Summary
Il presente protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell'RNA per localizzare gli lncRNA in cellule di osteosarcoma umano.
Abstract
Sono stati studiati gli importanti ruoli degli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) nel cancro, come la regolazione della proliferazione, la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), la migrazione, l'infiltrazione e l'autofagia delle cellule tumorali. Il rilevamento della localizzazione degli lncRNA nelle cellule può fornire informazioni sulle loro funzioni. Progettando la sequenza della catena antisenso specifica per lncRNA seguita da marcatura con coloranti fluorescenti, è possibile applicare l'ibridazione in situ fluorescente dell'RNA (FISH) per rilevare la localizzazione cellulare degli lncRNA. Insieme allo sviluppo della microscopia, le tecniche RNA FISH ora consentono anche la visualizzazione degli lncRNA scarsamente espressi. Questo metodo non solo è in grado di rilevare la localizzazione dei soli lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l'immunofluorescenza bicolore o multicolore. Qui, abbiamo incluso la procedura operativa sperimentale dettagliata e le precauzioni di RNA FISH utilizzando il gene ospite 6 (SNHG6) dell'RNA nucleolare piccolo lncRNA in cellule di osteosarcoma umano (143B) come esempio, per fornire un riferimento per i ricercatori che desiderano eseguire esperimenti di RNA FISH, in particolare lncRNA FISH.
Introduction
La nostra comprensione del genoma umano è stata notevolmente ampliata dai recenti progressi nella tecnologia dell'intero genoma. Circa il 93% del genoma umano può essere trascritto in RNA, ma solo il 2% degli RNA può essere tradotto in proteine; il restante 98% degli RNA che non hanno funzione di traduzione delle proteine sono chiamati RNA non codificanti (ncRNA)1. Come classe di RNA non codificanti (ncRNA), gli ncRNA lunghi (lncRNA), contenenti oltre 200 nucleotidi2, hanno attirato una crescente attenzione a causa del loro coinvolgimento in molti processi fisiologici e patologici delle cellule, come il differenziamento, il controllo del ciclo, l'apoptosi, la migrazione e l'invasione 3,4,5. Gli LncRNA svolgono il loro ruolo attraverso vari meccanismi, come la regolazione della struttura della cromatina e dell'espressione genica nucleare, il controllo del processo di splicing dell'mRNA e la modificazione post-trascrizionale6. Gli LncRNA regolano l'insorgenza, lo sviluppo e la metastasi delle neoplasie maligne sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. La regolazione trascrizionale si realizza nel nucleo influenzando la trascrizione dell'RNA attraverso il legame alle strutture cromosomiche, mentre la regolazione post-trascrizionale si realizza nel citoplasma controllando i geni bersaglio tramite un meccanismo di RNA endogeno competitivo (ceRNA) 5,7,8. CeRNA ha rivelato un nuovo meccanismo di interazione con l'RNA, vale a dire che gli lncRNA possono agire come una spugna per adsorbire i miRNA e inibire la degradazione mediata dai miRNA dei geni bersaglio correlati9. Pertanto, le informazioni riguardanti la localizzazione subcellulare degli lncRNA, se uno specifico lncRNA si trova nel citoplasma o nel nucleo, sono importanti per aiutare a identificare le loro funzioni biologiche.
Attualmente, la localizzazione dell'lncRNA viene rilevata principalmente con due metodi, uno mediante il saggio di isolamento della frazione nucleo/citoplasma e l'altro mediante RNA FISH. Nel primo caso, gli RNA nella frazione citoplasmatica e nucleare vengono estratti rispettivamente, quindi l'amplificazione PCR viene eseguita con specifici primer di lncRNA per rilevare il rapporto tra lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. Il vantaggio di questo metodo è l'efficienza temporale, mentre lo svantaggio è che l'effettiva localizzazione dell'lncRNA non si riflette direttamente nella proporzione relativa di lncRNA nel citoplasma e nel nucleo. RNA FISH è in grado di rilevare la localizzazione di lncRNA nelle cellule attraverso la progettazione di sequenze a catena antisenso specifiche per lncRNA seguite da marcatura con coloranti fluorescenti10. I metodi RNA FISH sono stati migliorati con i progressi nelle tecniche di sonde e nei metodi di rilevamento, tra cui i set di sonde oligo multiplemarcati con fluorofori 11, le sonde LNA 12 e le sonde a DNA ramificato (bDNA)13. RNA FISH è in grado non solo di rilevare la localizzazione di lncRNA, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine utilizzando l'immunofluorescenza bicolore o multicolore14.
In questo lavoro, abbiamo incluso come esempio il dettagliato protocollo di rilevamento della localizzazione intracellulare del gene ospite 6 dell'RNA piccolo nucleolare dell'RNA lncRNA (SNHG6) in cellule di osteosarcoma (143B) mediante RNA FISH. SNHG6 è un lncRNA di 600-730 nucleotidi nella sua forma matura e identificata come un nuovo oncogene in diversi tumori umani, tra cui il cancro del colon-retto, il cancro gastrico, il carcinoma ovarico a cellule chiare, l'osteosarcoma e il carcinoma epatocellulare15,16,17,18. Gli studi hanno confermato il coinvolgimento di SNHG6 nei comportamenti biologici delle cellule tumorali, come la proliferazione, l'EMT e l'autofagia, e hanno mostrato la localizzazione citoplasmatica di SNHG6 dove può influenzare i geni bersaglio legando (spugnando) i miRNA15,16,17. Questo protocollo di rilevamento dettagliato della localizzazione intracellulare di SNHG6 da parte di RNA FISH è presentato di seguito.
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Protocol
Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli di tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. La Figura 1 mostra il protocollo generale per RNA FISH; La Tabella 1 contiene la composizione di tutte le soluzioni e la Tabella 2 contiene le sequenze di primer utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione della sonda
- Identificare e acquisire la sequenza FASTA di un lncRNA target di interesse, ad esempio, da GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguendo le indicazioni sul sito web, progettare le sonde ISH online19 e rivedere i suggerimenti dell'algoritmo di progettazione per elencare le sonde da ordinare con l'etichetta Cy3.
- Incubare il tampone di ibridazione a 37 °C per 2 ore di anticipo.
- Sciogliere 4 sonde di densità ottica (OD) in 160 μL di ddH2O trattato con dietilpirocarbonato (DEPC) alla concentrazione di 1 mg/mL al riparo dalla luce.
NOTA: La densità ottica (OD) rappresenta l'unità di misura del DNA e dell'RNA. Di solito, 1 unità OD = 33 μg/mL di DNA. - Preparare 200 μL della miscela di sonde per ciascun pozzetto (1,2 μL-10 μL di sonda, 70 μL di tampone di ibridazione, aumentare il volume con ddH2O trattato con DEPC fino a 200 μL) e impostare una serie di 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6 μg/mL.
NOTA: La concentrazione della sonda deve essere esplorata sperimentalmente in anticipo. Un'alta concentrazione della sonda porterà a un legame non specifico degli lncRNA, mentre una bassa concentrazione della sonda porterà a un rilevamento insensibile o fallito degli lncRNA. - Denaturare la miscela della sonda a 73 °C per 5 min.
NOTA: Se la sonda di DNA marcata con Cy3 è a doppio filamento, denaturare la sonda a DNA a singolo filamento a 95 °C per 5 minuti, quindi raffreddare rapidamente per 2 minuti su ghiaccio.
2. Preparazione delle cellule
- Seminare 50.000 cellule 143B per pozzetto su vetrini coprioggetti sterili in una piastra di coltura cellulare da 12 pozzetti e incubarle per 24 ore (37 °C, 5% CO2) in DMEM.
NOTA: Il numero specifico di cellule seminate qui varia con la dimensione della cella, che è appropriata per le cellule seminate per raggiungere una confluenza del 50% dopo essere state incubate per 24 ore. I vetrini coprioggetti sterili in vetro sono rotondi per essere adatti alla piastra a 12 pozzetti. - Rimuovere il terreno e lavare per 2 x 5 minuti con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Preparare 1x PBS con ddH2O. PBS senza trattamento DEPC non può essere utilizzato perché contiene RNasi. Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni di assenza di RNasi. - Rimuovere 1x PBS e aggiungere 200 μL di etanolo al 100% in ciascun pozzetto per fissare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'etanolo, aggiungere 200 μL di Triton X-100 allo 0,1% (in 1x PBS) in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Il tempo deve essere rigorosamente controllato con la permeabilizzazione Triton X-100 e non può essere troppo lungo. - Rimuovere lo 0,1% di Triton X-100 e lavare 2 x 5 min con 1x PBS.
NOTA: Se il protocollo deve essere sospeso qui, sostituire il PBS con etanolo al 70% (diluizione di etanolo al 100% con ddH2O privo di RNasi) e conservare il campione a 4 °C per un massimo di 3 mesi. - Rimuovere 1x PBS, aggiungere 200 μL di 2x tampone di citrato salino di sodio (SSC) (diluizione di 20x SSC con ddH2O privo di RNasi) in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Rimuovere 2 tamponi SSC, aggiungere 200 μL di etanolo al 70% in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare l'etanolo al 70%, aggiungere 200 μL di etanolo all'85% (diluizione di etanolo al 100% con ddH2O privo di RNasi) in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Scartare l'etanolo all'85%, aggiungere 200 μL di etanolo al 100% in ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Assorbire e scartare il 100% di etanolo; Lascia asciugare i pozzi.
3. Ibridazione fluorescente in situ (FISH)
- Aggiungere 200 μL di miscela di sonde (denaturata come al punto 1.5) in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per una notte (16-18 h).
NOTA: Esiste una forte correlazione positiva tra la temperatura di ibridazione e la concentrazione della sonda; Pertanto, per ottimizzare lo sfondo, sia la temperatura di ibridazione che la concentrazione della sonda devono essere ridotte. - Il giorno successivo, prelevare campioni a 37 °C ed eliminare la miscela della sonda. Aggiungere 200 μL di tampone 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a ciascun pozzetto (preriscaldato a 65 °C) e lavare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il tampone 0,4x SSC/0,3% Tween-20, aggiungere 200 μL di 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer a ciascun pozzetto e lavare per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere 2 tamponi SSC/0,1% Tween-20, aggiungere 200 μL di soluzione colorante 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1 μg/mL) e colorare per 20 minuti al riparo dalla luce.
- Scartare la soluzione colorante DAPI e lavare con 1x PBS per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 50 μL di terreno di montaggio contenente gomma sul vetrino e posizionare il vetrino coprioggetti sul vetrino da fissare.
NOTA: Assicurarsi di posizionare il vetrino coprioggetto sul vetrino con il lato della cella rivolto verso il basso. - Osservare al microscopio a fluorescenza.
NOTA: Utilizzare un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale laser; Quest'ultimo produce una maggiore sensibilità e chiarezza dell'immagine.
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Representative Results
Sono mostrate immagini rappresentative di SNHG6 FISH in cellule di osteosarcoma umano (Figura 2). Il controllo negativo viene trattato con la sonda Ctrl negativa; il controllo positivo viene trattato con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 e la sonda U6 sono etichettate con Cy3, che emette fluorescenza rossa. Il DAPI è un colorante che colora il DNA, che emette fluorescenza blu. Questo risultato mostra che SNHG6 è localizzato principalmente nel citoplasma e questa informazione può fornire un'importante direzione per ulteriori studi su SNHG6.
Se si utilizza una concentrazione molto elevata di sonda, è possibile vedere un colore di sfondo al microscopio a fluorescenza. La Figura 3 mostra le immagini rappresentative quando viene utilizzata un'alta concentrazione di sonda SNHG6 in RNA FISH. Le frecce bianche rappresentano una colorazione non specifica.
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo RNA FISH per lncRNA. Questo grafico mostra il protocollo chiave del processo sperimentale RNA FISH. Abbreviazioni: FISH = ibridazione fluorescente in situ ; lncRNA = RNA non codificante lungo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La localizzazione di LncRNA (SNHG6) in cellule di osteosarcoma umano (143B). Il controllo negativo viene trattato con una sonda di controllo negativo. Il controllo positivo viene trattato con una sonda U6 . Le sonde SNHG6 e U6 sono marcate con Cy3, che emette fluorescenza rossa. Il DAPI è un colorante che colora il DNA ed emette fluorescenza blu. Il rosso e il blu si fondono per creare il rosa. Le immagini sono scattate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Barra della scala = 10 μm. Abbreviazioni: LncRNA = RNA lungo non codificante; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le immagini rappresentative dell'alta concentrazione della sonda SNHG6 nell'RNA FISH.Le sonde SNHG6 sono marcate con Cy3, che emette fluorescenza rossa. Il DAPI è un colorante che colora il DNA ed emette fluorescenza blu. Il rosso e il blu si fondono per creare il rosa. Le immagini sono scattate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: La composizione delle soluzioni utilizzate nell'esperimento di ibridazione RNA FISH. Tutte le diluizioni devono essere effettuate con acqua sterile e priva di RNasi. Tutta l'acqua aggiunta è trattata con DEPC ddH2O. Abbreviazioni: FISH = ibridazione fluorescente in situ ; DEPC = dietilpirocarbonato. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Tutte le sequenze di sonde utilizzate in questo esperimento. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo protocollo RNA FISH non solo è in grado di rilevare la localizzazione degli lncRNA nelle cellule, ma anche di rilevare la colocalizzazione di altri RNA, DNA o proteine nelle cellule, che possono essere utilizzati anche per rilevare la posizione degli lncRNA nei tessuti inclusi in paraffina. Tuttavia, il protocollo specifico in questi casi è diverso perché i tessuti inclusi in paraffina devono essere decerati21. Questa procedura sperimentale può essere applicata in piastre da 48 o 96 pozzetti, ma le piastre da 384 pozzetti sono troppo piccole per essere utilizzate in questo caso.
È necessario notare diversi passaggi critici di questo metodo, tra cui l'ambiente privo di RNasi, la concentrazione della sonda, la temperatura di ibridazione e l'impostazione dei controlli negativi e positivi. In primo luogo, la condizione di assenza di RNasi è cruciale perché la RNasi rompe i legami tra i nucleotidi e porta alla degradazione degli lncRNA in generale. In secondo luogo, la concentrazione della sonda comunemente raccomandata varia da 5 a 50 μg/mL. Un'elevata concentrazione di sonda porterà a un legame non specifico degli lncRNA, mentre una bassa concentrazione di sonda porterà a un rilevamento insensibile o fallito degli lncRNA19. Se si utilizza una concentrazione molto elevata di sonda, al microscopio a fluorescenza è possibile vedere un colore di fondo anche in presenza di una sonda criptata (un controllo negativo); Pertanto, le stesse concentrazioni dei controlli negativi vengono solitamente utilizzate per impostare la linea di base (la stessa del controllo interno) durante gli esperimenti preliminari che esplorano la concentrazione della sonda appropriata per evitare qualsiasi legame non specifico. La più alta concentrazione di sonda senza colore di fondo nel gruppo di controllo negativo, che presentava la segnalazione più forte senza legame non specifico, è stata utilizzata nei seguenti esperimenti. In terzo luogo, si consiglia di progettare almeno due o tre sonde per l'ottimizzazione con un lncRNA specifico. Allo stesso tempo, due o più sonde possono anche essere miscelate per migliorare la sensibilità di rilevamento degli lncRNA target. In quarto luogo, la normale temperatura di ibridazione della sonda lncRNA è di 37 °C. Durante il processo di ibridazione, la temperatura di ibridazione deve essere mantenuta costante e uniforme. L'intervallo di temperatura di ibridazione tra le diverse sonde è compreso tra 34 e 38 °C. La temperatura di ibridazione è fortemente correlata positivamente con la concentrazione della sonda; Pertanto, per ottimizzare lo sfondo, la concentrazione della sonda dovrebbe essere ridotta. Infine, è anche fondamentale impostare controlli negativi e positivi. Il gruppo senza sonda viene utilizzato come controllo negativo per ottenere segnali di fondo. Una sonda U6 o una sonda a RNA ribosomiale viene utilizzata come controllo positivo per escludere la possibilità di risultati falsi positivi.
Questo approccio presenta diversi vantaggi. Il colore di fluorescenza delle sonde lncRNA può essere modificato. La fluorescenza verde è emessa dall'isotiocianato di fluoresceina (FITC), dalla fluoresceina (FAM) e da Alexa Fluor 488, mentre la fluorescenza rossa è emessa da Cy3 e Alexa Fluor 555. FITC è usato per il verde tipico e Cy3 per il rosso tipico. Inoltre, le immagini possono essere ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale laser. Le immagini di quest'ultimo sono più sensibili e chiare rispetto a quelle acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Il limite del metodo RNA FISH è che si tratta di un metodo qualitativo; pertanto, i risultati non sono quantificabili. A causa del cambiamento nel tempo di ibridazione e dell'influenza di fattori soggettivi durante l'osservazione al microscopio a fluorescenza, l'espressione di lncRNA non può essere quantificata con precisione nelle cellule. I livelli di espressione degli lncRNA in diverse frazioni cellulari possono essere valutati solo qualitativamente. Tuttavia, con il miglioramento della tecnica, è stato sviluppato un metodo di ibridazione in situ fluorescente a singola molecola (smFISH)22 per quantificare il livello di espressione dell'RNA; in futuro potrebbero essere segnalati ulteriori rilevamenti di smFISH.
La tecnica RNA FISH ha una vasta gamma di applicazioni. La rilevazione della localizzazione intracellulare degli lncRNA sarà utile per lo studio dei meccanismi biologici degli lncRNA. Allo stesso tempo, questa tecnica può essere utilizzata anche per rilevare la localizzazione di altri RNA non codificanti nelle cellule, inclusi circRNA, miRNA e tRNA.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni provenienti da (1) il National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) la National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Centro di innovazione collaborativa di Shanghai per la trasformazione industriale della preparazione alla MTC ospedaliera; (4) Progetti di ricerca nell'ambito del budget dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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