Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

RNA-fluorescens in situ-hybridisering til lang ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en metode til RNA-fluorescens in situ-hybridisering til lokalisering af lncRNA'erne i humane osteosarkomceller.

Abstract

De vigtige roller af lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) i kræft er blevet undersøgt, såsom regulering af spredning, epitel-mesenkymal overgang (EMT), migration, infiltration og autofagi af kræftceller. Lokaliseringsdetektion af lncRNA'er i celler kan give indsigt i deres funktioner. Ved at designe den lncRNA-specifikke antisensekædesekvens efterfulgt af mærkning med fluorescerende farvestoffer kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) anvendes til at detektere cellulær lokalisering af lncRNA'er. Sammen med udviklingen af mikroskopi giver RNA FISH-teknikkerne nu endda mulighed for visualisering af de dårligt udtrykte lncRNA'er. Denne metode kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA'er alene, men også detektere colokalisering af andre RNA'er, DNA eller proteiner ved anvendelse af dobbeltfarvet eller flerfarvet immunofluorescens. Her har vi inkluderet den detaljerede eksperimentelle operationsprocedure og forholdsregler for RNA FISH ved at bruge lncRNA lille nukleolært RNA-værtsgen 6 (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B) som et eksempel for at give en reference til forskere, der ønsker at udføre RNA FISH-eksperimenter, især lncRNA FISH.

Introduction

Vores forståelse af det menneskelige genom er blevet stærkt udvidet af de seneste fremskridt inden for helgenomteknologi. Ca. 93% af det menneskelige genom kan transkriberes til RNA'er, men kun 2% af RNA'erne kan oversættes til proteiner; de resterende 98% af RNA'er, der ikke har nogen proteinoversættelsesfunktion, kaldes ikke-kodende RNA (ncRNA)1. Som en klasse af ikke-kodende RNA'er (ncRNA'er) har lange ncRNA'er (lncRNA'er), der indeholder over 200 nukleotider2, tiltrukket stigende opmærksomhed på grund af deres involvering i mange fysiologiske og patologiske processer i cellerne, såsom differentiering, cykluskontrol, apoptose, migration og invasion 3,4,5. LncRNA'er spiller deres roller gennem forskellige mekanismer, såsom regulering af kromatinstruktur og nuklear genekspression, styring af mRNA-splejsningsprocessen og posttranskriptionel modifikation6. LncRNA'er regulerer forekomsten, udviklingen og metastasen af maligniteter på både transkriptionelle og posttranskriptionelle niveauer. Transskriptionel regulering realiseres i kernen ved at påvirke RNA-transkription via binding til kromosomale strukturer, mens posttranskriptionel regulering realiseres i cytoplasmaet ved at kontrollere målgenerne via en endogen kompetitiv RNA (ceRNA) mekanisme 5,7,8. CeRNA har afsløret en ny mekanisme for RNA-interaktion, nemlig at lncRNA'er kan fungere som en svamp til at adsorbere miRNA'er og hæmme den miRNA-medierede nedbrydning af beslægtede målgener9. Derfor er oplysningerne om subcellulær lokalisering af lncRNA'er, uanset om et specifikt lncRNA er placeret i cytoplasma eller kernen, vigtige for at hjælpe med at identificere deres biologiske funktioner.

På nuværende tidspunkt detekteres lncRNA-lokalisering hovedsageligt ved to metoder, den ene er ved kerne / cytoplasmafraktionsisoleringsassay, og den anden er ved RNA FISH. I førstnævnte ekstraheres RNA'er i henholdsvis de cytoplasmatiske og de nukleare fraktioner, og derefter udføres PCR-amplifikation med specifikke lncRNA-primere for at detektere forholdet mellem lncRNA'er i cytoplasma og kerne. Fordelen ved denne metode er tidseffektivitet, mens ulempen er, at den faktiske lncRNA-lokalisering ikke afspejles direkte af den relative andel af lncRNA'er i cytoplasma og kerne. RNA FISH kan detektere lncRNA-lokalisering i celler gennem design af lncRNA-specifikke antisensekædesekvenser efterfulgt af mærkning med fluorescerende farvestoffer10. RNA FISH-metoderne er blevet forbedret med fremskridt inden for sondeteknikker og detektionsmetoder, herunder fluoroformærkede multiple oligo-sondesæt11, LNA-sonder12 og forgrenede DNA-sonder (bDNA)13. RNA FISH kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA, men også detektere colokalisering af andre RNA'er, DNA eller proteiner ved hjælp af dobbeltfarvet eller flerfarvet immunofluorescens14.

I dette arbejde har vi inkluderet den detaljerede intracellulære lokaliseringsdetekteringsprotokol for lncRNA lille nukleolært RNA-værtsgen 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) af RNA FISH som et eksempel. SNHG6 er et 600-730 nukleotid-lncRNA i sin modne splejsede form og identificeret som et nyt onkogen i forskellige humane kræftformer, herunder kolorektal cancer, gastrisk kræft, ovarie klarcellekarcinom, osteosarkom og hepatocellulært karcinom15,16,17,18. Undersøgelser har bekræftet involvering af SNHG6 i kræftcellers biologiske adfærd, såsom proliferation, EMT og autofagi, og vist cytoplasmatisk lokalisering af SNHG6, hvor det kan påvirke målgenerne ved at binde (svampe) miRNA'erne15,16,17. Denne detaljerede detektionsprotokol for SNHG6 intracellulær lokalisering af RNA FISH er præsenteret heri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol. Figur 1 viser den overordnede protokol for RNA FISH; Tabel 1 indeholder sammensætningen af alle opløsninger, og tabel 2 indeholder de primersekvenser, der anvendes i denne protokol.

1. Forberedelse af sonde

  1. Identificer og erhverver FASTA-sekvensen af et mål-lncRNA af interesse, for eksempel fra GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Følg indikationerne på hjemmesiden, design ISH-sonderne online19, og gennemgå designalgoritmens forslag til at liste de sonder, der skal bestilles med Cy3-etiket.
  2. Hybridiseringsbufferen inkuberes ved 37 °C i 2 timer på forhånd.
  3. 4 sonde med optisk densitet (OD) opløses i 160 μL diethylpyrcarbonat (DEPC)-behandlet ddH2O i en koncentration på 1 mg/ml væk fra lys.
    BEMÆRK: Optisk densitet (OD) repræsenterer måleenheden for DNA og RNA. Normalt er 1 OD-enhed = 33 μg / ml DNA.
  4. Der fremstilles 200 μL af sondeblandingen til hver brønd (1,2 μL-10 μL sonde, 70 μL hybridiseringsbuffer, udgør volumenet med DEPC-behandlet ddH2O til 200 μL), og der opstilles en serie på 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml og 6 μg/ml.
    BEMÆRK: Sondekoncentrationen skal undersøges eksperimentelt på forhånd. En høj sondekoncentration vil føre til ikke-specifik binding af lncRNA'er, mens en lav sondekoncentration vil føre til ufølsom eller mislykket påvisning af lncRNA'er.
  5. Denaturer sondeblandingen ved 73 °C i 5 min.
    BEMÆRK: Hvis den Cy3-mærkede DNA-sonde er dobbeltstrenget, denatureres sonden til enkeltstrenget DNA ved 95 °C i 5 minutter og afkøles derefter hurtigt i 2 minutter på is.

2. Celle forberedelse

  1. Der sås 50.000 143B-celler pr. brønd på sterile glasdæksler i en 12-brønds cellekulturplade og inkuberes i 24 timer (37 °C, 5% CO2) i DMEM.
    BEMÆRK: Det specifikke cellenummer, der er podet her, varierer med cellestørrelsen, hvilket er passende for de frøede celler at nå en sammenløb på 50% efter at være blevet inkuberet i 24 timer. De sterile glasdæksler er runde, så de passer til 12-brøndspladen.
  2. Fjern mediet og vask i 2 x 5 min med 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Forbered 1x PBS med DEPC-behandlet ddH2O. PBS uden DEPC-behandling kan ikke anvendes, fordi den indeholder RNase. Udfør alle følgende trin under RNase-frie forhold.
  3. Fjern 1x PBS og tilsæt 200 μL 100% ethanol i hvert hul for at fiksere i 15 minutter ved stuetemperatur.
  4. Fjern ethanolen, tilsæt 200 μL 0,1% Triton X-100 (i 1x PBS) i hvert hul, og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Tiden skal kontrolleres strengt med Triton X-100 permeabilisering og kan ikke være for lang.
  5. Fjern 0,1% Triton X-100 og vask 2 x 5 min med 1x PBS.
    BEMÆRK: Hvis protokollen skal sættes på pause her, udskiftes PBS med 70 % ethanol (fortynding af 100 % ethanol med RNasefri ddH2O) og opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
  6. 1x PBS fjernes, der tilsættes 200 μL 2x natriumsaltvandscitrat (SSC)-buffer (fortynding af 20x SSC med RNasefri ddH2O) i hvert hul, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
  7. Fjern 2x SSC-buffer, tilsæt 200 μL 70% ethanol i hver brønd, og inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
  8. Kassér 70% ethanol, tilsæt 200 μL 85% ethanol (fortynding af 100% ethanol med RNasefri ddH2O) i hvert hul, og inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
  9. Kassér 85% ethanol, tilsæt 200 μL 100% ethanol i hvert hul, og inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
  10. Absorber og kassér 100% ethanol; Lad brøndene tørre.

3. Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

  1. Der tilsættes 200 μL sondeblanding (denatureret som i trin 1.5) til hvert hul og inkuberes ved 37 °C natten over (16-18 timer).
    BEMÆRK: Der er en stærk positiv sammenhæng mellem hybridiseringstemperatur og sondekoncentration; For at optimere baggrunden bør både hybridiseringstemperaturen og sondekoncentrationen derfor reduceres.
  2. Næste dag udtages prøver fra 37 °C, og sondeblandingen kasseres. Tilsæt 200 μL 0,4x SSC/0,3% Tween-20 buffer til hvert hul (forvarmet til 65 °C) og vask i 2 minutter ved stuetemperatur.
  3. Fjern 0,4x SSC/0,3% Tween-20 bufferen, tilsæt 200 μL 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer til hvert hul, og vask i 2 min ved stuetemperatur.
  4. Fjern 2x SSC / 0.1% Tween-20 buffer, tilsæt 200 μL 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvningsopløsning (1 μg / ml), og pletter i 20 minutter væk fra lys.
  5. Kassér DAPI-farveopløsningen og vask med 1x PBS i 2 minutter ved stuetemperatur.
  6. Tilsæt 50 μL monteringsmedium indeholdende tyggegummi på diaset, og placer glasdækslet på objektglasset for at fastgøre.
    BEMÆRK: Sørg for at placere dækslet på diaset med cellesiden nedad.
  7. Overhold under et fluorescensmikroskop.
    BEMÆRK: Brug et fluorescensmikroskop eller et laserkonfokalmikroskop; Sidstnævnte giver en højere følsomhed og klarhed billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative billeder af SNHG6 FISH i humane osteosarkomceller vises (figur 2). Den negative kontrol behandles med den negative Ctrl-sonde; positiv kontrol behandles med U6 sonde 20. SNHG6-sonde og U6-sonde er mærket med Cy3, som udsender rød fluorescens. DAPI er et farvestof, der pletter DNA'et, som udsender blå fluorescens. Dette resultat viser, at SNHG6 hovedsageligt er lokaliseret i cytoplasmaet, og disse oplysninger kan give en vigtig retning for yderligere undersøgelse af SNHG6.

Hvis der anvendes en meget høj koncentration af sonde, kan en baggrundsfarve ses under fluorescensmikroskopet. Figur 3 viser de repræsentative billeder, når en høj koncentration af SNHG6-sonde anvendes i RNA FISH. De hvide pile repræsenterer uspecifik farvning.

Figure 1
Figur 1: Flowdiagram over RNA FISH-protokollen for lncRNA. Dette diagram viser nøgleprotokollen for RNA FISH-eksperimentprocessen. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; lncRNA = langt ikke-kodende RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Lokalisering af LncRNA (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B). Negativ kontrol behandles med en negativ kontrolsonde. Positiv kontrol behandles med en U6-sonde . SNHG6 og U6 sonder er mærket med Cy3, som udsender rød fluorescens. DAPI er et farvestof, der pletter DNA'et og udsender blå fluorescens. Rød og blå smelter sammen for at gøre lyserød. Billederne er taget ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: LncRNA = langt ikke-kodende RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: De repræsentative billeder af høj koncentration af SNHG6-sonde i RNA FISH. SNHG6-sonder er mærket med Cy3, som udsender rød fluorescens. DAPI er et farvestof, der pletter DNA'et og udsender blå fluorescens. Rød og blå smelter sammen for at gøre lyserød. Billederne er taget ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætningen af opløsninger anvendt i RNA FISH-hybridiseringseksperimentet. Alle fortyndinger skal udføres med sterilt, RNasefrit vand. Alt tilsat vand er DEPC-behandlet ddH2O. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DEPC = diethylpyrocarbonat. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Alle sondesekvenser anvendt i dette eksperiment. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne RNA FISH-protokol kan ikke kun detektere lokaliseringen af lncRNA'er i celler, men også detektere colokalisering af andre RNA'er, DNA eller proteiner i celler, som også kan bruges til at detektere placeringen af lncRNA'er i paraffinindlejrede væv. Den specifikke protokol i sådanne tilfælde er imidlertid anderledes, fordi det paraffinindlejrede væv skal afvokses21. Denne eksperimentelle procedure kan anvendes i 48- eller 96-brøndplader, men 384-brøndplader er for små til at blive brugt her.

Flere kritiske trin i denne metode skal bemærkes, herunder det RNase-frie miljø, sondekoncentration, hybridiseringstemperatur og indstilling af negative og positive kontroller. For det første er den RNase-fri tilstand afgørende, fordi RNase nedbryder bindingerne mellem nukleotider og fører til nedbrydning af lncRNA'er generelt. For det andet varierer den almindeligt anbefalede sondekoncentration fra 5 til 50 μg / ml. En høj sondekoncentration vil føre til ikke-specifik binding af lncRNA'er, mens en lav sondekoncentration vil føre til ufølsom eller mislykket påvisning af lncRNA'er19. Hvis der anvendes en meget høj koncentration af sonde, kan en baggrundsfarve ses under fluorescensmikroskopet, selv i nærvær af en krypteret sonde (en negativ kontrol); Derfor anvendes de samme koncentrationer af negative kontroller normalt til at opstille basislinjen (samme som den interne kontrol) under de indledende forsøg, der undersøger den passende sondekoncentration for at undgå enhver ikke-specifik binding. Den højeste sondekoncentration uden baggrundsfarve i den negative kontrolgruppe, der præsenterede den stærkeste signalering uden ikke-specifik binding, blev anvendt i følgende eksperimenter. For det tredje anbefales det at designe mindst to eller tre sonder til optimering med et specifikt lncRNA. Samtidig kan to eller flere sonder også blandes for at forbedre detektionsfølsomheden af mål-lncRNA'er. For det fjerde er den normale hybridiseringstemperatur for lncRNA-sonden 37 ° C. Under hybridiseringsprocessen skal hybridiseringstemperaturen holdes konstant og ensartet. Området for hybridiseringstemperatur mellem forskellige sonder er 34 til 38 ° C. Hybridiseringstemperaturen er stærkt positivt korreleret med sondekoncentrationen; For at optimere baggrunden bør sondekoncentrationen derfor reduceres. Endelig er det også vigtigt at indføre negative og positive kontroller. Gruppen uden sonde bruges som en negativ kontrol til opnåelse af baggrundssignaler. En U6-sonde eller en ribosomal RNA-sonde anvendes som en positiv kontrol for at udelukke muligheden for falske positive resultater.

Denne tilgang har flere fordele. Fluorescensfarven på lncRNA-sonder kan ændres. Grøn fluorescens udsendes af fluoresceinisothiocyanat (FITC), fluorescein (FAM) og Alexa Fluor 488, mens rød fluorescens udsendes af Cy3 og Alexa Fluor 555. FITC bruges til typisk grøn og Cy3 til typisk rød. Derudover kan billederne opnås ved hjælp af enten et fluorescensmikroskop eller et laserkonfokalmikroskop. Sidstnævntes billeder er mere følsomme og klarere end dem, der erhverves ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

Begrænsningen ved RNA FISH-metoden er, at dette er en kvalitativ metode; Derfor er resultaterne ikke kvantificerbare. På grund af ændringen i hybridiseringstid og indflydelsen af subjektive faktorer under fluorescensmikroskopobservation kan lncRNA-ekspression ikke kvantificeres nøjagtigt i celler. Ekspressionsniveauerne af lncRNA'er i forskellige cellulære fraktioner kan kun evalueres kvalitativt. Med forbedring af teknikken er der imidlertid udviklet en enkeltmolekylefluorescerende in situ-hybridiseringsmetode22 til kvantificering af RNA-ekspressionsniveauet; mere smFISH-detektion kan rapporteres i fremtiden.

RNA FISH-teknikken har en bred vifte af anvendelser. Den intracellulære lokaliseringsdetektion af lncRNA'er vil gavne undersøgelsen af de biologiske mekanismer af lncRNA'er. Samtidig kan denne teknik også bruges til at detektere lokalisering af andre ikke-kodende RNA'er i celler, herunder circRNA'er, miRNA'er og tRNA'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde understøttes af tilskud fra (1) National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); 2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408) 3) Shanghai Collaborative Innovation Center for industriel transformation af TCM-forberedelse til hospitaler (4) Forskningsprojekter inden for budgettet for Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).

Tags

RNA-fluorescens in situ-hybridisering lange ikke-kodende RNA'er kræft proliferation epitel-mesenkymal overgang migration infiltration autofagi cellulær lokalisering fluorescerende farvestoffer RNA FISH-teknikker mikroskopi dårligt udtrykte LncRNA'er colokalisering dobbeltfarvet immunofluorescens flerfarvet immunofluorescens eksperimentel driftsprocedure forholdsregler
RNA-fluorescens <em>in situ-hybridisering</em> til lang ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou,… More

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter