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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Hibridização in situ por fluorescência de RNA para localização de RNA longo e não codificante em células de osteossarcoma humano

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

O presente protocolo descreve um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA para localizar os lncRNAs em células humanas de osteossarcoma.

Abstract

Os papéis importantes dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no câncer têm sido estudados, tais como a regulação da proliferação, transição epitélio-mesenquimal (EMT), migração, infiltração e autofagia de células cancerosas. A detecção de localização de lncRNAs em células pode fornecer informações sobre suas funções. Ao projetar a sequência de cadeia antisense específica para lncRNA seguida de marcação com corantes fluorescentes, a hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser aplicada para detectar a localização celular de lncRNAs. Juntamente com o desenvolvimento da microscopia, as técnicas de RNA FISH agora permitem até mesmo a visualização dos lncRNAs mal expressos. Este método pode não só detectar a localização de lncRNAs sozinho, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA, ou proteínas usando imunofluorescência de cor dupla ou multicolorida. Aqui, incluímos o procedimento detalhado de operação experimental e precauções de RNA FISH usando lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) em células humanas de osteossarcoma (143B) como um exemplo, para fornecer uma referência para pesquisadores que desejam realizar experimentos de RNA FISH, especialmente lncRNA FISH.

Introduction

Nossa compreensão do genoma humano tem sido grandemente expandida pelos recentes avanços na tecnologia do genoma completo. Cerca de 93% do genoma humano pode ser transcrito em RNAs, mas apenas 2% dos RNAs podem ser traduzidos em proteínas; os 98% restantes dos RNAs que não têm função de tradução de proteínas são chamados de RNA não codificantes (ncRNA)1. Como uma classe de RNAs não codificantes (ncRNAs), os ncRNAs longos (lncRNAs), contendo mais de 200 nucleotídeos2, têm atraído atenção crescente devido ao seu envolvimento em muitos processos fisiológicos e patológicos das células, como diferenciação, controle do ciclo, apoptose, migração e invasão 3,4,5 . Os LncRNAs desempenham seu papel através de vários mecanismos, tais como regulação da estrutura da cromatina e expressão gênica nuclear, controle do processo de splicing de RNAm e modificação pós-transcricional6. Os LncRNAs regulam a ocorrência, o desenvolvimento e a metástase de malignidades em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é realizada no núcleo por afetar a transcrição do RNA via ligação às estruturas cromossômicas, enquanto a regulação pós-transcricional é realizada no citoplasma pelo controle dos genes-alvo via mecanismo endógeno competitivo de RNA (ceRNA)5,7,8. O CeRNA revelou um novo mecanismo de interação de RNA, a saber, que os lncRNAs podem atuar como uma esponja para adsorver miRNAs e inibir a degradação mediada por miRNA de genes-alvorelacionados9. Portanto, as informações sobre a localização subcelular dos lncRNAs, se um lncRNA específico está localizado no citoplasma ou no núcleo, são importantes para ajudar a identificar suas funções biológicas.

Atualmente, a localização do lncRNA é detectada principalmente por dois métodos, um é por ensaio de isolamento da fração núcleo/citoplasma e o outro é por RNA FISH. No primeiro, os RNAs nas frações citoplasmática e nuclear são extraídos respectivamente e, em seguida, a amplificação por PCR é realizada com primers específicos de lncRNA para detectar a proporção de lncRNAs no citoplasma e núcleo. A vantagem deste método é a eficiência do tempo, enquanto a desvantagem é que a localização real do lncRNA não é diretamente refletida pela proporção relativa de lncRNAs no citoplasma e núcleo. RNA FISH pode detectar a localização de lncRNA em células através do planejamento de sequências de cadeia antisense específicas para lncRNA seguidas de marcação com corantes fluorescentes10. Os métodos de RNA FISH foram aprimorados com os avanços nas técnicas de sonda e métodos de detecção, incluindo conjuntos de múltiplas sondas oligo marcadas com fluoróforos11, sondas LNA 12 e sondas de DNA ramificado (bDNA)13. RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNA, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas usando imunofluorescência de dupla cor ou multicolorida14.

Neste trabalho, incluímos como exemplo o protocolo detalhado de detecção de localização intracelular do gene 6 do RNA nucleolar pequeno RNA do lncRNA (SNHG6) em células de osteossarcoma (143B) por RNA FISH. SNHG6 é um lncRNA de nucleotídeo 600-730 em sua forma spliced madura e identificado como um novo oncogene em diversos cânceres humanos, incluindo câncer colorretal, câncer gástrico, carcinoma de células claras do ovário, osteossarcoma e carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Estudos têm confirmado o envolvimento do SNHG6 em comportamentos biológicos de células cancerosas, como proliferação, EMT e autofagia, e demonstrado a localização citoplasmática do SNHG6 onde ele pode afetar os genes alvo por ligação (esponja) aos miRNAs15,16,17. Este protocolo detalhado de detecção da localização intracelular do SNHG6 por RNA FISH é apresentado neste artigo.

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Protocol

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. A Figura 1 mostra o protocolo geral para RNA FISH; A Tabela 1 contém a composição de todas as soluções e a Tabela 2 contém as sequências de primers utilizadas neste protocolo.

1. Preparação da sonda

  1. Identificar e adquirir a sequência FASTA de um lncRNA alvo de interesse, por exemplo, do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguindo as indicações no site, projete as sondas ISH online19 e revise as sugestões do algoritmo de design para listar as sondas a serem encomendadas com o rótulo Cy3.
  2. Incubar o tampão de hibridização a 37 °C durante 2 h de antecedência.
  3. Dissolver 4 sondas de densidade óptica (OD) em 160 μL de ddH2O tratado com dietilpirocarbonato (DEPC) na concentração de 1 mg/mL longe da luz.
    NOTA: A densidade óptica (DO) representa a unidade de medida do DNA e do RNA. Geralmente, 1 unidade OD = 33 μg/mL de DNA.
  4. Preparar 200 μL da mistura de sonda para cada poço (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampão de hibridização, completar o volume com ddH2O a 200 μL tratados com DEPC) e montar uma série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6 μg/mL.
    NOTA: A concentração da sonda precisa ser explorada experimentalmente com antecedência. Uma alta concentração de sonda levará à ligação não específica de lncRNAs, enquanto uma baixa concentração de sonda levará à detecção insensível ou falha de lncRNAs.
  5. Desnaturar a mistura da sonda a 73 °C durante 5 min.
    NOTA: Se a sonda de DNA marcada com Cy3 for de fita dupla, desnature a sonda para DNA de fita simples a 95 °C por 5 minutos e, em seguida, resfrie rapidamente por 2 minutos no gelo.

2. Preparação celular

  1. Semear 50.000 células 143B por poço em lamínulas de vidro estéril em uma placa de cultura celular de 12 poços e incubá-las por 24 h (37 °C, 5% CO2) em DMEM.
    NOTA: O número específico de células semeadas aqui varia com o tamanho da célula, o que é apropriado para que as células semeadas atinjam uma confluência de 50% após serem incubadas por 24 h. As tampas de vidro estéreis são redondas para serem adequadas para a placa de 12 poços.
  2. Retire o meio e lave por 2 x 5 min com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    NOTA: Preparar 1x PBS com ddH2O. O PBS sem tratamento com DEPC não pode ser usado porque contém RNase. Execute todas as etapas a seguir em condições livres de RNase.
  3. Remover 1x PBS e adicionar 200 μL de etanol 100% em cada poço para fixar por 15 min à temperatura ambiente.
  4. Retire o etanol, adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,1% (em 1x PBS) em cada poço e incube por 15 min à temperatura ambiente.
    NOTA: O tempo precisa ser rigorosamente controlado com permeabilização Triton X-100 e não pode ser muito longo.
  5. Retire Triton X-100 a 0,1% e lave 2 x 5 min com 1x PBS.
    NOTA: Se o protocolo tiver que ser pausado aqui, substitua o PBS por etanol 70% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) e armazene a amostra a 4 °C por até 3 meses.
  6. Remover 1x PBS, adicionar 200 μL de 2x tampão citrato salino de sódio (SSC) (diluição de 20x SSC com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C.
  7. Remover 2x tampão SSC, adicionar 200 μL de etanol 70% em cada poço e incubar por 3 min à temperatura ambiente.
  8. Descarte o etanol 70%, adicione 200 μL de etanol 85% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.
  9. Descarte o etanol 85%, adicione 200 μL de etanol 100% em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.
  10. Absorver e descartar etanol 100%; deixe os poços secarem.

3. Hibridação in situ fluorescente (FISH)

  1. Adicionar 200 μL de mistura de sonda (desnaturada como no passo 1.5) a cada poço e incubar a 37 °C durante a noite (16-18 h).
    NOTA: Existe uma forte correlação positiva entre a temperatura de hibridização e a concentração de sonda; Portanto, para otimizar o fundo, tanto a temperatura de hibridização quanto a concentração de sonda devem ser reduzidas.
  2. No dia seguinte, retire amostras a 37 °C e elimine a mistura de sonda. Adicionar 200 μL de tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada poço (pré-aquecido a 65 °C) e lavar por 2 min à temperatura ambiente.
  3. Remova o tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20, adicione 200 μL de 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer a cada poço e lave por 2 min à temperatura ambiente.
  4. Remover 2x tampão SSC/Tween-20 a 0,1%, adicionar 200 μL de solução corante com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) e corar por 20 min longe da luz.
  5. Eliminar a solução corante DAPI e lavar com 1x PBS durante 2 minutos à temperatura ambiente.
  6. Adicione 50 μL de meio de montagem contendo goma na lâmina e coloque a tampa de vidro na corrediça para fixar.
    NOTA: Certifique-se de colocar a tampa no slide com o lado da célula para baixo.
  7. Observe sob um microscópio de fluorescência.
    NOTA: Use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal a laser; este último produz uma imagem de maior sensibilidade e clareza.

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Representative Results

Imagens representativas de FISH SNHG6 em células humanas de osteossarcoma são mostradas (Figura 2). O controle negativo é tratado com a sonda Ctrl negativa; o controle positivo é tratado com sonda U6 20. A sonda SNHG6 e a sonda U6 são marcadas com Cy3, que emite fluorescência vermelha. DAPI é um corante que cora o DNA, que emite fluorescência azul. Esse resultado mostra que o SNHG6 está localizado principalmente no citoplasma, e essa informação pode fornecer uma direção importante para estudos posteriores do SNHG6.

Se uma concentração muito alta de sonda é usada, uma cor de fundo pode ser vista sob o microscópio de fluorescência. A Figura 3 mostra as imagens representativas quando uma alta concentração da sonda SNHG6 é usada em RNA FISH. As setas brancas representam coloração inespecífica.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma do protocolo RNA FISH para lncRNA. Este gráfico mostra o protocolo chave do processo de experimento RNA FISH. Abreviações: FISH = hibridação in situ fluorescente; lncRNA = RNA longo não codificante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Localização do LncRNA (SNHG6) em células de osteossarcoma humano (143B). O controle negativo é tratado com uma sonda de controle negativo. O controle positivo é tratado com uma sonda U6 . As sondas SNHG6 e U6 são marcadas com Cy3, que emite fluorescência vermelha. DAPI é um corante que cora o DNA e emite fluorescência azul. Vermelho e azul se fundem para fazer rosa. As imagens são obtidas em microscópio de fluorescência. Barra de escala = 10 μm. Abreviações: LncRNA = RNA longo não codificante; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens representativas de alta concentração da sonda SNHG6 no RNA FISH.As sondas SNHG6 são marcadas com Cy3, que emite fluorescência vermelha. DAPI é um corante que cora o DNA e emite fluorescência azul. Vermelho e azul se fundem para fazer rosa. As imagens são obtidas em microscópio de fluorescência. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição das soluções utilizadas no experimento de hibridização RNA FISH. Todas as diluições devem ser feitas com água estéril e livre de RNase. Toda a água adicionada é DDH2O. Abreviaturas: FISH = hibridação in situ fluorescente; DEPC = dietilpirocarbonato. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Todas as sequências de sonda utilizadas neste experimento. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Este protocolo de RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNAs em células, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas nas células, que também podem ser usados para detectar a localização de lncRNAs em tecidos embebidos em parafina. Entretanto, o protocolo específico nesses casos é diferente, pois os tecidos emblocados em parafina necessitam ser desparafinados21. Este procedimento experimental pode ser aplicado em placas de 48 ou 96 poços, mas placas de 384 poços são muito pequenas para serem usadas aqui.

Várias etapas críticas deste método precisam ser observadas, incluindo o ambiente livre de RNase, a concentração da sonda, a temperatura de hibridização e o estabelecimento de controles negativos e positivos. Primeiro, a condição livre de RNase é crucial porque a RNase quebra as ligações entre nucleotídeos e leva à degradação de lncRNAs em geral. Em segundo lugar, a concentração de sonda comumente recomendada varia de 5 a 50 μg/mL. Uma alta concentração de sonda levará à ligação inespecífica de lncRNAs, enquanto uma baixa concentração de sonda levará à detecção insensível ou falha de lncRNAs19. Se uma concentração muito alta de sonda é usada, uma cor de fundo pode ser vista sob o microscópio de fluorescência, mesmo na presença de uma sonda embaralhada (um controle negativo) apenas; Portanto, as mesmas concentrações de controles negativos são geralmente usadas para estabelecer a linha de base (o mesmo que o controle interno) durante os experimentos preliminares explorando a concentração de sonda apropriada para evitar qualquer ligação não específica. A maior concentração de sonda sem cor de fundo no grupo controle negativo, apresentando a sinalização mais forte sem ligação inespecífica, foi utilizada nos experimentos seguintes. Em terceiro lugar, recomenda-se projetar pelo menos duas ou três sondas para otimização com um lncRNA específico. Ao mesmo tempo, duas ou mais sondas também podem ser misturadas para melhorar a sensibilidade de detecção de lncRNAs alvo. Quarto, a temperatura normal de hibridização da sonda de lncRNA é de 37 °C. Durante o processo de hibridização, a temperatura de hibridização deve ser mantida constante e uniforme. A faixa de temperatura de hibridização entre diferentes sondas é de 34 a 38 °C. A temperatura de hibridização é fortemente correlacionada positivamente com a concentração de sonda; portanto, para otimizar o fundo, a concentração da sonda deve ser reduzida. Por fim, também é fundamental estabelecer controles negativos e positivos. O grupo sem sonda é usado como um controle negativo para obter sinais de fundo. Uma sonda U6 ou uma sonda de RNA ribossomal é usada como controle positivo para descartar a possibilidade de resultados falso-positivos.

Esta abordagem tem várias vantagens. A cor de fluorescência das sondas de lncRNA pode ser alterada. A fluorescência verde é emitida pelo isotiocianato de fluoresceína (FITC), fluoresceína (FAM) e Alexa Fluor 488, enquanto a fluorescência vermelha é emitida por Cy3 e Alexa Fluor 555. FITC é usado para o verde típico e Cy3 para o vermelho típico. Além disso, as imagens podem ser obtidas usando um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal a laser. As imagens deste último são mais sensíveis e nítidas do que aquelas adquiridas com o uso de um microscópio de fluorescência.

A limitação do método RNA FISH é que este é um método qualitativo; portanto, os resultados não são quantificáveis. Devido à mudança no tempo de hibridização e à influência de fatores subjetivos durante a observação em microscópio de fluorescência, a expressão de lncRNA não pode ser quantificada com precisão nas células. Os níveis de expressão de lncRNAs em diferentes frações celulares só podem ser avaliados qualitativamente. Entretanto, com o aprimoramento da técnica, um método de hibridização in situ fluorescente de molécula única (SMFISH)22 foi desenvolvido para quantificar o nível de expressão de RNA; mais detecção de SMFISH pode ser relatada no futuro.

A técnica RNA FISH tem uma ampla gama de aplicações. A detecção da localização intracelular de lncRNAs beneficiará o estudo dos mecanismos biológicos dos lncRNAs. Ao mesmo tempo, essa técnica também pode ser usada para detectar a localização de outros RNAs não codificantes nas células, incluindo circRNAs, miRNAs e tRNAs.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado por subsídios de (1) o Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600); (2) a National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Projetos de Pesquisa dentro do Orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047).

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

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