Summary
本プロトコルは、ヒト骨肉腫細胞のlncRNAを局在化させるRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーションの方法を記述する。
Abstract
がん細胞の増殖、上皮間葉転換(EMT)、遊走、浸潤、オートファジーの調節など、がんにおける長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の重要な役割が研究されています。細胞内のlncRNAの局在検出は、その機能に関する洞察を提供することができます。lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、その後に蛍光色素で標識することにより、RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)を適用してlncRNAの細胞局在を検出することができます。顕微鏡法の開発とともに、RNA FISH技術により、発現不良のlncRNAの可視化も可能になりました。この方法では、lncRNAの局在を単独で検出できるだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます。ここでは、ヒト骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA小核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)を例に、RNA FISH実験、特にlncRNA FISH実験を行いたい研究者の参考となるように、RNA FISHの詳細な実験操作手順と注意点を記載した。
Introduction
ヒトゲノムの理解は、近年の全ゲノム技術の進歩によって大きく拡大しています。ヒトゲノムの約93%はRNAに転写できますが、タンパク質に翻訳できるRNAはわずか2%です。タンパク質翻訳機能を持たないRNAの残りの98%は、ノンコーディングRNA(ncRNA)1と呼ばれます。200以上のヌクレオチド2を含む長鎖ncRNA(lncRNA)は、分化、周期制御、アポトーシス、遊走、浸潤など、細胞の多くの生理学的・病理学的プロセスに関与していることから、ノンコーディングRNA(ncRNA)のクラスとしてますます注目を集めています3,4,5。.LncRNAは、クロマチン構造や核内遺伝子発現の調節、mRNAスプライシングプロセスの制御、転写後修飾など、さまざまなメカニズムを通じてその役割を果たしています6。LncRNAは、転写レベルと転写後レベルの両方で悪性腫瘍の発生、発生、および転移を調節します。核内では染色体構造への結合を介してRNAの転写に作用することで転写制御が実現され、細胞質内では内因性競合RNA(ceRNA)機構を介して標的遺伝子を制御することで転写後制御が実現される5,7,8。CeRNAは、lncRNAがスポンジとしてmiRNAを吸着し、miRNAを介した関連標的遺伝子の分解を阻害するという、RNA相互作用の新しいメカニズムを明らかにしました9。したがって、lncRNAの細胞内局在に関する情報は、特定のlncRNAが細胞質または核に存在するかどうか、それらの生物学的機能を特定するために重要です。
現在、lncRNAの局在は、主に核/細胞質分離アッセイとRNA FISHの2つの方法で検出されています。前者では、細胞質画分と核分画のRNAをそれぞれ抽出し、特定のlncRNAプライマーでPCR増幅を行い、細胞質と核のlncRNAの比率を検出します。この方法の利点は時間効率ですが、欠点は、実際のlncRNAの局在が細胞質と核内のlncRNAの相対的な割合によって直接反映されないことです。RNA FISHは、lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、それに続く蛍光色素で標識することにより、細胞内のlncRNA局在を検出することができます10。RNA FISH法は、蛍光色素標識マルチオリゴプローブセット11、LNAプローブ12、分岐DNA(bDNA)プローブ13など、プローブ技術および検出法の進歩により改良されてきました。RNA FISHは、lncRNAの局在を検出するだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます14。
本研究では、骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA低核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)の詳細な細胞内局在検出プロトコルをRNA FISHに例に含めた。SNHG6は、成熟したスプライシング型の600〜730ヌクレオチドlncRNAであり、結腸直腸癌、胃癌、卵巣明細胞癌、骨肉腫、肝細胞癌など、さまざまなヒト癌における新規癌遺伝子として同定されています15,16,17,18。研究により、SNHG6が増殖、EMT、オートファジーなどのがん細胞の生物学的挙動に関与していることが確認されており、SNHG6の細胞質局在が示されており、miRNAに結合(スポンジ化)することで標的遺伝子に影響を与える可能性があります15,16,17。RNA FISHによるSNHG6細胞内局在のこの詳細な検出プロトコルを本明細書に提示する。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。 図1 は、RNA FISHの全体的なプロトコルを示しています。表 1 にはすべての溶液の組成が含まれ、 表2 にはこのプロトコルで使用されるプライマー配列が含まれています。
1. プローブの準備
- 例えば、GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)から、目的の標的lncRNAのFASTA配列を同定し、取得する。ウェブサイトの指示に従って、ISHプローブをオンラインで設計し19、設計アルゴリズムの提案を確認して、Cy3ラベルで注文するプローブをリストします。
- ハイブリダイゼーションバッファーを事前に37°Cで2時間インキュベートします。
- 4光学密度(OD)プローブを160 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理ddH2Oに、光から1 mg/mLの濃度で溶解します。
注:光学濃度(OD)は、DNAおよびRNAの測定単位を表します。通常、1 OD 単位 = 33 μg/mL の DNA。 - 各ウェルについて200μLのプローブ混合物(1.2μL〜10μLのプローブ、70μLのハイブリダイゼーションバッファー、DEPC処理ddH2O〜200μLで容量を構成します)を調製し、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、および6μg/mLのシリーズをセットアップします。
注:プローブの濃度は、事前に実験的に調査する必要があります。プローブ濃度が高いとlncRNAが非特異的に結合し、プローブ濃度が低いとlncRNAの感度が低下したり、検出に失敗したりします。 - プローブミックスを73°Cで5分間変性させます。
注:Cy3標識DNAプローブが二本鎖の場合は、プローブを95°Cで5分間一本鎖DNAに変性させた後、氷上で2分間急速に冷却します。
2. 細胞調製
- 12ウェル細胞培養プレート内の滅菌ガラスカバーガラス上にウェルあたり50,000個の143B細胞を播種し、DMEM中で24時間(37°C、5%CO2)インキュベートします。
注:ここで播種する特定の細胞数は細胞サイズによって異なり、播種した細胞が24時間インキュベートした後に50%の合流に達するのに適しています。滅菌ガラスカバーガラスは丸型で、12ウェルプレートに適しています。 - 培地を取り出し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2 x 5分間洗浄します。
注:DEPC処理されたddH2OのPBSを1x 調製します。以下のすべての手順を RNase フリーの条件で実行します。 - 1x PBSを除去し、各ウェルに200 μLの100%エタノールを加えて、室温で15分間固定します。
- エタノールを除去し、各ウェルに 200 μL の 0.1% Triton X-100(1x PBS 中)を加え、室温で 15 分間インキュベートします。
注:時間はTriton X-100透過処理で厳密に制御する必要があり、長すぎることはできません。 - 0.1% Triton X-100を除去し、1x PBSで5分×2回洗浄します。
注:ここでプロトコルを一時停止する必要がある場合は、PBS を 70% エタノール(100% エタノールを RNase フリー ddH2O で希釈)に交換し、サンプルを 4 °C で最大 3 か月間保存します。 - 1x PBSを除去し、2x生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)バッファー200 μL(RNaseフリーddH2Oで20x SSCを希釈)を各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
- 2x SSCバッファーを除去し、各ウェルに200 μLの70%エタノールを加え、室温で3分間インキュベートします。
- 70%エタノールを廃棄し、200μLの85%エタノール(100%エタノールをRNaseフリーddH2Oで希釈)を各ウェルに加え、室温で3分間インキュベートします。
- 85%エタノールを廃棄し、各ウェルに100%エタノール200μLを加え、室温で3分間インキュベートします。
- 100%エタノールを吸収して廃棄します。井戸を乾かします。
3. 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)
- 200μLのプローブ混合物(ステップ1.5と同様に変性)を各ウェルに加え、37°Cで一晩(16〜18時間)インキュベートします。
注:ハイブリダイゼーション温度とプローブ濃度の間には強い正の相関関係があります。したがって、バックグラウンドを最適化するには、ハイブリダイゼーション温度とプローブ濃度の両方を下げる必要があります。 - 翌日、37°Cからサンプルを取り出し、プローブ混合物を廃棄します。200 μL の 0.4x SSC/0.3% Tween-20 バッファーを各ウェル(65 °C に予熱)に加え、室温で 2 分間洗浄します。
- 0.4x SSC/0.3% Tween-20 バッファーを除去し、2x SSC/0.1% Tween-20 バッファー 200 μL を各ウェルに加え、室温で 2 分間洗浄します。
- 2x SSC/0.1% Tween-20バッファーを除去し、200 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色溶液(1 μg/mL)を加え、光を避けて20分間染色します。
- DAPI色素溶液を廃棄し、1x PBSで室温で2分間洗浄します。
- ガムを含む封入剤50 μLをスライドに加え、ガラスカバーガラスをスライドの上に置いて固定します。
注意: カバーガラスは、必ずセル側を下にしてスライドに置いてください。 - 蛍光顕微鏡で観察します。
注意: 蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡を使用してください。後者は、より高い感度と明瞭なイメージングを生成します。
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Representative Results
ヒト骨肉腫細胞におけるSNHG6 FISHの代表的な画像を示します(図2)。ネガティブコントロールは、ネガティブCtrlプローブで処理されます。ポジティブコントロールはU6プローブ 20で処理する。SNHG6プローブとU6プローブは、赤色蛍光を発するCy3で標識されています。DAPIは、青色蛍光を発するDNAを染色する染料です。この結果は、SNHG6が主に細胞質に局在していることを示しており、この情報はSNHG6のさらなる研究のための重要な方向性を提供する可能性があります。
非常に高い濃度のプローブを使用すると、蛍光顕微鏡で背景色を見ることができます。 図3 は、RNA FISHに高濃度のSNHG6プローブを使用した場合の代表的な画像です。白い矢印は非特異的染色を表します。
図1:lncRNAのRNA FISHプロトコルのフローチャート。 このチャートは、RNA FISH実験プロセスの主要なプロトコルを示しています。略語:FISH = fluorescence in situ ハイブリダイゼーション;lncRNA = 長鎖ノンコーディング RNA。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ヒト骨肉腫細胞(143B)におけるLncRNA(SNHG6)の局在。 ネガティブコントロールは、ネガティブコントロールプローブで処理されます。ポジティブコントロールは U6 プローブで処理されます。 SNHG6 および U6 プローブは、赤色蛍光を発するCy3で標識されています。DAPIは、DNAを染色し、青色の蛍光を発する色素です。赤と青が合わさってピンクになります。画像は蛍光顕微鏡で撮影したものです。スケールバー = 10 μm。 略語: LncRNA = 長鎖ノンコーディングRNA;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:RNA FISH中の高濃度SNHG6プローブの代表画像。 SNHG6 プローブは、赤色蛍光を発するCy3で標識されています。DAPIは、DNAを染色し、青色の蛍光を発する色素です。赤と青が合わさってピンクになります。画像は蛍光顕微鏡で撮影したものです。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:RNA FISHハイブリダイゼーション実験で使用した溶液の組成。 すべての希釈は、RNaseを含まない滅菌水で行う必要があります。添加されたすべての水はDEPC処理されたddH2Oです。 略語:FISH =蛍光 in situ ハイブリダイゼーション;DEPC = ジエチルピロカーボネート。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:この実験で使用したすべてのプローブ配列。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このRNA FISHプロトコルは、セル内のlncRNAの局在を検出するだけでなく、他のRNA、DNA、または細胞内のタンパク質の共局在を検出することもでき、パラフィン包埋組織におけるlncRNAの位置を検出するために使用できます。しかし、そのような場合の特定のプロトコルは、パラフィン包埋組織を脱ワックスする必要があるため、異なる21。この実験手順は、48ウェルまたは96ウェルプレートに適用できますが、384ウェルプレートは小さすぎてここでは使用できません。
この分析法のいくつかの重要なステップには、RNaseフリー環境、プローブ濃度、ハイブリダイゼーション温度、ネガティブコントロールとポジティブコントロールの設定などが含まれます。まず、RNaseはヌクレオチド間の結合を破壊し、一般的にlncRNAの分解につながるため、RNaseフリーの状態は非常に重要です。第二に、一般的に推奨されるプローブ濃度は5〜50μg/mLの範囲です。プローブ濃度が高いとlncRNAが非特異的に結合し、プローブ濃度が低いとlncRNAの感度が低下したり、検出に失敗したりします19。非常に高い濃度のプローブを使用すると、スクランブルプローブ(ネガティブコントロール)のみの存在下でも、蛍光顕微鏡で背景色が見られます。したがって、通常、非特異的結合を回避するための適切なプローブ濃度を調査する予備実験中に、ベースライン(内部コントロールと同じ)を設定するために、同じ濃度のネガティブコントロールが使用されます。ネガティブコントロール群において、背景色のないプローブ濃度が最も高いもの、非特異的結合を伴わない最も強いシグナル伝達を示すものを、以下の実験で用いた。第三に、特定のlncRNAで最適化するために、少なくとも2つまたは3つのプローブを設計することをお勧めします。同時に、2つ以上のプローブを混合して、標的lncRNAの検出感度を向上させることもできます。第四に、lncRNAプローブの通常のハイブリダイゼーション温度は37°Cである。 ハイブリダイゼーションプロセス中、ハイブリダイゼーション温度は一定かつ均一に保たれるべきである。異なるプローブ間のハイブリダイゼーション温度の範囲は、34〜38°Cである。 ハイブリダイゼーション温度は、プローブ濃度と強く正の相関があります。したがって、バックグラウンドを最適化するには、プローブ濃度を下げる必要があります。最後に、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを設定することも重要です。プローブなしのグループは、バックグラウンド信号を取得するためのネガティブコントロールとして使用されます。 U6 プローブまたはリボソームRNAプローブは、偽陽性の結果の可能性を排除するための陽性対照として使用されます。
このアプローチにはいくつかの利点があります。lncRNAプローブの蛍光色を変えることができます。緑色蛍光はフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレセイン(FAM)、Alexa Fluor 488から発光し、赤色蛍光はCy3およびAlexa Fluor 555から発光します。FITCは典型的な緑に使用され、Cy3は典型的な赤に使用されます。また、蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡のいずれかを使用して画像を得ることができます。後者の画像は、蛍光顕微鏡を使用して取得された画像よりも感度が高く、鮮明です。
RNA FISH法の制限は、これが定性的な方法であることです。したがって、結果は定量化できません。ハイブリダイゼーション時間の変化や蛍光顕微鏡観察時の主観的要因の影響により、細胞内でのlncRNA発現を正確に定量することができません。異なる細胞分画におけるlncRNAの発現レベルは、定性的にしか評価できません。しかしながら、技術の改良により、RNA発現レベルを定量化するために、単一分子蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(smFISH)法22 が開発された。今後、さらに多くのsmFISH検出が報告される可能性があります。
RNA FISH技術には幅広い用途があります。lncRNAの細胞内局在検出は、lncRNAの生物学的メカニズムの研究に役立ちます。同時に、この手法は、circRNA、miRNA、tRNAなど、細胞内の他のノンコーディングRNAの局在を検出するためにも使用できます。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、(1)中国国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600)からの助成金によって支援されています。(2)国立自然科学財団(81973877および82174408)。(3)病院TCM準備の産業変革の上海共同イノベーションセンター。(4)上海中医薬大学予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
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