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Biology

11-गुना विस्तार माइक्रोस्कोपी के साथ सार्वभौमिक आणविक प्रतिधारण

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65338
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Summary

यहां प्रस्तुत विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम), मैग्नीफाई का एक नया संस्करण है, जिसे 11 गुना विस्तार के लिए संशोधित किया गया है, बायोमोलेक्यूल वर्गों की एक व्यापक सरणी का संरक्षण करता है, और ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है। यह पारंपरिक विवर्तन-सीमित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के नैनोस्केल विन्यास की पूछताछ को सक्षम बनाता है।

Abstract

जैविक नमूनों की नैनोस्केल इमेजिंग रोग रोगजनन की समझ में सुधार कर सकती है। हाल के वर्षों में, विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रभावी और कम लागत वाला विकल्प साबित हुआ है। हालांकि, जेल के भीतर विभिन्न बायोमोलेक्यूल वर्गों को बनाए रखने के लिए विशिष्ट और अक्सर कस्टम एंकरिंग एजेंटों की आवश्यकता और मानक नैदानिक नमूना प्रारूपों के विस्तार में कठिनाइयों से सीमित किया गया है, जैसे कि फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, खासकर अगर बड़े विस्तार कारक या संरक्षित प्रोटीन एपिटोप वांछित हैं। यहां, हम मैग्नीफाई का वर्णन करते हैं, जो ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में 11 गुना तक मजबूत विस्तार के लिए एक नई एक्सएम विधि है। ऊतक और जेल के बीच रासायनिक लंगर के रूप में मेथाक्रोलिन का उपयोग करके, मैग्नीफाई जेल के भीतर प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड जैसे कई बायोमोलेक्यूल्स को बरकरार रखता है, इस प्रकार पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर ऊतकों की व्यापक नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल मजबूत और दरार मुक्त ऊतक विस्तार सुनिश्चित करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का वर्णन करता है, साथ ही अत्यधिक विस्तारित जैल को संभालने और इमेजिंग करने के लिए सुझाव देता है।

Introduction

जैविक प्रणालियां नैनोस्केल में प्रोटीन के स्तर तक अंगों और अंगों से संरचनात्मक विषमता प्रदर्शित करती हैं। इसलिए, इन प्रणालियों के संचालन की पूरी समझ के लिए इन आकार के पैमानों पर दृश्य परीक्षा की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रकाश की विवर्तन सीमा पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ~ 200-300 एनएम से छोटी संरचनाओं को देखने में चुनौतियों का कारण बनती है। इसके अलावा, ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियां 1,2,3, जैसे उत्तेजित उत्सर्जन की कमी (एसटीईडी), फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), हालांकि शक्तिशाली, अपनी चुनौतियां पेश करते हैं, क्योंकि उन्हें महंगे हार्डवेयर और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और अक्सर धीमी गति से अधिग्रहण समय और 3 डी में बड़ी मात्रा की छवि बनाने की खराब क्षमता होती है।

विस्तार माइक्रोस्कोपी4 (ईएक्सएम) बायोमोलेक्यूल्स को पानी-सूजन वाले बहुलक जेल में सहसंयोजक रूप से लंगर डालकर और शारीरिक रूप से उन्हें अलग करके प्रकाश की विवर्तन सीमा को दरकिनार करने का एक वैकल्पिक साधन प्रदान करता है, इस प्रकार उन्हें पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर हल करने योग्य बनाता है। एक दशक से भी कम समय पहले एक्सएम के मूल प्रकाशन के बाद से एक्सएम प्रोटोकॉल वेरिएंट की एक भीड़ विकसित की गई है, और ये प्रोटोकॉल प्रोटीन 5,6,7, आरएनए 8,9,10, या लिपिड11,12,13 के प्रत्यक्ष समावेश की अनुमति देते हैं। रासायनिक लंगर को बदलकर या नमूने को आगे विस्तारित करके जेल नेटवर्क में (इस प्रकार प्रभावी रिज़ॉल्यूशन में सुधार) या तो एक ही चरण14 या कई पुनरावृत्ति चरण15,16 में। हाल तक, कोई भी एक्सएम प्रोटोकॉल इन तीन बायोमोलेक्यूल वर्गों को एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रासायनिक लंगर के साथ बनाए नहीं रख सकता था, जबकि यांत्रिक रूप से मजबूत जेल प्रदान करता था जो एकल विस्तार दौर में ~ 10 गुना विस्तार कर सकता था।

यहां, हम मैग्नीफाई17 प्रस्तुत करते हैं, जो एक्सएम शस्त्रागार के लिए एक हालिया अतिरिक्त है जो बायोमोलेक्यूल एंकर के रूप में मेथाक्रोलिन का उपयोग करता है। मेथाक्रोलिन पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे ऊतक के साथ सहसंयोजक बंधन बनाता है, यह सुनिश्चित करता है कि विभिन्न विशिष्ट या कस्टम एंकरिंग एजेंटों की आवश्यकता के बिना जेल नेटवर्क के भीतर बायोमोलेक्यूल्स के कई वर्गों को बनाए रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह तकनीक ऊतकों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को 11 गुना तक बढ़ा सकती है, जिसमें फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) नैदानिक नमूने जैसे कुख्यात चुनौतीपूर्ण नमूने शामिल हैं। इस तरह के यांत्रिक रूप से कठोर नमूनों के विस्तार के लिए पिछले तरीकों में कठोर प्रोटीज पाचन की आवश्यकता होती है, जिससे नमूने का विस्तार होने के बाद रुचि के प्रोटीन के एंटीबॉडी लेबलिंग असंभव हो जाते हैं। इसके विपरीत, यह तकनीक एक गर्म विकृत समाधान का उपयोग करके एफएफपीई नैदानिक नमूनों के विस्तार को प्राप्त करती है, इस प्रकार जेल के भीतर पूरे प्रोटीन एपिटोप्स को संरक्षित करती है, जिसे पोस्ट-विस्तार इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए लक्षित किया जा सकता है।

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Protocol

जानवरों से जुड़ी सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और कार्नेगी मेलन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव ऊतक के नमूने व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे।

1. स्टॉक अभिकर्मकों और समाधानों की तैयारी

नोट: उपयोग किए गए अभिकर्मकों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. गेलिंग स्टॉक समाधान तैयार करें। इन्हें गेलिंग चरण से तुरंत पहले जोड़ा जाएगा।
    1. मोनोमर स्टॉक समाधान तैयार करें (4 ग्राम / 100 एमएल एन, एन- डाइमिथाइलक्रिलामाइड एसिड [डीएमएए], 50 ग्राम / 100 एमएल सोडियम एक्रिलेट [एसए], 66.7 ग्राम / 100 एमएल एक्रिलामाइड [एए], 0.10 ग्राम / पीबीएस) तालिका 1 में सूचीबद्ध घटकों का उपयोग करना। सभी स्टॉक समाधानों को पानी में घोलें या पतला करें। मोनोमर स्टॉक समाधान को कम से कम 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. पानी में निम्नलिखित स्टॉक समाधान अलग से बनाएं: 0.5% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो (4एचटी), जो ऊतकों में मोनोमर प्रसार के दौरान गेलेशन को रोकता है, और 10% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) टेट्रामेथिलइथाइथाइनामाइन (टीईएमईडी), जो अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) द्वारा शुरू की गई कट्टरपंथी पीढ़ी को तेज करता है और 10% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) पर तैयार किया जाता है।
      नोट: स्टॉक समाधान 1-2 एमएल एलिकोट में वितरित किया जा सकता है और 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; हालांकि, एपीएस को गेलिंग समाधान तैयार करने से तुरंत पहले बनाया जाता है।
  2. 1 ग्राम एसडीएस, 48.048 ग्राम यूरिया, 5 एमएल ईडीटीए (0.5 एम, पीएच 8), 10 x पीबीएस, 25 एमएल ट्राइस, 25 एमएल ट्रिस (2 एम), और 0.75 ग्राम ग्लाइसिन के संयोजन से कमरे के तापमान पर समरूपीकरण बफर (1% डब्ल्यू / वी एसडीएस, 8 एम यूरिया, 25 एमएम ईडीटीए, 25 एमएल ट्रिस (2 एम), और 0.75 ग्राम ग्लाइसिन के संयोजन से होमोजेनाइजेशन बफर (1% डब्ल्यू / वी एसडीएस, 8 एम यूरिया, 25 एमएम ईडीटीए, 2एक्स पीबीएस, पीएच 8) तैयार करें। 100 एमएल की कुल मात्रा के लिए पानी जोड़ें। समाधान को आवश्यकतानुसार बढ़ाया या नीचे किया जा सकता है और इसे आर.टी. में संग्रहीत किया जा सकता है।

2. संग्रहीत और ताजा तैयार नैदानिक ऊतक स्लाइड के लिए ऊतक तैयारी

नोट: ऊतक पूर्व-प्रसंस्करण चरण नमूने तैयार करने के तरीके के आधार पर भिन्न होते हैं।

  1. फॉर्मलाडेहाइड-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) नैदानिक नमूनों के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. नमूनों को समाधानों की अनुक्रमिक श्रृंखला में रखें (एक ग्लास स्लाइड स्टेनिंग जार या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है): जाइलीन, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और 50% इथेनॉल, इसके बाद दोगुना विआयनीकृत पानी। प्रत्येक घोल का उपयोग हर बार कम से कम 3 मिनट के लिए दो बार करें। स्लाइड को कंटेनर में रखने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें, और संबंधित समाधान के 15 एमएल जोड़ें (नमूना को कवर करने के लिए पर्याप्त)। कमरे के तापमान पर एक शेकर पर कैप्ड शंक्वाकार ट्यूब को क्षैतिज रूप से रखें।
  2. दाग और स्थायी स्लाइड ्स पर लगाए गए नमूनों के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
    1. स्लाइड को संक्षेप में जाइलीन में रखें, और रेजर ब्लेड जैसे उपयुक्त उपकरण का उपयोग करके कवरलिप्स को सावधानीपूर्वक हटा दें। यदि कवरस्लिप अटक जाती है, तो स्लाइड को जाइलीन में कमरे के तापमान पर वापस कर दें जब तक कि कवरस्लिप ढीला न हो जाए।
    2. फिर, नमूने को एफएफपीई नमूने (चरण 2.1.1) के रूप में संसाधित करें।
      नोट: हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) -दाग वाली स्लाइड के लिए, विस्तार प्रक्रिया के दौरान हेमटोक्सीलिन और ईओसिन दाग खो जाता है।
  3. इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) समाधान में अनिश्चित जमे हुए ऊतक स्लाइड के लिए, एसीटोन में ऊतकों को 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें और फिर कमरे के तापमान पर हर बार 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस समाधान के साथ तीन बार नमूने धोएं।
  4. पहले से तय जमे हुए नैदानिक ऊतक स्लाइड के लिए, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए स्लाइड को इंजेक्ट करके ओसीटी को पिघलाएं, और फिर कमरे के तापमान पर हर बार 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस समाधान से तीन बार धोएं।

3. पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड माउस मस्तिष्क के लिए ऊतक तैयारी

  1. माउस मस्तिष्क अनुभागों के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें जो 30-50 μm मोटे हैं।
    नोट: सफलता बड़े वर्गों के साथ पाई जा सकती है, लेकिन मोनोमर समाधान प्रसार और समरूपीकरण के लिए लंबे समय की आवश्यकता हो सकती है।
  2. यदि अनुभाग वर्तमान में 1x PBS समाधान में संग्रहीत नहीं हैं (उदाहरण के लिए, 1x PBS में 30% [v/v] ग्लिसरॉल और 30% [v/v] एथिलीन ग्लाइकॉल समाधान में), तो 6-से-24-वेल प्लेट में 1x PBS में कमरे के तापमान पर हर बार कम से कम 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  3. एक अनकोटेड ग्लास माइक्रोस्कोपी स्लाइड प्राप्त करें। यदि ग्लास स्लाइड के एक तरफ लेपित है, तो अनकोटेड साइड की जांच करने के लिए गीले पेंटब्रश का उपयोग करें (अक्सर, लेपित पक्ष का लेबल ग्राउंड ग्लास से बना होगा और गीला होने पर कम अपारदर्शी हो जाएगा)।
  4. अनकोटेड स्लाइड को गीला करने के लिए पेंटब्रश का उपयोग करें। पेंटब्रश के साथ अच्छी प्लेट से माउस मस्तिष्क के ऊतकों को हटा दें, और ऊतक सपाट है, यह सुनिश्चित करने के लिए रोलिंग गति का उपयोग करके इसे स्लाइड पर ध्यान से रखें। अतिरिक्त पीबीएस को ऊतक पर रहने दें जब तक कि सभी खंड लगाए न जाएं।
    नोट: जबकि एक एकल ग्लास स्लाइड का उपयोग कई ऊतक वर्गों के लिए किया जा सकता है, जब एक बार में अधिक ऊतक वर्गों को जेल किया जाता है (यहां तक कि अलग-अलग स्लाइड पर भी), यह सुनिश्चित करने के लिए अधिक देखभाल की जानी चाहिए कि वे पूरी तरह से सूख न जाएं।
  5. एक प्रयोगशाला पेपर कपड़े का उपयोग करके, स्लाइड से अतिरिक्त पीबीएस के बहुमत को हटा दें। प्रत्येक ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक छोटी तरल अंगूठी छोड़ दें, लेकिन बाकी स्लाइड को ज्यादातर सूखा छोड़ दें। यह शेष तरल ऊतक को कवर करेगा जबकि जेल मोनोमर समाधान तैयार किया जा रहा है।

4. गेलिंग

नोट: यह प्रोटोकॉल इस तकनीक के साथ उपयोग के लिए तैयार सभी ऊतक प्रकारों के लिए उपयुक्त है।

  1. ऊतक संपीड़न को रोकने के लिए ऊतक अनुभाग (चित्रा 2 ए) के दोनों ओर स्पेसर लागू करें। ऐसा करने के लिए, हीरे से लिपटे पेन का उपयोग करके कवर ग्लास के टुकड़ों को पतला काटकर स्पेसर्स बनाएं, और फिर उन्हें थोड़ी मात्रा में पानी या 1x पीबीएस का उपयोग करके स्लाइड पर सुरक्षित करें, या सुपर गोंद की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके उन्हें ठीक करें। इसके बाद, धीरे से ऊतक के दोनों ओर स्पेसर रखें।
  2. अंतिम गेलिंग समाधान तैयार करें। आम तौर पर, ~ 200 μL प्रति ऊतक अनुभाग के लिए पर्याप्त है, लेकिन मात्रा प्रति स्लाइड 800 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए। किसी भी अधिक गेलिंग समाधान का परिणाम स्पिलओवर होगा।
    नोट: मेथाक्रोलिन का उपयोग जेल में बायोमोलेक्यूल्स को लंगर डालने के लिए किया जाता है। हालांकि, कोई अलग एंकरिंग चरण की आवश्यकता नहीं है, और मेथाक्रोलिन को सीधे अंतिम गेलिंग समाधान में जोड़ा जा सकता है।
    1. प्रति अनुभाग, निम्नलिखित को क्रम में संयोजित करें: मोनोमर समाधान के 200 μL, 0.5% 4HT स्टॉक समाधान का 0.5 μL (1:400 कमजोर पड़ना), 0.2-0.5 μL मेथाक्रोलिन (ऊतक प्रकार के आधार पर 1:400-1:1,000 कमजोर पड़ना; आम तौर पर, पैराफॉर्मलडिहाइड [पीएफए] के लिए 1:1,000 कमजोर पड़ने का उपयोग करें। और 10% एपीएस स्टॉक समाधान के 5 μL (1: 40 कमजोर पड़ना)।
      नोट: उपयोग से तुरंत पहले अंतिम गेलिंग समाधान तैयार करें। समय से पहले जेलिंग को रोकने के लिए, एपीएस समाधान को अंतिम रूप से जोड़ें।
  3. ऊतक अनुभाग से अतिरिक्त समाधान निकालें, और स्लाइड को पेट्री डिश में रखें। नमूने में सभी ताजा तैयार, ठंडे जेलिंग समाधान जोड़ें, और ऊतक में प्रसार की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ऊतक पर मिश्रण को सेने दें।
  4. ऊतक और जेल समाधान के ऊपर सावधानी से एक दूसरी अनकोटेड ग्लास स्लाइड रखें। हवा के बुलबुले से बचा जाना चाहिए (चित्रा 2 बी)।
    नोट: यदि हवा के बुलबुले ऊतक पर फंस जाते हैं, तो कांच के ढक्कन को सावधानीपूर्वक उठाया जा सकता है और वापस नीचे रखा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, किसी भी मोनोमर समाधान जो फैलता है, पोलीमराइजेशन के बाद छंटनी की जा सकती है और ऊतक के लिए कोई समस्या पैदा नहीं करेगी।
  5. सुनिश्चित करें कि पोलीमराइजेशन पूरा हो गया है। यह पोलीमराइजेशन दो तरीकों से किया जा सकता है, प्रत्येक समान परिणाम उत्पन्न करता है। सबसे पहले, नमूनों को रात भर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण (जैसे नम पेपर तौलिया के साथ एक बंद पेट्री डिश) में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, अधिक तेजी से पोलीमराइजेशन के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए ह्यूमिडिफायर वातावरण में नमूनों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे।

5. नमूना पाचन और ऊतक विस्तार

नोट: यह प्रोटोकॉल सभी ऊतक प्रकारों के लिए उपयुक्त है।

  1. आंखों की सुरक्षा पहनकर, उन्हें अलग करने के लिए जेलिंग चैंबर की दो ग्लास स्लाइड्स के बीच एक रेजर ब्लेड स्लाइड करें।
    नोट: ग्लास स्लाइड बहुत आसानी से अलग होना चाहिए। यदि जेल के विभिन्न भाग दोनों स्लाइडों से चिपके हुए हैं, तो जेल को एक या दूसरे में मार्गदर्शन करने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग किया जा सकता है। यदि पोलीमराइजेशन के दौरान जेल विशेष रूप से सूखा हो गया है, तो 1x पीबीएस को जेल कक्ष के बाहर लागू किया जा सकता है, लेकिन जेल को पूरी तरह से जलमग्न न करें, क्योंकि इससे ऊतक को होमोजिनाइज़ होने से पहले इसका विस्तार होगा, जिसके परिणामस्वरूप दरार होगी।
  2. मात्रा को कम करने के लिए ऊतक के चारों ओर खाली जेल को ट्रिम करें। जेल को असममित रूप से काटने से होमोजेनाइजेशन के बाद जेल के अभिविन्यास की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है, क्योंकि नमूना पूरी तरह से पारदर्शी होगा।
  3. धीरे से रेजर ब्लेड के साथ स्लाइड से ऊतक युक्त जेल उठाएं, और धीरे से इसे पेंटब्रश के साथ 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. ट्यूब को होमोजेनाइजेशन बफर (तालिका 2) के साथ शीर्ष पर भरें, 80 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें।
  5. 8 घंटे (पीएफए-फिक्स्ड माउस मस्तिष्क के लिए) या 60 घंटे (अधिकांश एफएफपीई नैदानिक नमूने; तालिका 3 देखें) के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ नमूने को इनक्यूबेट करें।
    नोट: होमोजेनाइजेशन समय ऊतक प्रकार और निर्धारण विधि पर निर्भर है। इनमें से कई शर्तों को पहले से ही मान्य किया गया है, लेकिन दूसरों के लिए, अनुकूलन आवश्यक हो सकता है।
  6. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की सामग्री को 6-वेल प्लास्टिक सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में डालें।
  7. स्थानांतरण पाइप के साथ विकृतीकरण बफर को हटा दें।
  8. हाइड्रोजेल से शेष एसडीएस को पूरी तरह से हटाने के लिए, नमूने को 1% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (सी12ई 10) समाधान में निम्नानुसार धोएं: कमरे के तापमान पर हर बार10 मिनट के लिए कम से कम तीन बार; 60 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए; और फिर कमरे के तापमान पर हर बार 10 मिनट के लिए एक और तीन धोएं।
  9. नमूने को 1x PBS + 0.02% सोडियम एज़ाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि पोस्ट-विस्तार धुंधला और इमेजिंग करने की आवश्यकता न हो।
    नोट: इस बिंदु पर, ऊतक प्रकार के आधार पर नमूना प्रत्येक आयाम में ~ 3-4.5 गुना बड़ा होना चाहिए।

6. पोस्ट-विस्तार बायोमोलेक्यूल प्रोफाइलिंग।

  1. एंटीबॉडी धुंधला होना
    नोट: यह एक विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ)/इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला प्रोटोकॉल का पालन करता है। उपयोग किए गए प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी की मात्रा निर्माता द्वारा सुझाए गए सांद्रता पर या विशिष्ट प्रयोग के लिए अनुकूलन द्वारा निर्भर करती है। व्यक्तिगत बफर को उपयोगकर्ता के विवेक पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    1. 6-वेल सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में नमूने के साथ, विस्तारित नमूनों को हर बार 10 मिनट के लिए तीन बार आरटी में 1 x पीबीएस में धोएं, तरल को पिपेट के साथ स्थानांतरित करें।
    2. कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए एक वैकल्पिक ब्लॉकिंग चरण (उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन / 0.1% ट्राइटन-एक्स 100) करें।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला बफर (उदाहरण के लिए, 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 1 एक्स पीबीएस या 9 एक्स पीबीएस / 1% ट्राइटनएक्स / 10 मिलीग्राम / एल हेपरिन) में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। नमूना आकार के आधार पर, 0.5-2 एमएल को जेल को पर्याप्त रूप से कवर करना चाहिए।
    4. कमरे के तापमान पर 1x PBS में हर बार कम से कम 10 मिनट के लिए नमूने को तीन बार धोएं।
    5. पसंद के धुंधला बफर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट करें।
    6. कमरे के तापमान पर 1x PBS में हर बार कम से कम 10 मिनट के लिए नमूने को तीन बार धोएं।
  2. एनएचएस-एस्टर पैन-प्रोटीन धुंधला
    1. 6-वेल प्लेट में नमूने के साथ, नमूने पर पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी 200) के 1-2 एमएल डालें (इसे पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त)।
      नोट: ऊतक को सिकुड़ना चाहिए और अपने मूल पूर्व-विस्तार आकार (या इसके करीब) पर लौटना चाहिए।
    2. फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एनएचएस-एस्टर के साथ दाग 1-2 एमएल धुंधला बफर (उदाहरण के लिए, 1x PBS, 2x S.S.C., या 100 mM सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान) में R.T. पर 3 घंटे के लिए 13.3-80 μg/mL तक पतला हो जाता है।
    3. कमरे के तापमान पर 1x PBS में हर बार कम से कम 10 मिनट के लिए नमूने को तीन बार धोएं।
  3. लिपिड धुंधला होना
    नोट: एफएफपीई नैदानिक नमूनों पर पोस्ट-विस्तार लिपिड धुंधला प्रभावी नहीं है, क्योंकि निर्धारण प्रक्रिया के दौरान लिपिड खो जाते हैं।
    1. कमरे के तापमान पर 1x PBS में हर बार कम से कम 10 मिनट के लिए नमूने को तीन बार धोएं।
    2. कमरे के तापमान पर 72-96 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटनएक्स -100/1 एक्स पीबीएस के 2 एमएल में 200 गुना पतला पारंपरिक लिपोफिलिक डाई (डीआईओ, डीआईआई या डीआईडी) लागू करें।
    3. 1x PBS के साथ कम से कम तीन बार धोएं
  4. सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति (फिश)
    1. संकरण बफर में होमोजिनाइज्ड जेल के नमूने 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. मछली के लिए संकरण बफर तैयार करें: 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM सोडियम साइट्रेट, pH 7.0), 10% (v/v) डेक्सट्रान सल्फेट, 20% (v/v) एथिलीन कार्बोनेट, और 0.1% (v/v) ट्वीन20 को मिलाएं।
    3. जेल के नमूनों को एक संकरण बफर के साथ इनक्यूबेट करें जिसमें रात भर 45 डिग्री सेल्सियस पर लक्ष्य जीन (प्रति 10 केबी में कम से कम 20 जांच) के खिलाफ फिश जांच के 10 पीएम (प्रति ऑलिगो) होते हैं।
    4. स्ट्रिंगेंसी वॉश बफर (2x S.S.C. और 0.1% Tween20) से हर बार 45 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए दो बार धोएं।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर हर बार 10 मिनट के लिए दो बार स्ट्रिंगेंसी वॉश बफर से धोएं।
    6. अंत में, कमरे के तापमान पर हर बार 10 मिनट के लिए कम से कम तीन बार 1x पीबीएस से धोएं।
    7. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS + 0.02% सोडियम एज़ाइड में इमेजिंग या भंडारण के लिए तैयार हैं।
  5. पूर्ण ऊतक विस्तार और प्रतिदीप्ति इमेजिंग
    नोट: मैग्नीफाई के साथ प्राप्य विस्तार कारक ऊतक प्रकार और विस्तार विधि के साथ भिन्न होता है (एक पूर्ण सारांश तालिका 3 में पाया जा सकता है)। हालांकि, एक सामान्य अनुमान के रूप में, एक मैग्नीफाई नमूना 1x PBS में 3-4.5 गुना, PDH2Oमें 1:50 तक पतला पीबीएस में 5-7 गुना और ddH2O में 8-11 गुना विस्तार करेगा। इमेजिंग के लिए इष्टतम विस्तार कारक प्रत्येक प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है। विस्तार कारक अत्यधिक अक्षम है, जैसे कि विभिन्न पैमानों पर इमेजिंग के लिए एक एकल नमूने को कई बार विस्तारित और सिकुड़ा जा सकता है।
    1. पेंटब्रश का उपयोग करके पीबीएस में 4 गुना विस्तारित नमूनों को ग्लास-बॉटम 6-वेल इमेजिंग प्लेट में ले जाएं। किसी भी नमूने को छोटे टुकड़ों में काटकर या लचीले प्लास्टिक के पतले टुकड़े के साथ एक बड़े ग्लास-बॉटम इमेजिंग प्लेट में धीरे से रखकर आगे बढ़ाएं।
    2. एक पारंपरिक वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, या पसंद की किसी अन्य इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके प्रतिदीप्ति इमेजिंग करें। एक पेपर प्रयोगशाला कपड़े के साथ जेल के चारों ओर अतिरिक्त तरल को हटाने से इमेजिंग के दौरान जेल आंदोलन को रोका जा सकता है। इमेजिंग से पहले कांच की सतह पर 0.1% पॉली-एल-लाइसिन लागू करके जैल को स्थिर भी किया जा सकता है।
      नोट: पॉली-एल-लाइसिन का आवेदन संपर्क पर जेल को पूरी तरह से स्थिर बना देगा। इस कारण से, सावधानी बरतनी चाहिए कि जेल को बिना फोल्ड या स्ट्रेचिंग के ग्लास पर लगाया जाए। इसके अतिरिक्त, जेल को पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास पर पूरी तरह से सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए, क्योंकि इससे हटाने में मुश्किल हो सकती है, और जेल को पीबीएस में सिकुड़ा नहीं जाना चाहिए, जबकि यह अभी भी पॉली-एल-लाइसिन के साथ ग्लास से जुड़ा हुआ है, क्योंकि इससे जेल या ऊतक क्षति हो सकती है।
    3. इमेजिंग के बाद, हर बार 10 मिनट के लिए कम से कम तीन वॉश के साथ 1x पीबीएस में नमूने को सिकोड़ें, क्योंकि प्रतिदीप्ति संकेत के क्षरण के कारण नमूने को डीडीएच2ओ में दीर्घकालिक रूप से संग्रहीत करने की सिफारिश नहीं की जाती है। विशेष रूप से, लिपोफिलिक रंगों से सना पूरी तरह से विस्तारित नमूनों को पानी में डाई के पृथक्करण को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना विस्तार के समय के करीब चित्रित किया जाना चाहिए।
    4. नमूने को 1x PBS + 0.02% सोडियम एज़ाइड में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

यदि प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पूरा हो गया है (चित्रा 1), तो नमूना गर्मी विकृतीकरण के बाद स्पष्ट और सपाट दिखाई देगा; कोई भी तह या झुर्रियां अपूर्ण समरूपीकरण को इंगित करती हैं। एक सफलतापूर्वक विस्तारित नमूना 1x PBS में विस्तार से पहले की तुलना में 3-4.5 गुना बड़ा होगा और ddH2O में पूरी तरह से विस्तारित होने पर 8-11 गुना बड़ा होगा। चित्र 3 इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके संसाधित 5 μm मोटी FFPE मानव गुर्दे के नमूने की पूर्व और बाद की विस्तार छवियों का उदाहरण दिखाता है और सफलतापूर्वक 8 गुना से अधिक विस्तारित होता है। परमाणु डीएनए की कल्पना करने के लिए ऊतक को पहले डीएपीआई के साथ एसीटीएन 4 के लिए एंटीबॉडी से दाग दिया गया था। नमूना तब एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। ऊतक का इलाज उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया गया था, जिसमें एक ही लक्ष्य के पोस्ट-विस्तार धुंधलापन शामिल था, और फिर से इमेजिंग से पहले पानी (चित्रा 3 बी) में पूरी तरह से विस्तारित किया गया था। गर्मी विकृतीकरण के बाद, प्रोटीन के अलावा अन्य बायोमोलेक्यूल्स को भी चित्रित किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। लिपोफिलिक रंगों को माउस मस्तिष्क में कोशिका और माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली संरचनाओं को प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है (चित्रा 4 ए)। इसके अतिरिक्त, न्यूक्लिक एसिड को फिश के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है, जैसा कि एफएफपीई सामान्य मानव लिम्फ नोड ऊतक में चित्रा 4 बी, सी में दिखाया गया है।

चित्रा 5 एक संभावित परिणाम प्रदर्शित करता है यदि नमूना ठीक से समरूप नहीं है। विस्तार के बाद, ऊतक को एसीटीएन 4 और विमेंटिन के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था, साथ ही कार्बोहाइड्रेट को लेबल करने के लिए परमाणु डीएनए और गेहूं रोगाणु एग्लूटीनिन (डब्ल्यूजीए) की कल्पना करने के लिए डीएपीआई के साथ। स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग से पहले पीबीएस में ऊतक को 3.5 गुना विस्तारित किया गया था। एक किडनी अनुभाग (चित्रा 5 ए, सी) में, ग्लोमेरुलस के दरार-मुक्त विस्तार को देखा जा सकता है। एक अलग खंड (चित्रा 5 बी, डी) में, ऊतक में दरार स्पष्ट रूप से देखी जा सकती है।

Figure 1
चित्र 1: मैग्नीफाइंग वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। नैदानिक रूप से संग्रहीत ऊतक स्लाइड का पूर्व-प्रसंस्करण पहले भंडारण प्रारूप के आधार पर किया जाता है। फ्री-फ्लोटिंग पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड सेक्शन को केवल पीबीएस में धोया जाना चाहिए। फिर नमूनों को एक जेल मोनोमर समाधान में इनक्यूबेट किया जाता है, जिसमें बायोमोलेक्यूल्स को हाइड्रोगेल में लंगर डालने के लिए मेथाक्रोलिन शामिल होता है। सीटू पोलीमराइजेशन यूरिया, एसडीएस और ईडीटीए के साथ गर्मी विकृतीकरण से पहले किया जाता है। फिर नमूनों को पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल, फिश प्रोटोकॉल या लिपोफिलिक रंगों का उपयोग करके अच्छी तरह से धोया और दाग दिया जाता है। फिर इमेजिंग से पहले नमूने शुद्ध पानी में विस्तारित किए जाते हैं। इस आंकड़े को क्लिमास एट अल.17 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ऊतक नमूना गेलेशन कक्ष । (ए) ऊतक के प्रत्येक तरफ, दो स्पेसर, जैसे # 1.0 कवर ग्लास के दो टुकड़े, जेल मोनोमर समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर फैलाने की अनुमति देने से पहले रखे जाते हैं। संपीड़न को रोकने के लिए, स्पेसर्स ऊतक स्लाइस की तुलना में मोटा होना चाहिए। (बी) एक ढक्कन, जैसे कि दूसरी ग्लास स्लाइड, का उपयोग 37 डिग्री सेल्सियस पर पोलीमराइजेशन से पहले नमूने को कवर करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मानव गुर्दे के ऊतक अनुभाग की पूर्व-विस्तार छवियों का उदाहरण। (A) 60x आवर्धन (1.4 NA) पर ली गई एक छवि, (B) विस्तार के बाद के दृश्य के समान क्षेत्र की छवि की तुलना में 40x आवर्धन (1.15 NA, विस्तार कारक: 8.15x) पर ली गई है। मैजेंटा, डीएपीआई; पीला, एसीटीएन 4। विस्तार के बाद की छवियों की अधिकतम तीव्रता 25 फ्रेम से अधिक अनुमानित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मैग्नीफाई के साथ वैकल्पिक बायोमोलेक्यूल धुंधला रणनीतियों । (ए) (आई और iv) पूरी तरह से विस्तारित माउस मस्तिष्क ऊतक की एनएचएस-एस्टर पैन-प्रोटीन लेबलिंग। (ii और v) एक ही माउस मस्तिष्क ऊतक की लिपोफिलिक डाई (डीआईडी) लेबलिंग। (iii और vi) चैनलों का विलय हो गया। (बी) एफएफपीई सामान्य मानव लिम्फ नोड ऊतक का उपयोग करके मैग्नीफाई के साथ डीएनए मछली। विस्तार कारक: 1x PBS में 3.5x। व्हाइट, डीएपीआई; मैजेंटा, सेरीन / थ्रेओनिन काइनेज 1 जीन; सी एक्टिवेटर प्रोटीन सीडीएच 1 जीन; पीला, मानव उपग्रह अनुक्रम एस 4। (सी) बी से जुड़े अलग-अलग चैनल। सभी छवियों को 40x आवर्धन (1.15 एनए) पर एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 5 μm मोटी FFPE गुर्दे के नमूने के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) दरार मुक्त विस्तार। व्हाइट, डीएपीआई; पीला, विमेंटिन; सियान, अल्फा-एक्टिनिन 4; मैजेंटा, गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन। (बी) क्रैकिंग का प्रदर्शन करने वाला विस्तारित किडनी खंड। क्रैकिंग, विकृतियां, और लेबल किए गए लक्ष्यों का नुकसान अपर्याप्त एंकरिंग और / या होमोजेनाइजेशन का परिणाम हो सकता है। (C, D) क्रमशः ए और बी में बॉक्स किए गए क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियां। सभी छवियों को 10x (A, B; 0.45 NA) या 60x (C, D; 1.2 NA) आवर्धन पर एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: जेल मोनोमर समाधान संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: होमोजेनाइजेशन बफर संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: मान्य ऊतकों के लिए मेथाक्रोलिन और होमोजेनाइजेशन स्थितियों का सारांश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम मैग्नीफाई प्रोटोकॉल 17 प्रस्तुत करते हैं, एक एक्सएम संस्करण जो एक रासायनिक लंगर के साथ कई बायोमोलेक्यूल्स को बनाए रख सकता है और गर्मी विकृतीकरण के साथ चुनौतीपूर्ण एफएफपीई नैदानिक नमूनों को11 गुना तक विस्तारित कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण परिवर्तन जो इसे अन्य एक्सएम प्रोटोकॉल से अलग करते हैं, उनमें एक पुनर्निर्मित जेल का उपयोग शामिल है जो पूरी तरह से विस्तारित होने पर भी यांत्रिक रूप से मजबूत रहता है, साथ ही बायोमोलेक्यूल एंकर के रूप में मेथाक्रोलिन का उपयोग भी शामिल है। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम निम्नानुसार हैं: 1) अंतिम जेल समाधान की संरचना; 2) गेलेशन चरणों का समय; 3) गेलेशन चैंबर की स्थापना; 4) नमूना समरूपीकरण के लिए पैरामीटर; और 5) पोस्ट-विस्तार धुंधला होने से पहले नमूने से एसडीएस की पर्याप्त धुलाई।

इस प्रोटोकॉल के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर अंतिम गेलिंग समाधान की संरचना है, विशेष रूप से बायोमोलेक्यूल लंगर मेथाक्रोलिन की एकाग्रता। विभिन्न ऊतक प्रकारों (तालिका 3) का विस्तार करने के लिए विभिन्न मेथाक्रोलिन सांद्रता की आवश्यकता होती है, और यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि यह मूल्य विस्तारित किए जाने वाले नमूने से अच्छी तरह से मेल खाता है। मेथाक्रोलिन के साथ ओवर-एंकरिंग के परिणामस्वरूप कम विस्तार कारक और पोस्ट-विस्तार धुंधला होने के लिए उपलब्ध एपिटोप्स का नुकसान हो सकता है, जबकि अंडर-एंकरिंग, विशेष रूप से एफएफपीई नैदानिक नमूनों में, ऊतक दरारें या विकृति का परिणाम हो सकता है। इसलिए, मेथाक्रोलिन एकाग्रता को अमान्य ऊतक प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, हालांकि इष्टतम एकाग्रता संभवतः यहां प्रस्तुत सीमा के पास या भीतर गिर जाएगी। जबकि हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल अधिकांश ऊतक प्रकारों के लिए काम करेगा, यहां तक कि जिन्हें हमने अभी तक मान्य नहीं किया है, यह हड्डी वाले नमूनों के लिए काम नहीं करने के लिए जाना जाता है।

मेथाक्रोलिन से परे, एक महत्वपूर्ण जेल घटक (4एचटी या टीईएमईडी) की गलत एकाग्रता का उपयोग करने से प्रयोग की पूर्ण विफलता हो सकती है, या तो अपूर्ण या कोई गेलिंग (अत्यधिक 4एचटी) या समय से पहले गेलेशन (अत्यधिक टीईएमईडी, कम 4एचटी, या अन्य घटकों से पहले एपीएस जोड़ना) के कारण। समय से पहले गेलेशन को रोकने के लिए, नमूना और जेल को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना और 30 मिनट के लिए हवा के संपर्क में रखना और केवल नमूने को कवर करना और प्रसार प्रक्रिया पूरी होने के बाद इसे एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना आवश्यक है।

जेल कक्ष का निर्माण करते समय, दो अनकोटेड ग्लास स्लाइड के बीच स्पेसर्स को शामिल करना महत्वपूर्ण है, खासकर पीएफए-फिक्स्ड माउस मस्तिष्क जैसे मोटे ऊतक वर्गों के लिए। स्पेसर्स की कमी ऊतक संपीड़न का कारण बन सकती है, जिसके परिणामस्वरूप विकृत छवियां और गलत डेटा हो सकता है।

नमूना समरूपीकरण पाचन बफर के साथ पाचन समय, साथ ही पाचन बफर के तापमान और संरचना पर निर्भर करता है। अपर्याप्त समरूपीकरण किसी दिए गए ऊतक प्रकार के लिए रिपोर्ट किए गए मूल्य की तुलना में विकृतियों और कम विस्तार कारकों का कारण बन सकता है। यदि अपूर्ण समरूपीकरण का संदेह है, तो पाचन समय बढ़ाया जा सकता है, खासकर मोटे ऊतकों के मामले में।

एक सरल लेकिन महत्वपूर्ण कदम होमोजेनाइजेशन चरण के बाद एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (जैसे सी12ई10) के साथ नमूने से एसडीएस का पर्याप्त धुलाई है। किसी भी बचे हुए एसडीएस के परिणामस्वरूप उप-मानक या पूरी तरह से बाधित एंटीबॉडी बाइंडिंग हो सकती है। सौभाग्य से, यदि यह संदेह है, तो आगे की धुलाई और एंटीबॉडी का पुन: आवेदन अक्सर एक संतोषजनक समाधान होगा।

प्रोटोकॉल एफएफपीई नैदानिक नमूनों सहित विभिन्न ऊतक नमूनों में नैनोस्केल संरचनाओं से पूछताछ करने के लिए वर्तमान सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। मेथाक्रोलिन और गर्मी विकृतीकरण का उपयोग ऊतक निर्धारण के दौरान संरक्षित किसी भी बायोमोलेक्यूल्स के पोस्ट-विस्तार प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है (यह एफएफपीई नमूनों में लिपिड की इमेजिंग को रोकता है, उदाहरण के लिए)। हमारा प्रोटोकॉल, एक्सएम फ्रेमवर्क के विस्तार के रूप में, मॉड्यूलर है और संभवतः ऑप्टिकल सुपर-रिज़ॉल्यूशन विधियों (एसटीईडी18, स्टॉर्म 19) या पुनरावृत्ति विस्तार माइक्रोस्कोपी (आईएक्सएम)15 जैसी अन्य तकनीकों के साथ संगत है। हालांकि, इन्हें प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है, और बड़े विस्तार कारक चुनौतियां पेश कर सकते हैं, खासकर फ्लोरोफोरे कमजोर पड़ने के साथ। इसके अतिरिक्त, पानी में पूर्ण विस्तार के बाद नमूनों के बड़े आकार को संभालते समय देखभाल की आवश्यकता होती है (हालांकि यहां उपयोग किया जाने वाला जेल पिछले उच्च-विस्तार कारक एक्सएम जेल फॉर्मूलेशन की तुलना में अधिक लचीला है, जैसे कि दस गुना मजबूत विस्तार माइक्रोस्कोपी (टीआरईएक्स), मिसक्यू17 को संभालने के लिए), और इन पूरी तरह से विस्तारित जैल को स्थानांतरित करने और छवि बनाने के लिए कभी-कभी रचनात्मक समाधान की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, पेंटब्रश के बजाय पूरी तरह से विस्तारित जैल को स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक की एक पतली शीट जैसे व्यापक-आधारित उपकरणों का उपयोग करना, या कस्टम-निर्मित बड़ी इमेजिंग प्लेटों का उपयोग करना (हमारे हाथों में, इसका मतलब है लेजर-कट या 3 डी-मुद्रित प्लेटें जिनमें # 1.5 कवरग्लास के बड़े टुकड़े नीचे की ओर पालन करते हैं; इन्हें साथ के वीडियो में देखा जा सकता है)। सबसे महत्वपूर्ण बात, यह विधि पारंपरिक वाइड-फील्ड या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सामान्य जैविक और पैथोलॉजिकल नमूना तैयारी के नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देकर नैनोस्केल इमेजिंग की प्रयोज्यता को व्यापक बनाती है।

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Disclosures

लेखक निम्नलिखित प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं: Y.Z., A.K., Z.C., और B.R.G. ने मैग्नीफाई और ExM से संबंधित कई आविष्कारों का आविष्कार किया।

Acknowledgments

इस काम को कार्नेगी मेलन विश्वविद्यालय और डीएसएफ चैरिटेबल फाउंडेशन (वाईजेड और एक्सआर), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) द्वारा समर्थित किया गया था। निर्देशक का नया इनोवेटर पुरस्कार डीपी 2 OD025926-01, और कॉफमैन फाउंडेशन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acrylamide Sigma Aldrich A8887 Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)  Sigma Aldrich A3678 Initiatior
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) Sigma Aldrich P9769 Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M		 VWR BDH7830-1 Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine Sigma Aldrich G8898 Homogenization Buffer Component
Heparin Sigma Aldrich H3393
Methacrolein Sigma Aldrich 133035 Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		 Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) Sigma Aldrich M7279 Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) Sigma Aldrich 274135 Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc™ 15mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc™ 50mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientific BP399-1
Polyethylene glycol  200 Sigma Aldrich P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate (SA) AK Scientific R624 Gel Monomer component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L3771 Homogenization Buffer Component
Tris Base Fischer Scientific BP152-1 Homogenization Buffer Component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Urea Sigma Aldrich U5378 Homogenization Buffer Component
Xylenes Sigma Aldrich 214736
20x SSC Thermo Scientific AM9763
Tween20 Sigma Aldrich P1379
poly-L-lysine  Sigma Aldrich P8920

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References

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Gallagher, B. R., Klimas, A., Cheng, Z., Zhao, Y. Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy. J. Vis. Exp. (200), e65338, doi:10.3791/65338 (2023).

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