles meget let. Hvis forskellige dele af gelen sidder fast på begge dias, kan en pensel bruges til at lede gelen til den ene eller den anden. Hvis gelen er blevet særlig tør under polymerisation, kan 1x PBS påføres ydersiden af gelkammeret, men nedsænk ikke gelen helt, da dette vil få den til at ekspandere, før vævet homogeniseres, hvilket vil resultere i revner. - Trim den blinde gel rundt om vævet for at minimere volumenet. Skæring af gelen asymmetrisk muliggør sporing af gelens orientering efter homogenisering, da prøven vil være fuldstændig gennemsigtig.
- Løft forsigtigt den vævsholdige gel fra objektglasset med et barberblad, og overfør den forsigtigt til et 2 ml centrifugerør med en pensel.
- Røret fyldes til toppen med homogeniseringsbuffer (tabel 2), der er forvarmet til 80 °C.
- Prøven rystes ved 80 °C i 8 timer (for PFA-fikseret musehjerne) eller 60 timer (de fleste kliniske FFPE-prøver; se tabel 3).
BEMÆRK: Homogeniseringstiden afhænger af vævstype og fikseringsmetode. Mange af disse betingelser er allerede valideret, men for andre kan optimering være nødvendig. - Hæld indholdet af centrifugerøret i en enkelt brønd i en 6-brønds plastcellekulturplade.
- Fjern denatureringsbufferen med en overførselspipet.
- For helt at fjerne det resterende SDS fra hydrogelen vaskes prøven i en 1% nonionisk overfladeaktiv opløsning (C12E10) som følger: mindst tre gange i10 minutter hver gang ved stuetemperatur; i 60 minutter ved 60 °C og derefter vaskes yderligere tre i 10 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- Prøven opbevares i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C, indtil farvning og billeddannelse efter ekspansion skal udføres.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal prøven være ~ 3-4,5 gange større i hver dimension, afhængigt af vævstypen.
6. Profilering af biomolekyler efter ekspansion
- Antistof farvning
BEMÆRK: Dette følger en typisk immunfluorescens (IF) / immunohistokemi (IHC) farvningsprotokol. Mængderne af primære og sekundære antistoffer, der anvendes, afhænger af de koncentrationer, der foreslås af producenten eller ved optimering til det specifikke eksperiment. Individuelle buffere kan erstattes efter brugerens skøn.- Med prøven i en enkelt brønd i en 6-brønds cellekulturplade vaskes de ekspanderede prøver tre gange i 10 minutter hver gang i 1x PBS ved RT, hvorved væsken overføres med en pipette.
- Udfør et valgfrit blokeringstrin (f.eks. 3 % bovint serumalbumin/0,1 % Triton-X100 i 1x PBS) i mindst 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Inkuber med de primære antistoffer i farvningsbuffer (for eksempel 0,1% Triton-X100 1x PBS eller 9x PBS / 1% TritonX / 10 mg / L heparin) natten over ved 37 ° C. Afhængigt af prøvestørrelsen skal 0,5-2 ml dække gelen tilstrækkeligt.
- Prøven vaskes tre gange i mindst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved stuetemperatur.
- Der inkuberes i de tilsvarende sekundære antistoffer i 3 timer ved 37 °C i den valgte farvningsbuffer.
- Prøven vaskes tre gange i mindst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved stuetemperatur.
- NHS-ester pan-protein farvning
- Med prøven i en 6-brønds plade hældes 1-2 ml polyethylenglycol (PEG 200) på prøven (nok til at dække den helt).
BEMÆRK: Vævet skal krympe og vende tilbage til sin oprindelige præekspansionsstørrelse (eller tæt på den). - Plet med fluoroforkonjugeret NHS-ester fortyndet til 13,3-80 μg/ml i 3 timer ved RT i 1-2 ml farvningsbuffer (f.eks. 1x PBS, 2x SSC eller 100 mM natriumbicarbonatopløsning).
- Prøven vaskes tre gange i mindst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved stuetemperatur.
- Med prøven i en 6-brønds plade hældes 1-2 ml polyethylenglycol (PEG 200) på prøven (nok til at dække den helt).
- Lipidfarvning
BEMÆRK: Post-ekspansion lipidfarvning er ikke effektiv på FFPE kliniske prøver, da lipider går tabt under fikseringsprocessen.- Prøven vaskes tre gange i mindst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved stuetemperatur.
- Påfør et konventionelt lipofilt farvestof (DiO, DiI eller DiD) fortyndet 200 gange i 2 ml 0,1% TritonX-100/1x PBS i 72-96 timer ved stuetemperatur.
- Vask mindst tre gange med 1x PBS
- Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Homogeniserede gelprøver anbringes i hybridiseringsbuffer, der er forvarmet til 60 °C i 30 minutter.
- Forbered hybridiseringsbufferen til FISH: Kombiner 2x SSC (300 mM NaCl, 30 mM natriumcitrat, pH 7,0), 10% (v / v) dextransulfat, 20% (v / v) ethylencarbonat og 0,1% (v / v) Tween20.
- Gelprøverne inkuberes med en hybridiseringsbuffer indeholdende 10 pM (pr. oligo) FISH-sonder mod målgenet (mindst 20 sonder pr. 10 kb) ved 45 °C natten over.
- Vask med stringency wash buffer (2x S.S.C. og 0,1% Tween20) to gange i 15 min hver gang ved 45 °C.
- Der vaskes med streng vaskebuffer yderligere to gange i 10 minutter hver gang ved 37 °C.
- Vask til sidst med 1x PBS mindst tre gange i 10 minutter hver gang ved stuetemperatur.
- Prøverne er klar til billeddannelse eller opbevaring i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C.
- Fuld vævsudvidelse og fluorescensbilleddannelse
BEMÆRK: Den ekspansionsfaktor, der kan opnås med Magnify, varierer med vævstypen og ekspansionsmetoden (et fuldstændigt resumé findes i tabel 3). Som et generelt skøn vil en forstørrelsesprøve imidlertid udvide sig 3-4,5 gange i 1x PBS, 5-7 gange i PBS fortyndet til 1:50 i ddH 2 O og 8-11 gange i ddH2O. Den optimale ekspansionsfaktor til billeddannelse afhænger af hvert eksperiments behov. Ekspansionsfaktoren er meget indstillelig, således at en enkelt prøve kan udvides og krympes mange gange til billeddannelse i forskellige skalaer.- Flyt prøverne udvidet 4 gange i PBS til en glasbundet 6-brønds billedplade ved hjælp af en pensel. Flyt enhver prøve, der er udvidet yderligere, ved at skære den i mindre stykker eller placere den forsigtigt i en stor billedplade med glasbund med et tyndt stykke fleksibel plast.
- Udfør fluorescensbilleddannelse ved hjælp af et konventionelt bredfeltmikroskop, et konfokalmikroskop eller et andet billeddannelsessystem efter eget valg. Fjernelse af overskydende væske omkring gelen med en papirlaboratorieklud kan forhindre gelbevægelse under billeddannelse. Gelerne kan også immobiliseres ved at påføre 0,1% poly-L-lysin på glasoverfladen før billeddannelse.
BEMÆRK: Anvendelsen af poly-L-lysin vil gøre gelen helt immobil ved kontakt. Af denne grund skal man være forsigtig med, at gelen påføres glasset uden at folde eller strække sig. Derudover bør gelen ikke få lov til at tørre helt på poly-L-lysinbelagt glas, da dette kan gøre fjernelse vanskelig, og gelen bør ikke krympes i PBS, mens den stadig er fastgjort til glasset med poly-L-lysin, da dette kan forårsage gel- eller vævsskade. - Efter billeddannelse krympes prøverne i 1x PBS med mindst tre vaske i 10 minutter hver gang, da det ikke anbefales at opbevare prøverne på lang sigt i ddH2O på grund af nedbrydningen af fluorescenssignalet. Især bør fuldt udvidede prøver farvet med lipofile farvestoffer afbildes så tæt på ekspansionstidspunktet som muligt for at forhindre dissociation af farvestoffet i vand.
- Prøverne opbevares i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis protokollen er gennemført med succes (figur 1), vises prøven klar og flad efter varmedenaturering; Enhver foldning eller rynke indikerer ufuldstændig homogenisering. En vellykket udvidet prøve vil være 3-4,5 gange større end før ekspansion i 1x PBS og 8-11 gange større, når den er fuldt udvidet i ddH2O. Figur 3 viser eksempler på billeder før og efter ekspansion af 5 μm tyk FFPE human nyreprøve behandlet ved hjælp af denne protokol og med succes udvidet over 8 gange. Vævet blev først farvet med antistoffer mod ACTN4 sammen med DAPI for at visualisere det nukleare DNA. Prøven blev derefter afbildet ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop (figur 3A). Vævet blev behandlet i henhold til ovennævnte protokol, herunder farvning efter ekspansion af de samme mål, og fuldt udvidet i vand (figur 3B) før genbilleddannelse. Efter varmedenaturering kan andre biomolekyler end proteiner også farves til og afbildes, som vist i figur 4. Lipofile farvestoffer kan anvendes til at afsløre celle- og mitokondriemembranstrukturer i musehjernen (figur 4A). Derudover kan nukleinsyrer afbildes gennem FISH, som i FFPE normalt humant lymfeknudevæv vist i figur 4B,C.
Figur 5 viser et sandsynligt resultat, hvis prøven ikke homogeniseres korrekt. Efter ekspansion blev vævet farvet med antistoffer mod ACTN4 og vimentin sammen med DAPI for at visualisere det nukleare DNA og hvedekimagglutinin (WGA) for at mærke kulhydraterne. Vævet blev udvidet 3,5 gange i PBS før billeddannelse ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop. I en nyresektion (figur 5A,C) kan den revnefrie udvidelse af en glomerulus ses. I et separat afsnit (figur 5B, D) kan revner tydeligt ses i vævet.
Figur 1: Skematisk oversigt over arbejdsprocessen Forstørrelse. Forbehandlingen af klinisk arkiverede vævsdias udføres først baseret på lagringsformatet. Fritflydende paraformaldehydfikserede sektioner behøver kun vaskes i PBS. Prøverne inkuberes derefter i en gelmonomeropløsning, herunder methacrolein for at forankre biomolekylerne til hydrogelen. In situ-polymerisation udføres før varmedenaturering med urinstof, SDS og EDTA. Prøverne vaskes derefter grundigt og farves ved hjælp af konventionelle immunfarvningsprotokoller, FISH-protokoller eller lipofile farvestoffer. Prøverne udvides derefter i rent vand inden billeddannelse. Dette tal er ændret fra Klimas et al.17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vævsprøvegeleringskammer . (A) På hver side af vævet anbringes to afstandsstykker, såsom to stykker #1.0 dækglas, før gelmonomeropløsningen får lov til at diffundere ved 4 °C. For at forhindre kompression skal afstandsstykkerne være tykkere end vævsskiverne. (B) Et låg, såsom et andet glasglas, anvendes til at dække prøven før polymerisation ved 37 °C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempel på præekspansionsbilleder af et humant nyrevævsafsnit. (A) Et billede taget ved 60x forstørrelse (1,4 NA) sammenlignet med (B) et billede af det samme synsfelt efter udvidelse med Forstør taget ved 40x forstørrelse (1,15 NA, udvidelsesfaktor: 8,15x). Magenta, DAPI; Gul, ACTN4. Den maksimale intensitet af billederne efter udvidelsen projiceres over 25 billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Alternative biomolekylefarvningsstrategier med Forstørrelse . (A) (i og iv) NHS-ester pan-protein mærkning af fuldt udvidet mus hjernevæv. (ii og v) Lipofilt farvestof (DiD) mærkning af det samme musehjernevæv. iii og vi) Kanalerne fusionerede. (B) DNA FISH med Forstør ved hjælp af FFPE normalt humant lymfeknudevæv. Ekspansionsfaktor: 3,5x i 1x PBS. Hvid, DAPI; Magenta, serin/threonin kinase 1 gen; Blåt, APC / C-aktivatorprotein CDH1-gen; Gul, menneskelig satellitsekvens S4. (C) Individuelle kanaler forbundet med B. Alle billederne blev opnået ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop ved 40x forstørrelse (1,15 NA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative resultater af 5 μm tykke FFPE nyreprøver. (A) Revnefri ekspansion. Hvid, DAPI; Gul, vimentin; Cyan, alfa-actinin 4; Magenta, hvedekim agglutinin. (B) Udvidet nyresektion, der udviser revner. Revner, forvrængninger og tab af mærkede mål kan være resultatet af utilstrækkelig forankring og / eller homogenisering. (C,D) Zoomede billeder af de indpakkede områder i henholdsvis A og B. Alle billederne blev taget ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskop ved 10x (A,B; 0,45 NA) eller 60x (C,D; 1,2 NA) forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Gelmonomer opløsningssammensætning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Homogeniseringsbuffersammensætning. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Sammenfatning af methacrolein og homogeniseringsbetingelser for valideret væv. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi Magnify-protokollen 17, en ExM-variant, der kan bevare flere biomolekyler med et enkelt kemisk anker og udvide udfordrende FFPE kliniske prøver op til11 gange med varmedenaturering. De vigtigste ændringer i denne protokol, der adskiller den fra andre ExM-protokoller, inkluderer brugen af en omformuleret gel, der forbliver mekanisk robust, selv når den er fuldt udvidet, samt brugen af methacrolein som biomolekyleanker. De mest kritiske trin i denne protokol er som følger: 1) sammensætningen af den endelige gelopløsning; 2) tidspunktet for geleringstrinnene; 3) opsætning af geleringskammeret; 4) parametrene for homogenisering af prøver og 5) tilstrækkelig vask af SDS fra prøven før farvning efter ekspansion.
Den mest kritiske parameter for denne protokol er sammensætningen af den endelige geleringsopløsning, især koncentrationen af biomolekylet anker methacrolein. Forskellige methacroleinkoncentrationer er nødvendige for at udvide forskellige vævstyper (tabel 3), og det skal sikres, at denne værdi er godt tilpasset den prøve, der skal udvides. Overforankring med methacrolein kan resultere i en reduceret ekspansionsfaktor og et tab af epitoper, der er tilgængelige til farvning efter ekspansion, mens underforankring, især i FFPE kliniske prøver, kan resultere i vævsrevner eller forvrængning. Derfor skal methacroleinkoncentrationen optimeres til ikke-validerede vævstyper, selvom den optimale koncentration sandsynligvis vil falde nær eller inden for det interval, der præsenteres her. Selvom vi forventer, at denne protokol vil fungere for de fleste vævstyper, selv dem, vi endnu ikke har valideret, vides det ikke at fungere for prøver, der indeholder knogler.
Ud over methacrolein kan anvendelse af en forkert koncentration af en kritisk gelingrediens (4HT eller TEMED) resultere i eksperimentets fuldstændige fiasko, enten på grund af ufuldstændig eller ingen gelering (overdreven 4HT) eller for tidlig gelering (overdreven TEMED, reduceret 4HT eller tilsætning af APS før de andre komponenter). For at forhindre for tidlig gelering er det også nødvendigt at holde prøven og gelen ved 4 °C og udsættes for luft i 30 minutter og kun dække prøven og placere den ved 37 °C i et befugtet kammer, når diffusionsprocessen er afsluttet.
Ved konstruktion af gelkammeret er det afgørende at inkludere afstandsstykker mellem de to ubelagte glasglas, især for tykkere vævssektioner såsom PFA-fikseret musehjerne. Mangel på afstandsstykker kan forårsage vævskompression, hvilket resulterer i forvrængede billeder og unøjagtige data.
Prøvehomogeniseringen afhænger af fordøjelsestiden med fordøjelsesbufferen samt fordøjelsesbufferens temperatur og sammensætning. Utilstrækkelig homogenisering kan forårsage forvrængninger og reducerede ekspansionsfaktorer sammenlignet med den rapporterede værdi for en given vævstype. Hvis der er mistanke om ufuldstændig homogenisering, kan fordøjelsestiden øges, især i tilfælde af tykkere væv.
Et enkelt, men afgørende trin er tilstrækkelig udvaskning af sikkerhedsdatabladet fra prøven med et nonionisk overfladeaktivt stof (såsomC12E10) efter homogenisationstrinnet. Enhver resterende SDS kan resultere i suboptimal eller helt hindret antistofbinding. Heldigvis, hvis dette er mistænkt, vil yderligere vask og genanvendelse af antistofferne ofte være en tilfredsstillende løsning.
Protokollen giver et omkostningseffektivt alternativ til nuværende superopløsningsbilleddannelse og elektronmikroskopiteknikker til at forhøre nanoskalastrukturer i forskellige vævsprøver, herunder i FFPE kliniske prøver. Anvendelsen af methacrolein og varmedenaturering tillader postekspansionsprofilering af eventuelle biomolekyler, der bevares under vævsfiksering (dette udelukker f.eks. Billeddannelse af lipider i FFPE-prøver). Vores protokol, som en udvidelse af ExM-rammen, er modulær og sandsynligvis kompatibel med andre teknikker såsom optiske superopløsningsmetoder (STED18, STORM 19) eller iterativ ekspansionsmikroskopi (iExM)15. Disse er dog endnu ikke testet med den præsenterede protokol, og de store ekspansionsfaktorer kan give udfordringer, især med fluoroforforforing. Derudover kræver prøvernes store størrelse efter fuld ekspansion i vand omhu ved håndtering (selvom gelen, der anvendes her, er mere modstandsdygtig end tidligere ExM-gelformuleringer med høj ekspansionsfaktor, såsom ti gange robust ekspansionsmikroskopi (TREx), til håndtering af miscues17), og kreative løsninger er lejlighedsvis nødvendige for at overføre og afbilde disse fuldt udvidede geler. For eksempel ved at bruge bredt baserede redskaber såsom et tyndt plastark til at overføre de fuldt udvidede geler i stedet for en pensel eller ved hjælp af specialfremstillede store billedplader (i vores hænder betyder det laserskårne eller 3D-printede plader med store stykker # 1.5 dækglas klæbet til bunden; disse kan ses i den ledsagende video). Vigtigst er det, at denne metode udvider anvendeligheden af nanoskala-billeddannelse ved at tillade nanoskala-billeddannelse af almindelige biologiske og patologiske prøvepræparater på konventionelle vidvinkel- eller konfokale mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer følgende konkurrerende økonomiske interesse(r): Y.Z., A.K., Z.C. og B.R.G. opfandt flere opfindelser relateret til Magnify og ExM.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Carnegie Mellon University og D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. og X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 og Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
