Summary
本方案描述了一种RNA荧光 原位 杂交以在人骨肉瘤细胞中定位lncRNA的方法。
Abstract
已经研究了长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的重要作用，如调节癌细胞的增殖、上皮-间充质转化（EMT）、迁移、浸润和自噬。细胞中lncRNA的定位检测可以深入了解其功能。通过设计lncRNA特异性反义链序列，然后用荧光染料标记，RNA荧光 原位 杂交（FISH）可用于检测lncRNA的细胞定位。随着显微镜的发展，RNA FISH技术现在甚至可以对表达不良的lncRNA进行可视化。该方法不仅可以单独检测lncRNA的定位，还可以利用双色或多色免疫荧光检测其他RNA、DNA或蛋白质的共定位。在此，我们以人骨肉瘤细胞中的lncRNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）为例，对RNA FISH的详细实验操作步骤和注意事项进行了介绍，以期为想要进行RNA FISH实验，尤其是lncRNA FISH的研究人员提供参考。
Introduction
近年来，全基因组技术的进步极大地扩展了我们对人类基因组的理解。大约93%的人类基因组可以转录成RNA，但只有2%的RNA可以翻译成蛋白质;其余 98% 没有蛋白质翻译功能的 RNA 称为非编码 RNA （ncRNA）1。长链 ncRNA （lncRNA） 是一类非编码 RNA （ncRNA） 中含有 200 多个核苷酸2，由于参与细胞的许多生理和病理过程，如分化、周期调控、凋亡、迁移和侵袭 3,4,5，因此越来越受到关注.LncRNA通过调节染色质结构和核基因表达、控制mRNA剪接过程和转录后修饰等多种机制发挥作用6。LncRNA在转录和转录后水平上调节恶性肿瘤的发生、发展和转移。转录调控是通过与染色体结构结合影响 RNA 转录在细胞核中实现的，而转录后调控是通过内源性竞争性 RNA （ceRNA） 机制控制靶基因在细胞质中实现的 5,7,8。CeRNA揭示了一种新的RNA相互作用机制，即lncRNA可以作为海绵吸附miRNA，抑制miRNA介导的相关靶基因降解9。因此，有关lncRNA的亚细胞定位的信息，无论特定的lncRNA位于细胞质还是细胞核中，对于帮助确定其生物学功能都很重要。
目前，lncRNA定位主要通过两种方法进行检测，一种是通过细胞核/细胞质组分分离试验，另一种是通过RNA FISH。在前者中，分别提取细胞质和细胞核组分中的RNA，然后用特异性lncRNA引物进行PCR扩增，以检测细胞质和细胞核中lncRNA的比例。这种方法的优点是时间效率高，而缺点是实际的lncRNA定位不能直接反映在细胞质和细胞核中lncRNA的相对比例上。RNA FISH可以通过设计lncRNA特异性反义链序列，然后用荧光染料标记来检测细胞中的lncRNA定位10。随着探针技术和检测方法的进步，RNA FISH方法得到了改进，包括荧光团标记的多个寡核苷酸探针组11、LNA探针12和支链DNA（bDNA）探针13。RNA FISH不仅可以检测lncRNA的定位，还可以使用双色或多色免疫荧光14检测其他RNA、DNA或蛋白质的共定位。
在这项工作中，我们以RNA FISH在骨肉瘤细胞（143B）中lncRNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）的详细细胞内定位检测方案为例。SNHG6 是一种 600-730 核苷酸的成熟剪接形式的 lncRNA，被鉴定为多种人类癌症的新型致癌基因，包括结直肠癌、胃癌、卵巢透明细胞癌、骨肉瘤和肝细胞癌15、16、17、18。研究证实了 SNHG6 参与癌细胞的生物学行为，例如增殖、EMT 和自噬，并显示了 SNHG6 的细胞质定位，它可能通过结合（海绵化）miRNA15、16、17 来影响靶基因。本文介绍了通过RNA FISH进行SNHG6细胞内定位的详细检测方案。
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Protocol
有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。 图1 显示了RNA FISH的整体方案;表 1 包含所有溶液的组成， 表2 包含该协议中使用的引物序列。
1. 探针准备
- 识别并获取目标靶标 lncRNA 的 FASTA 序列，例如从 GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。按照网站上的指示，在线设计 ISH 探针19，并查看设计算法的建议，以列出要订购的带有 Cy3 标签的探针。
- 提前将杂交缓冲液在37°C孵育2小时。
- 将 4 个光密度 （OD） 探针溶解在 160 μL 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 处理的 ddH2O 中，浓度为 1 mg/mL，远离光。
注：光密度（OD）代表DNA和RNA的测量单位。通常，1 OD 单位 = 33 μg/mL DNA。 - 为每个孔准备200μL探针混合物（1.2μL-10μL探针，70μL杂交缓冲液，用DEPC处理的ddH 2O至200μL补足体积），并建立50μg/ mL，25μg/ mL，12.5μg/ mL和6μg/ mL的系列。
注意：探针浓度需要提前通过实验进行探索。高探针浓度会导致lncRNA的非特异性结合，而低探针浓度将导致lncRNA检测不灵敏或检测失败。 - 使探针混合物在73°C下变性5分钟。
注：如果Cy3标记的DNA探针是双链的，则在95°C下将探针变性为单链DNA，持续5分钟，然后在冰上快速冷却2分钟。
2. 细胞制备
- 在12孔细胞培养板中的无菌玻璃盖玻片上每孔接种50,000个143B细胞，并在DMEM中孵育24小时（37°C，5%CO2）。
注：此处接种的特定细胞数随细胞大小而变化，这适合于接种的细胞在孵育 24 小时后达到 50% 的汇合度。无菌玻璃盖玻片是圆形的，适用于 12 孔板。 - 取出培养基，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤2 x 5分钟。
注意：用DEPC处理的ddH2O准备1x PBS。在无RNase的条件下执行以下所有步骤。 - 取出1x PBS，并在每个孔中加入200μL的100%乙醇，在室温下固定15分钟。
- 除去乙醇，在每个孔中加入200μL0.1%Triton X-100（在1x PBS中），并在室温下孵育15分钟。
注意：时间需要用Triton X-100透化严格控制，不能太长。 - 除去0.1%Triton X-100，并用1x PBS洗涤2 x 5分钟。
注意：如果必须在此处暂停方案，请用70%乙醇替换PBS（用无RNase的ddH2O稀释100%乙醇），并将样品在4°C下储存长达3个月。 - 取出1x PBS，向每个孔中加入200μL2x盐水柠檬酸钠（SSC）缓冲液（用无RNase的ddH2O稀释20x SSC），并在37°C下孵育30分钟。
- 取出2x SSC缓冲液，向每个孔中加入200μL 70%乙醇，并在室温下孵育3分钟。
- 弃去70%乙醇，向每个孔中加入200μL85%乙醇（用不含RNase的ddH2O稀释100%乙醇），并在室温下孵育3分钟。
- 弃去85%乙醇，向每个孔中加入200μL100%乙醇，并在室温下孵育3分钟。
- 吸收并丢弃100%乙醇;让井干。
3. 荧光 原位 杂交（FISH）
- 向每个孔中加入200μL探针混合物（如步骤1.5所示变性），并在37°C下孵育过夜（16-18小时）。
注：杂交温度与探针浓度之间存在很强的正相关关系;因此，为了优化背景，应降低杂交温度和探针浓度。 - 第二天，从37°C取出样品并丢弃探针混合物。向每个孔中加入200μL的0.4x SSC / 0.3%吐温-20缓冲液（在65°C下预热），并在室温下洗涤2分钟。
- 取出0.4x SSC / 0.3%吐温-20缓冲液，向每个孔中加入200μL的2x SSC / 0.1%吐温-20缓冲液，并在室温下洗涤2分钟。
- 取出 2x SSC/0.1% 吐温-20 缓冲液，加入 200 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 染色溶液 （1 μg/mL），避光染色 20 分钟。
- 弃去DAPI染料溶液，在室温下用1x PBS洗涤2分钟。
- 将 50 μL 含有口香糖的封固剂加入载玻片上，并将玻璃盖玻片放在载玻片上进行固定。
注意：务必将盖玻片放在载玻片上，细胞面朝下。 - 在荧光显微镜下观察。
注意：使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜;后者产生更高的灵敏度和清晰度成像。
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Representative Results
显示了人骨肉瘤细胞中SNHG6 FISH的代表性图像（图2）。阴性对照用阴性Ctrl探针处理;阳性对照用U6探针 20处理。SNHG6探针和U6探针用Cy3标记，Cy3发出红色荧光。DAPI是一种染料，可对DNA进行染色，从而发出蓝色荧光。这一结果表明，SNHG6主要定位于细胞质中，这些信息可为SNHG6的进一步研究提供重要方向。
如果使用非常高浓度的探针，则可以在荧光显微镜下看到背景颜色。 图 3 显示了在 RNA FISH 中使用高浓度 SNHG6 探针时的代表性图像。白色箭头代表非特异性染色。
图 1：lncRNA 的 RNA FISH 方案流程图。该图表显示了RNA FISH实验过程的关键方案。缩写：FISH=荧光原位杂交;lncRNA = 长链非编码 RNA。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：LncRNA （SNHG6） 在人骨肉瘤细胞中的定位 （143B）。 阴性对照用阴性对照探针处理。阳性对照用 U6 探针处理。 SNHG6 和 U6 探针用 Cy3 标记，Cy3 发出红色荧光。DAPI是一种染料，可对DNA进行染色并发出蓝色荧光。红色和蓝色合并成粉红色。使用荧光显微镜拍摄图像。比例尺 = 10 μm。 缩写：LncRNA = 长链非编码 RNA;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：RNA FISH 中高浓度 SNHG6 探针的代表性图像。 SNHG6 探针用Cy3标记，Cy3发出红色荧光。DAPI是一种染料，可对DNA进行染色并发出蓝色荧光。红色和蓝色合并成粉红色。使用荧光显微镜拍摄图像。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
表1：RNA FISH杂交实验中使用的溶液组成。 所有稀释都应使用无菌、无 RNase 的水进行。所有添加的水均经过 DEPC 处理的 ddH2O。 缩写：FISH = 荧光 原位 杂交;DEPC = 焦碳酸二乙酯。 请按此下载此表格。
表2：本实验中使用的所有探针序列。请按此下载此表格。
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Discussion
该RNA FISH方案不仅可以检测lncRNA在细胞中的定位，还可以检测细胞中其他RNA、DNA或蛋白质的共定位，也可用于检测lncRNA在石蜡包埋组织中的位置。然而，在这种情况下的具体方案是不同的，因为石蜡包埋的组织需要脱蜡21。该实验程序可应用于 48 孔或 96 孔板，但 384 孔板太小，无法在此处使用。
需要注意该方法的几个关键步骤，包括无RNase环境、探针浓度、杂交温度以及阴性和阳性对照的设置。首先，无RNase条件至关重要，因为RNase会破坏核苷酸之间的键，并导致lncRNA的降解。其次，通常推荐的探针浓度范围为 5 至 50 μg/mL。高探针浓度会导致 lncRNA 的非特异性结合，而低探针浓度会导致 lncRNA 检测不灵敏或检测失败 19。如果使用非常高浓度的探针，即使在仅存在加扰探针（阴性对照）的情况下，也可以在荧光显微镜下看到背景颜色;因此，在初步实验期间，通常使用相同浓度的阴性对照来建立基线（与内部对照相同），探索适当的探针浓度，以避免任何非特异性结合。在以下实验中使用阴性对照组中不含背景色的最高探针浓度，在没有非特异性结合的情况下呈现最强的信号转导。第三，建议设计至少两个或三个探针，用于特定lncRNA的优化。同时，还可以混合使用两个或多个探针，以提高靶向lncRNA的检测灵敏度。第四，lncRNA探针的正常杂交温度为37°C。 在杂交过程中，杂交温度应保持恒定和均匀。不同探针之间的杂交温度范围为 34 至 38 °C。 杂交温度与探针浓度呈强正相关;因此，为了优化背景，应降低探针浓度。最后，设置阴性和阳性对照也很重要。无探针组用作阴性对照以获得背景信号。 使用U6 探针或核糖体RNA探针作为阳性对照，以排除假阳性结果的可能性。
这种方法有几个优点。lncRNA探针的荧光颜色可以改变。异硫氰酸荧光素 （FITC）、荧光素 （FAM） 和 Alexa Fluor 488 发出绿色荧光，而 Cy3 和 Alexa Fluor 555 发出红色荧光。FITC 用于典型的绿色，Cy3 用于典型的红色。此外，还可以使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜获得图像。后者的图像比使用荧光显微镜获得的图像更灵敏、更清晰。
RNA FISH方法的局限性在于这是一种定性方法;因此，结果是不可量化的。由于杂交时间的变化和荧光显微镜观察过程中主观因素的影响，lncRNA在细胞中的表达无法准确定量。lncRNA在不同细胞组分中的表达水平只能定性评估。然而，随着技术的改进，已经开发了一种单分子荧光 原位 杂交 （smFISH） 方法22 来定量 RNA 表达水平;未来可能会报道更多的smFISH检测。
RNA FISH技术具有广泛的应用。lncRNA的细胞内定位检测有利于lncRNAs生物学机制的研究。同时，该技术还可用于检测细胞中其他非编码RNA的定位，包括circRNA、miRNA和tRNA。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了（1）中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）的资助;（2）国家自然科学基金（81973877 82174408）;（3）上海市医院中药制剂产业转化协同创新中心;（4）上海中医药大学预算内研究项目（2021LK047）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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