Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

RNA-fluorescens in situ-hybridisering för lång icke-kodande RNA-lokalisering i humana osteosarkomceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

Det aktuella protokollet beskriver en metod för RNA-fluorescens in situ-hybridisering för att lokalisera lncRNA i humana osteosarkomceller.

Abstract

De viktiga rollerna för långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer har studerats, såsom reglering av proliferation, epitelial-mesenkymal övergång (EMT), migration, infiltration och autofagi av cancerceller. Lokaliseringsdetektion av lncRNA i celler kan ge insikt i deras funktioner. Genom att designa den lncRNA-specifika antisenskedjesekvensen följt av märkning med fluorescerande färgämnen kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) tillämpas för att detektera den cellulära lokaliseringen av lncRNA. Tillsammans med utvecklingen av mikroskopi möjliggör RNA FISH-teknikerna nu även visualisering av de dåligt uttryckta lncRNA:erna. Denna metod kan inte bara detektera lokaliseringen av enbart lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens. Här har vi inkluderat den detaljerade experimentella operationsproceduren och försiktighetsåtgärderna för RNA FISH genom att använda lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i humana osteosarkomceller (143B) som ett exempel, för att ge en referens för forskare som vill utföra RNA FISH-experiment, särskilt lncRNA FISH.

Introduction

Vår förståelse av det mänskliga genomet har utökats kraftigt av de senaste framstegen inom helgenomteknik. Cirka 93 % av det mänskliga genomet kan transkriberas till RNA, men endast 2 % av RNA kan översättas till proteiner; de återstående 98 % av RNA som inte har någon proteintranslationsfunktion kallas icke-kodande RNA (ncRNA)1. Som en klass av icke-kodande RNA (ncRNA) har långa ncRNA (lncRNA), som innehåller över 200 nukleotider2, väckt ökad uppmärksamhet på grund av deras inblandning i många fysiologiska och patologiska processer i cellerna, såsom differentiering, cykelkontroll, apoptos, migration och invasion 3,4,5. LncRNA spelar sina roller genom olika mekanismer, såsom reglering av kromatinstruktur och nukleärt genuttryck, kontroll av mRNA-splitsningsprocessen och posttranskriptionell modifiering6. LncRNA reglerar förekomst, utveckling och metastasering av maligniteter på både transkriptions- och posttranskriptionsnivå. Transkriptionell reglering realiseras i kärnan genom att påverka RNA-transkription via bindning till kromosomstrukturerna, medan posttranskriptionell reglering realiseras i cytoplasman genom att kontrollera målgenerna via en endogen kompetitiv RNA (ceRNA) mekanism 5,7,8. CeRNA har avslöjat en ny mekanism för RNA-interaktion, nämligen att lncRNA kan fungera som en svamp för att adsorbera miRNA och hämma den miRNA-medierade nedbrytningen av relaterade målgener9. Därför är informationen om den subcellulära lokaliseringen av lncRNA, oavsett om ett specifikt lncRNA finns i cytoplasman eller kärnan, viktigt för att hjälpa till att identifiera deras biologiska funktioner.

För närvarande detekteras lncRNA-lokalisering huvudsakligen med två metoder, den ena är genom cellkärna/cytoplasmafraktionsisoleringsanalys, och den andra är med RNA-fisk. I den förstnämnda extraheras RNA i cytoplasman respektive kärnfraktionerna, och sedan utförs PCR-amplifiering med specifika lncRNA-primrar för att detektera förhållandet mellan lncRNA i cytoplasman och kärnan. Fördelen med denna metod är tidseffektiviteten, medan nackdelen är att den faktiska lncRNA-lokaliseringen inte direkt återspeglas av den relativa andelen lncRNA i cytoplasman och kärnan. RNA FISH kan detektera lncRNA-lokalisering i celler genom design av lncRNA-specifika antisenskedjesekvenser följt av märkning med fluorescerande färgämnen10. RNA FISH-metoderna har förbättrats med framsteg inom sondteknik och detektionsmetoder, inklusive fluoroformärkta multipla oligosonduppsättningar11, LNA-sonder12 och grenade DNA-sonder (bDNA)13. RNA FISH kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner genom att använda dubbel- eller flerfärgad immunofluorescens14.

I detta arbete har vi inkluderat det detaljerade intracellulära lokaliseringsdetektionsprotokollet för lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) med RNA FISH som ett exempel. SNHG6 är ett 600-730 nukleotid-lncRNA i sin mogna splitsade form och identifierad som en ny onkogen i olika mänskliga cancerformer, inklusive kolorektal cancer, magcancer, ovariellt klarcellscancer, osteosarkom och hepatocellulärt karcinom15,16,17,18. Studier har bekräftat att SNHG6 är involverat i cancercellers biologiska beteenden, såsom proliferation, EMT och autofagi, och visat den cytoplasmatiska lokaliseringen av SNHG6 där den kan påverka målgenerna genom att binda (svampa) miRNA15,16,17. Detta detaljerade detektionsprotokoll för SNHG6 intracellulär lokalisering med RNA FISH presenteras här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se materialtabellen för detaljer om alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll. Figur 1 visar det övergripande protokollet för RNA-fisk. Tabell 1 innehåller sammansättningen av alla lösningar och tabell 2 innehåller de primersekvenser som används i detta protokoll.

1. Förberedelse av sond

  1. Identifiera och förvärva FASTA-sekvensen av ett mål-lncRNA av intresse, till exempel från GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Följ anvisningarna på webplats, designa ISH-sonderna online19 och granska designalgoritmens förslag för att lista de sonder som ska beställas med Cy3-etikett.
  2. Inkubera hybridiseringsbufferten vid 37 °C i 2 timmar i förväg.
  3. Lös upp 4 sond med optisk densitet (OD) i 160 μL dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlad ddH2O i en koncentration av 1 mg/ml bort från ljus.
    OBS: Optisk densitet (OD) representerar måttenheten för DNA och RNA. Vanligtvis är 1 OD-enhet = 33 μg/ml DNA.
  4. Bered 200 μl av sondblandningen för varje brunn (1,2 μL-10 μL sond, 70 μL hybridiseringsbuffert, fyll på volymen med DEPC-behandlad ddH2O till 200 μL) och ställ in en serie på 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml och 6 μg/ml.
    OBS: Sondkoncentrationen måste undersökas experimentellt i förväg. En hög sondkoncentration kommer att leda till ospecifik bindning av lncRNA, medan en låg sondkoncentration kommer att leda till okänslig eller misslyckad detektion av lncRNA.
  5. Denaturera sondblandningen vid 73 °C i 5 min.
    OBS: Om den Cy3-märkta DNA-sonden är dubbelsträngad, denaturera sonden till enkelsträngat DNA vid 95 °C i 5 minuter och svalna sedan snabbt i 2 minuter på is.

2. Förberedelse av celler

  1. Frö 50 000 143B-celler per brunn på sterila glastäcken i en 12-håls cellodlingsplatta och inkubera dem i 24 timmar (37 °C, 5 % CO2) i DMEM.
    OBS: Det specifika cellantalet som sås här varierar med cellstorleken, vilket är lämpligt för att de sådda cellerna ska nå ett sammanflöde på 50 % efter att ha inkuberats i 24 timmar. De sterila glastäckena är runda för att passa 12-hålsplattan.
  2. Ta bort mediet och tvätta i 2 x 5 minuter med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
    OBS: Förbered 1x PBS med DEPC-behandlad ddH2O. PBS utan DEPC-behandling kan inte användas eftersom den innehåller RNas. Utför alla följande steg under RNase-fria förhållanden.
  3. Ta bort 1x PBS och tillsätt 200 μL 100 % etanol i varje brunn för att fixera i 15 minuter vid rumstemperatur.
  4. Ta bort etanolen, tillsätt 200 μL 0,1 % Triton X-100 (i 1x PBS) i varje brunn och inkubera i 15 minuter i rumstemperatur.
    OBS: Tiden måste kontrolleras strikt med Triton X-100 permeabilisering och får inte vara för lång.
  5. Ta bort 0,1 % Triton X-100 och tvätta 2 x 5 min med 1x PBS.
    OBS: Om protokollet måste pausas här, byt ut PBS mot 70 % etanol (utspädning av 100 % etanol med RNasfri ddH2O) och förvara sample vid 4 °C i upp till 3 månader.
  6. Ta bort 1x PBS, tillsätt 200 μl 2x buffert av natriumkoksaltcitrat (SSC) (spädning 20x SSC med RNasfri ddH2O) i varje brunn och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
  7. Ta bort 2x SSC-bufferten, tillsätt 200 μL 70 % etanol i varje brunn och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
  8. Kassera 70 % etanol, tillsätt 200 μl 85 % etanol (spädning av 100 % etanol med RNasfri ddH2O) i varje brunn och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
  9. Kassera 85 % etanol, tillsätt 200 μL 100 % etanol i varje brunn och inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
  10. Absorbera och kassera 100 % etanol; Låt brunnarna torka.

3. Fluorescens in situ-hybridisering (FISH)

  1. Tillsätt 200 μl sondblandning (denaturerad enligt steg 1.5) till varje brunn och inkubera vid 37 °C över natten (16-18 timmar).
    OBS: Det finns en stark positiv korrelation mellan hybridiseringstemperatur och sondkoncentration; Därför, för att optimera bakgrunden, bör både hybridiseringstemperaturen och sondkoncentrationen minskas.
  2. Nästa dag tar du prover från 37 °C och kasserar sondblandningen. Tillsätt 200 μl 0,4 x SSC/0,3 % Tween-20-buffert i varje brunn (förvärmd till 65 °C) och tvätta i 2 minuter i rumstemperatur.
  3. Ta bort bufferten 0,4 x SSC/0,3 % interpolering-20, tillsätt 200 μl 2x SSC/0,1 % Tween-20-buffert i varje brunn och tvätta i 2 minuter i rumstemperatur.
  4. Ta bort 2x SSC/0,1 % Tween-20-buffert, tillsätt 200 μl 4',6-diamidino-2-fenylindolfärgningslösning (DAPI) (1 μg/ml) och fläcka i 20 minuter från ljus.
  5. Kassera DAPI-färglösningen och tvätta med 1x PBS i 2 minuter i rumstemperatur.
  6. Tillsätt 50 μL monteringsmedium som innehåller tuggummi på objektglaset och placera glastäcket på objektglaset för att fixera.
    OBS: Var noga med att placera täckglaset på objektglaset med cellsidan nedåt.
  7. Observera under ett fluorescensmikroskop.
    OBS: Använd ett fluorescensmikroskop eller ett laserkonfokalmikroskop; Den senare ger en högre känslighet och klarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa bilder av SNHG6 FISH i humana osteosarkomceller visas (figur 2). Den negativa kontrollen behandlas med den negativa Ctrl-avsökningen. positiv kontroll behandlas med U6 sond 20. SNHG6-sonden och U6-sonden är märkta med Cy3, som avger röd fluorescens. DAPI är ett färgämne som färgar DNA:t, vilket avger blå fluorescens. Detta resultat visar att SNHG6 huvudsakligen är lokaliserat i cytoplasman, och denna information kan ge en viktig riktning för vidare studier av SNHG6.

Om en mycket hög koncentration av sond används kan en bakgrundsfärg ses under fluorescensmikroskopet. Figur 3 visar representativa bilder när en hög koncentration av SNHG6-sond används i RNA-fisk. De vita pilarna representerar ospecifik färgning.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema över RNA FISH-protokollet för lncRNA. Det här diagrammet visar nyckelprotokollet för RNA FISH-experimentprocessen. Förkortningar: FISH = fluorescens in situ-hybridisering ; lncRNA = långt icke-kodande RNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Lokalisering av LncRNA (SNHG6) i humana osteosarkomceller (143B). Negativ kontroll behandlas med en negativ kontrollsond. Positiv kontroll behandlas med en U6-sond . SNHG6 - och U6-sonderna är märkta med Cy3, som avger röd fluorescens. DAPI är ett färgämne som färgar DNA och avger blå fluorescens. Rött och blått smälter samman till rosa. Bilderna är tagna med fluorescensmikroskop. Skalstapel = 10 μm. Förkortningar: LncRNA = långt icke-kodande RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av hög koncentration av SNHG6-sond i RNA-fisk. SNHG6-sonder är märkta med Cy3, som avger röd fluorescens. DAPI är ett färgämne som färgar DNA och avger blå fluorescens. Rött och blått smälter samman till rosa. Bilderna är tagna med fluorescensmikroskop. Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Sammansättningen av de lösningar som används i RNA FISH-hybridiseringsexperimentet. Alla spädningar ska göras med sterilt, RNasfritt vatten. Allt tillsatt vatten är DEPC-behandlat ddH2O. Förkortningar: FISH = fluorescens in situ-hybridisering ; DEPC = dietylpyrokarbonat. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Alla sondsekvenser som används i detta experiment. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta RNA FISH-protokoll kan inte bara detektera lokaliseringen av lncRNA i celler, utan också detektera samlokaliseringen av andra RNA, DNA eller proteiner i celler, som också kan användas för att detektera placeringen av lncRNA i paraffininbäddade vävnader. Det specifika protokollet i sådana fall är dock annorlunda eftersom de paraffininbäddade vävnaderna måste avvaxas21. Denna experimentella procedur kan tillämpas på plattor med 48 eller 96 brunnar, men plattor med 384 brunnar är för små för att användas här.

Flera kritiska steg i denna metod måste noteras, inklusive den RNasfria miljön, sondkoncentrationen, hybridiseringstemperaturen och inställningen av negativa och positiva kontroller. För det första är det RNasfria tillståndet avgörande eftersom RNas bryter ner bindningarna mellan nukleotider och leder till nedbrytning av lncRNA i allmänhet. För det andra varierar den allmänt rekommenderade sondkoncentrationen från 5 till 50 μg/ml. En hög sondkoncentration kommer att leda till ospecifik bindning av lncRNA, medan en låg sondkoncentration kommer att leda till okänslig eller misslyckad detektion av lncRNA19. Om en mycket hög koncentration av sond används kan en bakgrundsfärg ses under fluorescensmikroskopet även i närvaro av en förvrängd sond (en negativ kontroll); Därför används vanligtvis samma koncentrationer av negativa kontroller för att ställa in baslinjen (samma som den interna kontrollen) under de preliminära experimenten där man undersöker lämplig sondkoncentration för att undvika icke-specifik bindning. Den högsta sondkoncentrationen utan bakgrundsfärg i den negativa kontrollgruppen, som uppvisade den starkaste signaleringen utan icke-specifik bindning, användes i följande experiment. För det tredje rekommenderas det att designa minst två eller tre sonder för optimering med ett specifikt lncRNA. Samtidigt kan två eller flera prober också blandas för att förbättra detektionskänsligheten hos mål-lncRNA. För det fjärde är den normala hybridiseringstemperaturen för lncRNA-sonden 37 °C. Under hybridiseringsprocessen bör hybridiseringstemperaturen hållas konstant och enhetlig. Hybridiseringstemperaturen mellan olika sonder är 34 till 38 °C. Hybridiseringstemperaturen är starkt positivt korrelerad med sondkoncentrationen; Därför, för att optimera bakgrunden, bör sondkoncentrationen minskas. Slutligen är det också viktigt att fastställa negativa och positiva kontroller. Gruppen utan sond används som en negativ kontroll för att få bakgrundssignaler. En U6-sond eller en ribosomal RNA-sond används som en positiv kontroll för att utesluta möjligheten till falskt positiva resultat.

Den här metoden har flera fördelar. Fluorescensfärgen på lncRNA-sonder kan ändras. Grön fluorescens avges av fluoresceinisotiocyanat (FITC), fluorescein (FAM) och Alexa Fluor 488, medan röd fluorescens avges av Cy3 och Alexa Fluor 555. FITC används för typiskt grönt och Cy3 för typiskt rött. Dessutom kan bilderna erhållas med hjälp av antingen ett fluorescensmikroskop eller ett laserkonfokalmikroskop. Den senares bilder är känsligare och tydligare än de som tas med hjälp av ett fluorescensmikroskop.

Begränsningen med RNA FISH-metoden är att detta är en kvalitativ metod; Resultaten är därför inte kvantifierbara. På grund av förändringen i hybridiseringstiden och påverkan av subjektiva faktorer under fluorescensmikroskopobservation kan lncRNA-uttrycket inte kvantifieras exakt i celler. Uttrycksnivåerna av lncRNA i olika cellulära fraktioner kan endast utvärderas kvalitativt. Men med förbättring av tekniken har en metod för fluorescerande in situ-hybridisering (smFISH) med en enda molekyl utvecklatsför att kvantifiera RNA-uttrycksnivån; fler smFISH-detektioner kan komma att rapporteras i framtiden.

RNA FISH-tekniken har ett brett användningsområde. Den intracellulära lokaliseringsdetektionen av lncRNA kommer att gynna studiet av de biologiska mekanismerna för lncRNA. Samtidigt kan denna teknik också användas för att detektera lokaliseringen av andra icke-kodande RNA i celler, inklusive circRNA, miRNA och tRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från (1) Kinas nationella nyckelprogram för forskning och utveckling (2020YFE0201600); 2) National Nature Science Foundation (81973877 och 82174408). (3) Shanghai Collaborative Innovation Center för industriell omvandling av sjukhus-TCM-förberedelser; (4) Forskningsprojekt inom budget för Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).

Tags

RNA-fluorescens In situ-hybridisering långa icke-kodande RNA cancer proliferation epitel-mesenkymal övergång migration infiltration autofagi cellulär lokalisering fluorescerande färgämnen RNA FISH-tekniker mikroskopi dåligt uttryckta LncRNA samlokalisering dubbelfärgad immunofluorescens flerfärgad immunofluorescens experimentell operationsprocedur försiktighetsåtgärder
RNA-fluorescens <em>in situ-hybridisering</em> för lång icke-kodande RNA-lokalisering i humana osteosarkomceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou,… More

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter