Summary
Mevcut protokol, insan osteosarkom hücrelerinde lncRNA'ları lokalize etmek için bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini açıklamaktadır.
Abstract
Kanser hücrelerinin proliferasyonunu, epitelyal-mezenkimal geçişini (EMT), göçünü, infiltrasyonunu ve otofajisini düzenlemek gibi uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'lar) kanserdeki önemli rolleri incelenmiştir. Hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyon tespiti, işlevleri hakkında fikir verebilir. lncRNA'ya özgü antisens zincir dizisini tasarlayarak ve ardından floresan boyalarla etiketleyerek, lncRNA'ların hücresel lokalizasyonunu tespit etmek için RNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) uygulanabilir. Mikroskopinin geliştirilmesiyle birlikte, RNA FISH teknikleri artık zayıf ifade edilen lncRNA'ların görselleştirilmesine bile izin veriyor. Bu yöntem sadece tek başına lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir. Burada, insan osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) kullanılarak, RNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara, özellikle lncRNA FISH deneyi yapmak isteyen araştırmacılara referans olması açısından RNA FISH'in detaylı deneysel çalışma prosedürü ve önlemlerine örnek olarak yer verdik.
Introduction
İnsan genomu hakkındaki anlayışımız, tüm genom teknolojisindeki son gelişmelerle büyük ölçüde genişledi. İnsan genomunun yaklaşık% 93'ü RNA'lara kopyalanabilir, ancak RNA'ların sadece% 2'si proteinlere çevrilebilir; protein translasyon işlevi olmayan RNA'ların geri kalan %98'ine kodlamayan RNA (ncRNA)1 denir. Kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) bir sınıfı olarak, 200'den fazla nükleotid2 içeren uzun ncRNA'lar (lncRNA'lar), hücrelerin farklılaşma, döngü kontrolü, apoptoz, göç ve invazyon gibi birçok fizyolojik ve patolojik sürecine dahil olmaları nedeniyle artan bir ilgi görmüştür 3,4,5. LncRNA'lar, kromatin yapısını ve nükleer gen ekspresyonunu düzenlemek, mRNA ekleme sürecini kontrol etmek ve transkripsiyon sonrası modifikasyon6 gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla rollerini oynarlar. LncRNA'lar, hem transkripsiyonel hem de transkripsiyon sonrası seviyelerde malignitelerin oluşumunu, gelişimini ve metastazını düzenler. Transkripsiyonel regülasyon, kromozomal yapılara bağlanarak RNA transkripsiyonunu etkileyerek çekirdekte gerçekleştirilirken, transkripsiyon sonrası regülasyon, endojen rekabetçi bir RNA (ceRNA) mekanizması 5,7,8 aracılığıyla hedef genlerin kontrol edilmesiyle sitoplazmada gerçekleştirilir. CeRNA, yeni bir RNA etkileşimi mekanizması ortaya çıkardı, yani lncRNA'lar, miRNA'ları adsorbe etmek ve ilgili hedef genlerin miRNA aracılı bozunmasını inhibe etmek için bir sünger görevi görebilir9. Bu nedenle, lncRNA'ların hücre altı lokalizasyonu ile ilgili bilgiler, belirli bir lncRNA'nın sitoplazmada mı yoksa çekirdekte mi bulunduğu, biyolojik işlevlerini tanımlamaya yardımcı olmak için önemlidir.
Şu anda, lncRNA lokalizasyonu esas olarak iki yöntemle tespit edilmektedir, biri nükleus/sitoplazma fraksiyon izolasyon deneyi ve diğeri RNA BALIĞI ile. İlkinde, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonlardaki RNA'lar sırasıyla ekstrakte edilir ve daha sonra sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların oranını tespit etmek için spesifik lncRNA primerleri ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu yöntemin avantajı zaman verimliliği iken, dezavantajı gerçek lncRNA lokalizasyonunun sitoplazma ve çekirdekteki lncRNA'ların nispi oranı tarafından doğrudan yansıtılmamasıdır. RNA FISH, lncRNA'ya özgü antisens zincir dizilerinin tasarımı ve ardından floresan boyalarla etiketleme yoluyla hücrelerdeki lncRNA lokalizasyonunu tespit edebilir10. RNA FISH yöntemleri, florofor etiketli çoklu oligo prob setleri11, LNA probları12 ve dallanmış DNA (bDNA) probları13 dahil olmak üzere prob teknikleri ve tespit yöntemlerindeki gelişmelerle geliştirilmiştir. RNA FISH sadece lncRNA'nın lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda çift renkli veya çok renkli immünofloresan14 kullanarak diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir.
Bu çalışmada, RNA FISH ile osteosarkom hücrelerinde (143B) lncRNA küçük nükleolar RNA konak geni 6'nın (SNHG6) ayrıntılı hücre içi lokalizasyon saptama protokolünü örnek olarak dahil ettik. SNHG6, olgun eklenmiş formunda bir 600-730 nükleotid lncRNA'dır ve kolorektal kanser, mide kanseri, yumurtalık berrak hücreli karsinomu, osteosarkom ve hepatoselüler karsinomdahil olmak üzere çeşitli insan kanserlerinde yeni bir onkogen olarak tanımlanmıştır 15,16,17,18. Çalışmalar, SNHG6'nın proliferasyon, EMT ve otofaji gibi kanser hücrelerinin biyolojik davranışlarına katılımını doğruladı ve SNHG6'nın sitoplazmik lokalizasyonunu, miRNA'ları bağlayarak (süngerleyerek) hedef genleri etkileyebileceğini gösterdi15,16,17. RNA FISH tarafından SNHG6 hücre içi lokalizasyonunun bu ayrıntılı tespit protokolü burada sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve aletlerin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şekil 1 , RNA FISH için genel protokolü göstermektedir; Tablo 1 , tüm çözeltilerin bileşimini içerir ve Tablo 2 , bu protokolde kullanılan primer dizilerini içerir.
1. Prob hazırlığı
- İlgilenilen bir hedef lncRNA'nın FASTA dizisini tanımlayın ve edinin, örneğin GenBank'tan (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Web sitesindeki endikasyonları takiben, ISH problarını çevrimiçi olarak tasarlayın19 ve Cy3 etiketi ile sipariş edilecek probları listelemek için tasarım algoritmasının önerilerini inceleyin.
- Hibridizasyon tamponunu 37 °C'de 2 saat önceden inkübe edin.
- 4 optik yoğunluk (OD) probunu 160 μL dietilpirokarbonat (DEPC) ile muamele edilmiş ddH2O içinde ışıktan 1 mg / mL konsantrasyonda çözün.
NOT: Optik yoğunluk (OD), DNA ve RNA'nın ölçüm birimini temsil eder. Genellikle, 1 OD birimi = 33 μg/mL DNA. - Her kuyucuk için 200 μL prob karışımı hazırlayın (1.2 μL-10 μL prob, 70 μL hibridizasyon tamponu, DEPC ile muamele edilmiş ddH2O ila 200 μL ile hacmi oluşturun) ve bir dizi 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12.5 μg/mL ve 6 μg/mL.
NOT: Prob konsantrasyonunun önceden deneysel olarak araştırılması gerekir. Yüksek bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların spesifik olmayan bağlanmasına yol açarken, düşük bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların duyarsız veya başarısız tespitine yol açacaktır. - Prob karışımını 73 °C'de 5 dakika denatüre edin.
NOT: Cy3 etiketli DNA probu çift sarmallıysa, probu 95 °C'de 5 dakika boyunca tek sarmallı DNA'ya denatüre edin, ardından buz üzerinde 2 dakika hızla soğutun.
2. Hücre hazırlığı
- 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasında steril cam lameller üzerinde oyuk başına 50.000 143B hücre tohumlayın ve bunları DMEM'de 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
NOT: Burada ekilen spesifik hücre sayısı, tohumlanan hücrelerin 24 saat inkübe edildikten sonra %50'lik bir birleşmeye ulaşması için uygun olan hücre boyutuna göre değişir. Steril cam lameller, 12 oyuklu plaka için uygun olacak şekilde yuvarlaktır. - Ortamı çıkarın ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 x 5 dakika yıkayın.
NOT: DEPC ile muamele edilmiş ddH2O ile 1x PBS hazırlayın. DEPC tedavisi olmayan PBS, RNase içerdiğinden kullanılamaz. Aşağıdaki adımların tümünü RNase içermeyen koşullarda gerçekleştirin. - 1x PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika sabitlemek için her bir oyuğa 200 μL %100 etanol ekleyin.
- Etanolü çıkarın, her bir oyuğa 200 μL% 0.1 Triton X-100 (1x PBS'de) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
NOT: Sürenin Triton X-100 geçirgenliği ile sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerekir ve çok uzun olamaz. - % 0.1 Triton X-100'ü çıkarın ve 1x PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın.
NOT: Protokolün burada duraklatılması gerekiyorsa, PBS'yi %70 etanol ile değiştirin (%100 etanolün RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ve numuneyi 4 °C'de 3 aya kadar saklayın. - 1x PBS'yi çıkarın, her bir oyuğa 200 μL 2x sodyum salin sitrat (SSC) tamponu (20x SSC'nin RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 2x SSC tamponunu çıkarın, her bir oyuğa 200 μL% 70 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- % 70 etanolü atın, her bir oyuğa 200 μL %85 etanol (% 100 etanolün RNaz içermeyen ddH2O ile seyreltilmesi) ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- % 85 etanolü atın, her oyuğa 200 μL% 100 etanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
- % 100 etanolü emdirin ve atın; Kuyuların kurumasını bekleyin.
3. Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
- Her bir oyuğa 200 μL prob karışımı (adım 1.5'te olduğu gibi denatüre) ekleyin ve gece boyunca (16-18 saat) 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Hibridizasyon sıcaklığı ile prob konsantrasyonu arasında güçlü bir pozitif korelasyon vardır; Bu nedenle, arka planı optimize etmek için hem hibridizasyon sıcaklığı hem de prob konsantrasyonu azaltılmalıdır. - Ertesi gün, 37 °C'den numuneler alın ve prob karışımını atın. Her kuyucuğa 200 μL 0.4x SSC/%0.3 Tween-20 tamponu ekleyin (65 °C'de önceden ısıtılmış) ve oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.
- 0.4x SSC/%0.3 Tween-20 tamponunu çıkarın, her oyuğa 200 μL 2x SSC/%0.1 Tween-20 tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika yıkayın.
- 2x SSC /% 0.1 Tween-20 tamponunu çıkarın, 200 μL 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama solüsyonu (1 μg / mL) ekleyin ve ışıktan 20 dakika uzakta boyayın.
- DAPI boya solüsyonunu atın ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın.
- Sürgünün üzerine 50 μL sakız içeren montaj ortamı ekleyin ve sabitlemek için cam lamel sürgünün üzerine yerleştirin.
NOT: Lameli hücre tarafı aşağı bakacak şekilde slayta yerleştirdiğinizden emin olun. - Floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
NOT: Floresan mikroskobu veya lazer konfokal mikroskop kullanın; İkincisi, daha yüksek bir hassasiyet ve netlikte görüntüleme üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan osteosarkom hücrelerinde SNHG6 FISH'in temsili görüntüleri gösterilmiştir (Şekil 2). Negatif kontrol, negatif Ctrl probu ile tedavi edilir; pozitif kontrol U6 probu 20 ile tedavi edilir. SNHG6 probu ve U6 probu, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, mavi floresan yayan DNA'yı boyayan bir boyadır. Bu sonuç, SNHG6'nın esas olarak sitoplazmada lokalize olduğunu göstermektedir ve bu bilgi, SNHG6'nın daha fazla incelenmesi için önemli bir yön sağlayabilir.
Çok yüksek konsantrasyonda prob kullanılırsa, floresan mikroskobu altında bir arka plan rengi görülebilir. Şekil 3 , RNA BALIKLARINDA yüksek konsantrasyonda SNHG6 probu kullanıldığında temsili görüntüleri göstermektedir. Beyaz oklar spesifik olmayan boyamayı temsil eder.
Şekil 1: lncRNA için RNA FISH protokolünün akış şeması. Bu grafik, RNA FISH deney sürecinin anahtar protokolünü göstermektedir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; lncRNA = uzun kodlamayan RNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan osteosarkom hücrelerinde LncRNA'nın (SNHG6) lokalizasyonu (143B). Negatif kontrol, negatif kontrol probu ile tedavi edilir. Pozitif kontrol bir U6 probu ile tedavi edilir. SNHG6 ve U6 probları, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, DNA'yı boyayan ve mavi floresan yayan bir boyadır. Kırmızı ve mavi birleşerek pembeyi oluşturur. Görüntüler bir floresan mikroskobu kullanılarak alınır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: LncRNA = uzun kodlamayan RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA FISH'teki yüksek konsantrasyonlu SNHG6 probunun temsili görüntüleri. SNHG6 probları, kırmızı floresan yayan Cy3 ile etiketlenmiştir. DAPI, DNA'yı boyayan ve mavi floresan yayan bir boyadır. Kırmızı ve mavi birleşerek pembeyi oluşturur. Görüntüler bir floresan mikroskobu kullanılarak alınır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: RNA FISH hibridizasyon deneyinde kullanılan çözeltilerin bileşimi. Tüm seyreltmeler steril, RNaz içermeyen su ile yapılmalıdır. Eklenen tüm su, DEPC ile arıtılmış ddH2O'dur. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; DEPC = dietilpirokarbonat. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Bu deneyde kullanılan tüm prob dizileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu RNA FISH protokolü, yalnızca hücrelerdeki lncRNA'ların lokalizasyonunu tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda hücrelerdeki diğer RNA'ların, DNA'nın veya proteinlerin kolokalizasyonunu da tespit edebilir, bu da parafine gömülü dokulardaki lncRNA'ların yerini tespit etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda spesifik protokol farklıdır çünkü parafine gömülü dokuların mumdan arındırılması gerekir21. Bu deneysel prosedür 48 veya 96 oyuklu plakalarda uygulanabilir, ancak 384 oyuklu plakalar burada kullanılamayacak kadar küçüktür.
RNaz içermeyen ortam, prob konsantrasyonu, hibridizasyon sıcaklığı ve negatif ve pozitif kontrollerin ayarlanması dahil olmak üzere bu yöntemin birkaç kritik adımına dikkat edilmesi gerekir. İlk olarak, RNaz içermeyen durum çok önemlidir çünkü RNaz nükleotidler arasındaki bağları bozar ve genel olarak lncRNA'ların bozulmasına yol açar. İkinci olarak, yaygın olarak önerilen prob konsantrasyonu 5 ila 50 μg/mL arasında değişir. Yüksek bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların spesifik olmayan bağlanmasına yol açarken, düşük bir prob konsantrasyonu, lncRNA'ların duyarsız veya başarısız tespitine yol açacaktır19. Çok yüksek konsantrasyonda bir prob kullanılıyorsa, sadece karıştırılmış bir prob (negatif kontrol) varlığında bile floresan mikroskobu altında bir arka plan rengi görülebilir; Bu nedenle, spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı önlemek için uygun prob konsantrasyonunu araştıran ön deneyler sırasında taban çizgisini (dahili kontrol ile aynı) ayarlamak için genellikle aynı negatif kontrol konsantrasyonları kullanılır. Negatif kontrol grubunda, spesifik olmayan bağlanma olmadan en güçlü sinyali sunan, arka plan rengi olmayan en yüksek prob konsantrasyonu, aşağıdaki deneylerde kullanıldı. Üçüncüsü, belirli bir lncRNA ile optimizasyon için en az iki veya üç prob tasarlanması önerilir. Aynı zamanda, hedef lncRNA'ların tespit hassasiyetini artırmak için iki veya daha fazla prob da karıştırılabilir. Dördüncüsü, lncRNA probunun normal hibridizasyon sıcaklığı 37 °C'dir. Hibridizasyon işlemi sırasında, hibridizasyon sıcaklığı sabit ve homojen tutulmalıdır. Farklı problar arasındaki hibridizasyon sıcaklığı aralığı 34 ila 38 °C'dir. Hibridizasyon sıcaklığı, prob konsantrasyonu ile güçlü bir şekilde pozitif korelasyon gösterir; Bu nedenle, arka planı optimize etmek için prob konsantrasyonu azaltılmalıdır. Son olarak, negatif ve pozitif kontrollerin ayarlanması da çok önemlidir. Probsuz grup, arka plan sinyallerini elde etmek için negatif kontrol olarak kullanılır. Bir U6 probu veya bir ribozomal RNA probu, yanlış pozitif sonuç olasılığını dışlamak için pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
Bu yaklaşımın çeşitli avantajları vardır. lncRNA problarının floresan rengi değiştirilebilir. Yeşil floresan, floresein izotiyosiyanat (FITC), floresein (FAM) ve Alexa Fluor 488 tarafından yayılırken, kırmızı floresan Cy3 ve Alexa Fluor 555 tarafından yayılır. Tipik yeşil için FITC ve tipik kırmızı için Cy3 kullanılır. Ek olarak, görüntüler bir floresan mikroskobu veya bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir. İkincisinin görüntüleri, bir floresan mikroskobu kullanılarak elde edilenlerden daha hassas ve daha nettir.
RNA FISH yönteminin sınırlaması, bunun kalitatif bir yöntem olmasıdır; Bu nedenle, sonuçlar ölçülebilir değildir. Hibridizasyon süresindeki değişiklik ve floresan mikroskobu gözlemi sırasında öznel faktörlerin etkisi nedeniyle, hücrelerde lncRNA ekspresyonu doğru bir şekilde ölçülemez. Farklı hücresel fraksiyonlardaki lncRNA'ların ekspresyon seviyeleri sadece kalitatif olarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, teknikteki gelişmelerle birlikte, RNA ekspresyon seviyesini ölçmek için tek moleküllü bir floresan in situ hibridizasyon (smFISH) yöntemi22 geliştirilmiştir; Gelecekte daha fazla smFISH tespiti rapor edilebilir.
RNA FISH tekniği geniş bir uygulama alanına sahiptir. lncRNA'ların hücre içi lokalizasyonunun saptanması, lncRNA'ların biyolojik mekanizmalarının incelenmesine fayda sağlayacaktır. Aynı zamanda bu teknik, circRNA'lar, miRNA'lar ve tRNA'lar dahil olmak üzere hücrelerdeki diğer kodlamayan RNA'ların lokalizasyonunu tespit etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2020YFE0201600); (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408); (3) Şangay Hastane TCM Hazırlığının Endüstriyel Dönüşümü İşbirlikçi İnovasyon Merkezi; (4) Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Bütçesi Kapsamındaki Araştırma Projeleri (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al.
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
