Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

RNA-fluorescens in situ-hybridisering for lang, ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

Den foreliggende protokollen beskriver en metode for RNA-fluorescens in situ-hybridisering for å lokalisere lncRNAene i humane osteosarkomceller.

Abstract

De viktige rollene til lange ikke-kodende RNA (lncRNA) i kreft har blitt studert, for eksempel regulering av spredning, epitel-mesenkymal overgang (EMT), migrasjon, infiltrasjon og autofagi av kreftceller. Lokaliseringsdeteksjon av lncRNA i celler kan gi innsikt i deres funksjoner. Ved å designe den lncRNA-spesifikke antisensekjedesekvensen etterfulgt av merking med fluorescerende fargestoffer, kan RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) påføres for å oppdage den cellulære lokaliseringen av lncRNAer. Sammen med utviklingen av mikroskopi tillater RNA FISH-teknikkene nå til og med visualisering av de dårlig uttrykte lncRNAene. Denne metoden kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA alene, men også oppdage samlokalisering av andre RNAer, DNA eller proteiner ved å bruke dobbeltfarget eller flerfarget immunfluorescens. Her har vi inkludert den detaljerte eksperimentelle operasjonsprosedyren og forholdsregler for RNA FISH ved å bruke lncRNA lite nukleolært RNA-vertsgen 6 (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B) som et eksempel, for å gi en referanse for forskere som ønsker å utføre RNA FISH-eksperimenter, spesielt lncRNA FISH.

Introduction

Vår forståelse av det menneskelige genom har blitt sterkt utvidet av de siste fremskrittene innen helgenomteknologi. Omtrent 93% av det menneskelige genom kan transkriberes til RNA, men bare 2% av RNAene kan oversettes til proteiner; de resterende 98% av RNA som ikke har noen proteinoversettelsesfunksjon kalles ikke-kodende RNA (ncRNA)1. Som en klasse av ikke-kodende RNA (ncRNAer), har lange ncRNA (lncRNAer), som inneholder over 200 nukleotider2, tiltrukket seg økende oppmerksomhet på grunn av deres involvering i mange fysiologiske og patologiske prosesser i cellene, som differensiering, sykluskontroll, apoptose, migrasjon og invasjon 3,4,5. LncRNA spiller sine roller gjennom ulike mekanismer, for eksempel regulering av kromatinstruktur og nukleært genuttrykk, kontroll av mRNA-skjøteprosessen og posttranskripsjonell modifikasjon6. LncRNA regulerer forekomst, utvikling og metastase av maligniteter både på transkripsjons- og posttranskripsjonsnivå. Transkripsjonsregulering realiseres i kjernen ved å påvirke RNA-transkripsjon via binding til kromosomale strukturer, mens posttranskripsjonell regulering realiseres i cytoplasma ved å kontrollere målgenene via en endogen konkurransedyktig RNA (ceRNA) mekanisme 5,7,8. CeRNA har avslørt en ny mekanisme for RNA-interaksjon, nemlig at lncRNA kan fungere som en svamp for å adsorbere miRNA og hemme miRNA-mediert nedbrytning av relaterte målgener9. Derfor er informasjonen om subcellulær lokalisering av lncRNAer, om et spesifikt lncRNA er lokalisert i cytoplasma eller kjerne, viktig for å identifisere deres biologiske funksjoner.

For tiden oppdages lncRNA-lokalisering hovedsakelig ved to metoder, den ene er ved kjerne / cytoplasmafraksjonsisolasjonsanalyse, og den andre er av RNA FISH. I førstnevnte ekstraheres RNA i henholdsvis cytoplasmatiske og nukleære fraksjoner, og deretter utføres PCR-amplifikasjon med spesifikke lncRNA-primere for å oppdage forholdet mellom lncRNA i cytoplasma og kjerne. Fordelen med denne metoden er tidseffektivitet, mens ulempen er at den faktiske lncRNA-lokaliseringen ikke direkte reflekteres av den relative andelen lncRNA i cytoplasma og kjerne. RNA FISH kan oppdage lncRNA-lokalisering i celler gjennom design av lncRNA-spesifikke antisense-kjedesekvenser etterfulgt av merking med fluorescerende fargestoffer10. RNA FISH-metodene har blitt forbedret med fremskritt innen sondeteknikker og deteksjonsmetoder, inkludert fluoroformerkede flere oligoprobesett11, LNA-prober 12 og forgrenede DNA (bDNA) sonder13. RNA FISH kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA, men også oppdage samlokalisering av andre RNA, DNA eller proteiner ved å bruke dobbeltfarget eller flerfarget immunfluorescens14.

I dette arbeidet har vi inkludert den detaljerte intracellulære lokaliseringsdeteksjonsprotokollen for lncRNA lite nukleolært RNA-vertsgen 6 (SNHG6) i osteosarkomceller (143B) av RNA FISH som et eksempel. SNHG6 er et 600-730 nukleotid lncRNA i sin modne skjøteform og identifisert som et nytt onkogen i forskjellige humane kreftformer, inkludert kolorektal kreft, magekreft, ovarieklarcellet karsinom, osteosarkom og hepatocellulært karsinom15,16,17,18. Studier har bekreftet involvering av SNHG6 i biologisk oppførsel av kreftceller, som proliferasjon, EMT og autofagi, og vist cytoplasmatisk lokalisering av SNHG6 der det kan påvirke målgenene ved å binde (svampe) miRNAene15,16,17. Denne detaljerte deteksjonsprotokollen for SNHG6 intracellulær lokalisering av RNA FISH er presentert her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. Figur 1 viser den overordnede protokollen for RNA FISH; Tabell 1 inneholder sammensetningen av alle oppløsninger og tabell 2 inneholder primersekvensene som brukes i denne protokollen.

1. Forberedelse av sonde

  1. Identifiser og skaff deg FASTA-sekvensen av et mål lncRNA av interesse, for eksempel fra GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Etter indikasjonene på nettstedet, design ISH-sondene online19, og gjennomgå designalgoritmens forslag til å liste opp sondene som skal bestilles med Cy3-etikett.
  2. Inkuber hybridiseringsbufferen ved 37 °C i 2 timer på forhånd.
  3. Løs opp 4 sonder med optisk tetthet (OD) i 160 mikrol dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet ddH2O i konsentrasjonen av 1 mg/ml borte fra lys.
    MERK: Optisk tetthet (OD) representerer måleenheten for DNA og RNA. Vanligvis er 1 OD-enhet = 33 μg / ml DNA.
  4. Forbered 200 μL av sondeblandingen for hver brønn (1,2 μL-10 μL sonde, 70 μL hybridiseringsbuffer, utgjør volumet med DEPC-behandlet ddH2O til 200 μL), og sett opp en serie på 50 μg / ml, 25 μg / ml, 12,5 μg / ml og 6 μg / ml.
    MERK: Sondekonsentrasjonen må utforskes eksperimentelt på forhånd. En høy sondekonsentrasjon vil føre til uspesifikk binding av lncRNAer, mens en lav sondekonsentrasjon vil føre til ufølsom eller mislykket påvisning av lncRNAer.
  5. Denaturer sondeblandingen ved 73 °C i 5 minutter.
    MERK: Hvis den Cy3-merkede DNA-sonden er dobbeltstrenget, denaturer sonden til enkeltstrenget DNA ved 95 ° C i 5 minutter, og avkjøl deretter raskt i 2 minutter på is.

2. Cell forberedelse

  1. Frø 50.000 143B celler per brønn på sterile glassdeksler i en 12-brønns cellekulturplate og inkuber dem i 24 timer (37 ° C, 5% CO2) i DMEM.
    MERK: Det spesifikke cellenummeret som sås her varierer med cellestørrelsen, noe som passer for at de sådde cellene skal nå en sammenløp på 50% etter å ha blitt inkubert i 24 timer. De sterile glassdekslene er runde for å være egnet for 12-brønnsplaten.
  2. Fjern mediet og vask i 2 x 5 min med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
    MERK: Forbered 1x PBS med DEPC-behandlet ddH2O. PBS uten DEPC-behandling kan ikke brukes fordi den inneholder RNase. Utfør alle følgende trinn i RNase-frie forhold.
  3. Fjern 1x PBS og tilsett 200 μL 100% etanol i hver brønn for å fikse i 15 minutter ved romtemperatur.
  4. Fjern etanolen, tilsett 200 μL 0,1% Triton X-100 (i 1x PBS) i hver brønn, og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
    MERK: Tiden må kontrolleres strengt med Triton X-100 permeabilisering og kan ikke være for lang.
  5. Fjern 0,1% Triton X-100 og vask 2 x 5 min med 1x PBS.
    MERK: Hvis protokollen må settes på pause her, erstatt PBS med 70 % etanol (fortynning av 100 % etanol med RNasefri ddH2O) og oppbevar prøven ved 4 °C i opptil 3 måneder.
  6. Fjern 1x PBS, tilsett 200 μL 2x SSC-buffer (natriumsaltvannscitrat) (fortynning av 20x SSC med RNase-fri ddH2O) i hver brønn, og inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
  7. Fjern 2x SSC-buffer, tilsett 200 μL 70% etanol i hver brønn, og inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  8. Kast 70% etanol, tilsett 200 μL 85% etanol (fortynning av 100% etanol med RNase-fri ddH2O) i hver brønn, og inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  9. Kast 85% etanol, tilsett 200 μL 100% etanol i hver brønn, og inkuber i 3 minutter ved romtemperatur.
  10. Absorbere og kaste bort 100% etanol; La brønnene tørke.

3. Fluorescens in situ hybridisering (FISH)

  1. Tilsett 200 μL sondeblanding (denaturert som i trinn 1.5) til hver brønn og inkuber ved 37 °C over natten (16-18 timer).
    MERK: Det er en sterk positiv korrelasjon mellom hybridiseringstemperatur og sondekonsentrasjon; Derfor, for å optimalisere bakgrunnen, bør både hybridiseringstemperaturen og sondekonsentrasjonen reduseres.
  2. Neste dag tar du prøver fra 37 °C og kaster sondeblandingen. Tilsett 200 μL 0,4x SSC/0,3 % mellom-20-buffer i hver brønn (forvarmet ved 65 °C) og vask i 2 minutter ved romtemperatur.
  3. Fjern 0,4x SSC/0,3% Tween-20 bufferen, tilsett 200 μL 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer til hver brønn, og vask i 2 min ved romtemperatur.
  4. Fjern 2x SSC/0,1 % mellom-20-buffer, tilsett 200 μL 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fargeløsning (1 μg/ml), og beis i 20 minutter fra lys.
  5. Kast DAPI-fargestoffoppløsningen og vask med 1x PBS i 2 minutter ved romtemperatur.
  6. Tilsett 50 μL monteringsmedium som inneholder tyggegummi på lysbildet og legg glassdekselet på lysbildet for å feste.
    NOTAT: Pass på å plassere dekselet på lysbildet med cellesiden ned.
  7. Observer under et fluorescensmikroskop.
    MERK: Bruk et fluorescensmikroskop eller et laserkonfokalmikroskop; Sistnevnte gir en høyere følsomhet og klarhetsbilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representative bilder av SNHG6 FISH i humane osteosarkomceller er vist (figur 2). Den negative kontrollen behandles med den negative Ctrl-sonden; positiv kontroll behandles med U6-sonde 20. SNHG6-sonden og U6-sonden er merket med Cy3, som avgir rød fluorescens. DAPI er et fargestoff som flekker DNA, som avgir blå fluorescens. Dette resultatet viser at SNHG6 hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma, og denne informasjonen kan gi en viktig retning for videre studier av SNHG6.

Hvis en meget høy konsentrasjon av sonde brukes, kan en bakgrunnsfarge ses under fluorescensmikroskopet. Figur 3 viser de representative bildene når en høy konsentrasjon av SNHG6-sonden brukes i RNA FISH. De hvite pilene representerer uspesifikk farging.

Figure 1
Figur 1: Flytdiagram over RNA FISH-protokollen for lncRNA. Dette diagrammet viser nøkkelprotokollen for RNA FISH-eksperimentprosessen. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; lncRNA = langt ikke-kodende RNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Lokalisasjon av LncRNA (SNHG6) i humane osteosarkomceller (143B). Negativ kontroll behandles med en negativ kontrollsonde. Positiv kontroll behandles med en U6-sonde . SNHG6 - og U6-sonder er merket med Cy3, som avgir rød fluorescens. DAPI er et fargestoff som flekker DNA og avgir blå fluorescens. Rødt og blått smelter sammen for å lage rosa. Bildene er tatt med fluorescensmikroskop. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: LncRNA = langt ikke-kodende RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: De representative bildene av høy konsentrasjon av SNHG6-sonde i RNA FISH. SNHG6-sonder er merket med Cy3, som avgir rød fluorescens. DAPI er et fargestoff som flekker DNA og avgir blå fluorescens. Rødt og blått smelter sammen for å lage rosa. Bildene er tatt med fluorescensmikroskop. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetningen av løsninger brukt i RNA FISH-hybridiseringseksperimentet. Alle fortynninger skal gjøres med sterilt, RNase-fritt vann. Alt tilsatt vann er DEPC-behandlet ddH2O. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; DEPC = dietylpyrokarbonat. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Alle sondesekvenser brukt i dette eksperimentet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne RNA FISH-protokollen kan ikke bare oppdage lokalisering av lncRNA i celler, men også oppdage samlokalisering av andre RNAer, DNA eller proteiner i celler, som også kan brukes til å oppdage plasseringen av lncRNA i parafin-innebygd vev. Den spesifikke protokollen i slike tilfeller er imidlertid annerledes fordi det parafininnebygde vevet må avvoks21. Denne eksperimentelle prosedyren kan brukes i 48- eller 96-brønnsplater, men 384-brønnplater er for små til å brukes her.

Flere kritiske trinn i denne metoden må noteres, inkludert RNase-fritt miljø, sondekonsentrasjon, hybridiseringstemperatur og innstilling av negative og positive kontroller. For det første er RNase-fri tilstand avgjørende fordi RNase bryter ned bindingene mellom nukleotider og fører til nedbrytning av lncRNA generelt. For det andre varierer den vanlige anbefalte sondekonsentrasjonen fra 5 til 50 μg / ml. En høy sondekonsentrasjon vil føre til uspesifikk binding av lncRNA, mens en lav sondekonsentrasjon vil føre til ufølsom eller mislykket påvisning av lncRNA19. Hvis en meget høy konsentrasjon av sonde brukes, kan en bakgrunnsfarge ses under fluorescensmikroskopet selv i nærvær av en kryptert sonde (en negativ kontroll); Derfor brukes de samme konsentrasjonene av negative kontroller vanligvis til å sette opp grunnlinjen (samme som den interne kontrollen) under de innledende eksperimentene som utforsker riktig sondekonsentrasjon for å unngå uspesifikk binding. Den høyeste sondekonsentrasjonen uten bakgrunnsfarge i den negative kontrollgruppen, som presenterte den sterkeste signaleringen uten ikke-spesifikk binding, ble brukt i de følgende forsøkene. For det tredje anbefales det å designe minst to eller tre sonder for optimalisering med et spesifikt lncRNA. Samtidig kan to eller flere sonder også blandes for å forbedre deteksjonsfølsomheten til mål-lncRNAer. For det fjerde er den normale hybridiseringstemperaturen til lncRNA-sonden 37 ° C. Under hybridiseringsprosessen bør hybridiseringstemperaturen holdes konstant og jevn. Utvalget av hybridiseringstemperatur mellom forskjellige sonder er 34 til 38 ° C. Hybridiseringstemperaturen er sterkt positivt korrelert med sondekonsentrasjonen; Derfor, for å optimalisere bakgrunnen, bør sondekonsentrasjonen reduseres. Til slutt er det også viktig å sette negative og positive kontroller. Gruppen uten sonde brukes som en negativ kontroll for å oppnå bakgrunnssignaler. En U6-sonde eller en ribosomal RNA-sonde brukes som en positiv kontroll for å utelukke muligheten for falske positive resultater.

Denne tilnærmingen har flere fordeler. Fluorescensfargen til lncRNA-sonder kan endres. Grønn fluorescens sendes ut av fluoresceinisotiocyanat (FITC), fluorescein (FAM) og Alexa Fluor 488, mens rød fluorescens sendes ut av Cy3 og Alexa Fluor 555. FITC brukes for typisk grønn og Cy3 for typisk rød. I tillegg kan bildene oppnås ved å bruke enten et fluorescensmikroskop eller et laserkonfokalmikroskop. Sistnevntes bilder er mer følsomme og klarere enn de som er oppnådd ved hjelp av et fluorescensmikroskop.

Begrensningen av RNA FISH-metoden er at dette er en kvalitativ metode; Resultatene er derfor ikke kvantifiserbare. På grunn av endringen i hybridiseringstid og påvirkning av subjektive faktorer under fluorescensmikroskopobservasjon, kan lncRNA-ekspresjon ikke kvantifiseres nøyaktig i celler. Ekspresjonsnivåene av lncRNA i forskjellige cellulære fraksjoner kan bare evalueres kvalitativt. Imidlertid, med forbedring i teknikken, har en enkeltmolekyl fluorescerende in situ hybridisering (smFISH) metode22 blitt utviklet for å kvantifisere RNA-ekspresjonsnivået; Mer smFISH-deteksjon kan bli rapportert i fremtiden.

RNA FISH-teknikken har et bredt spekter av applikasjoner. Den intracellulære lokaliseringsdeteksjonen av lncRNA vil være til nytte for studiet av de biologiske mekanismene til lncRNAer. Samtidig kan denne teknikken også brukes til å oppdage lokalisering av andre ikke-kodende RNA i celler, inkludert circRNAer, miRNA og tRNAer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av tilskudd fra (1) National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) National Nature Science Foundation (81973877 og 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center for industriell transformasjon av sykehus TCM forberedelse; (4) Forskningsprosjekter innenfor budsjettet til Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).

Tags

RNA-fluorescens in situ-hybridisering lange ikke-kodende RNAer kreft spredning epitel-mesenkymal overgang migrasjon infiltrasjon autofagi cellulær lokalisering fluorescerende fargestoffer RNA FISH-teknikker mikroskopi dårlig uttrykte LncRNAer samlokalisering dobbeltfarget immunfluorescens flerfarget immunfluorescens eksperimentell operasjonsprosedyre forholdsregler
RNA-fluorescens <em>in situ-hybridisering</em> for lang, ikke-kodende RNA-lokalisering i humane osteosarkomceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou,… More

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter