Summary
Le présent protocole décrit une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour localiser les ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain.
Abstract
Les rôles importants des longs ARN non codants (ARNlnc) dans le cancer ont été étudiés, tels que la régulation de la prolifération, de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), de la migration, de l’infiltration et de l’autophagie des cellules cancéreuses. La détection de localisation des ARNlnc dans les cellules peut donner un aperçu de leurs fonctions. En concevant la séquence de chaîne antisens spécifique de l’ARNlnc suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents, l’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN (FISH) peut être appliquée pour détecter la localisation cellulaire des ARNlnc. Avec le développement de la microscopie, les techniques RNA FISH permettent même aujourd’hui de visualiser les ARNlnc faiblement exprimés. Cette méthode permet non seulement de détecter la localisation des ARNlnc seuls, mais aussi de détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore. Ici, nous avons inclus la procédure d’opération expérimentale détaillée et les précautions de l’ARN FISH en utilisant le gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARN lnc dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B) à titre d’exemple, afin de fournir une référence pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH, en particulier lncRNA FISH.
Introduction
Notre compréhension du génome humain a été considérablement élargie par les progrès récents de la technologie du génome entier. Environ 93 % du génome humain peut être transcrit en ARN, mais seulement 2 % des ARN peuvent être traduits en protéines ; les 98 % restants d’ARN qui n’ont pas de fonction de traduction protéique sont appelés ARN non codant (ARNnc)1. En tant que classe d’ARN non codants (ARNnc), les ARNnc longs (ARNlnc), contenant plus de 200 nucléotides2, ont attiré une attention croissante en raison de leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des cellules, tels que la différenciation, le contrôle du cycle, l’apoptose, la migration et l’invasion 3,4,5. Les ARNlnc jouent leur rôle par le biais de divers mécanismes, tels que la régulation de la structure de la chromatine et de l’expression des gènes nucléaires, le contrôle du processus d’épissage de l’ARNm et la modification post-transcriptionnelle6. Les ARNlnc régulent l’apparition, le développement et les métastases des tumeurs malignes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. La régulation transcriptionnelle est réalisée dans le noyau en affectant la transcription de l’ARN via la liaison aux structures chromosomiques, tandis que la régulation post-transcriptionnelle est réalisée dans le cytoplasme en contrôlant les gènes cibles via un mécanisme d’ARN compétitif endogène (ARNce) 5,7,8. L’ARNc a révélé un nouveau mécanisme d’interaction avec l’ARNc, à savoir que les ARNlnc peuvent agir comme une éponge pour adsorber les miARN et inhiber la dégradation médiée par les miARN des gènes cibles apparentés9. Par conséquent, les informations concernant la localisation subcellulaire des ARNlnc, qu’un ARNlnc spécifique soit situé dans le cytoplasme ou le noyau, sont importantes pour aider à identifier leurs fonctions biologiques.
À l’heure actuelle, la localisation de l’ARNlnc est principalement détectée par deux méthodes, l’une par test d’isolement de fraction noyau/cytoplasme, et l’autre par ARN FISH. Dans le premier cas, les ARN des fractions cytoplasmique et nucléaire sont extraits respectivement, puis l’amplification par PCR est réalisée avec des amorces d’ARNlnc spécifiques pour détecter le rapport des ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. L’avantage de cette méthode est l’efficacité temporelle, tandis que l’inconvénient est que la localisation réelle de l’ARNlnc n’est pas directement reflétée par la proportion relative d’ARNlnc dans le cytoplasme et le noyau. RNA FISH peut détecter la localisation de l’ARNlnc dans les cellules grâce à la conception de séquences de chaînes antisens spécifiques à l’ARNlnc, suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents10. Les méthodes RNA FISH ont été améliorées grâce aux progrès des techniques de sonde et des méthodes de détection, y compris les ensembles de sondes à oligosondes multiplesmarquées aux fluorophores 11, les sondes LNA 12 et les sondes à ADN ramifié (ADNb)13. L’ARN FISH peut non seulement détecter la localisation de l’ARNlnc, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore14.
Dans ce travail, nous avons inclus le protocole détaillé de détection de localisation intracellulaire du gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome (143B) par RNA FISH à titre d’exemple. SNHG6 est un ARNlnc nucléotidique de 600 à 730 dans sa forme épissée mature et identifié comme un nouvel oncogène dans divers cancers humains, notamment le cancer colorectal, le cancer gastrique, le carcinome à cellules claires de l’ovaire, l’ostéosarcome et le carcinome hépatocellulaire15,16,17,18. Des études ont confirmé l’implication de SNHG6 dans les comportements biologiques des cellules cancéreuses, tels que la prolifération, l’EMT et l’autophagie, et ont montré la localisation cytoplasmique de SNHG6 où il peut affecter les gènes cibles en se liant (éponger) les miARN15,16,17. Ce protocole détaillé de détection de la localisation intracellulaire de SNHG6 par RNA FISH est présenté ici.
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Protocol
Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. La figure 1 montre le protocole global pour l’ARN FISH ; Le tableau 1 contient la composition de toutes les solutions et le tableau 2 contient les séquences d’amorces utilisées dans ce protocole.
1. Préparation de la sonde
- Identifier et acquérir la séquence FASTA d’un ARNlnc cible d’intérêt, par exemple, à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). En suivant les indications sur le site Web, concevez les sondes ISH en ligne19 et passez en revue les suggestions de l’algorithme de conception pour répertorier les sondes à commander avec l’étiquette Cy3.
- Incuber le tampon d’hybridation à 37 °C pendant 2 h à l’avance.
- Dissoudre la sonde à 4 densités optiques (OD) dans 160 μL de ddH2O traité au diéthylpyrocarbonate (DEPC) à la concentration de 1 mg/mL à l’abri de la lumière.
REMARQUE : La densité optique (OD) représente l’unité de mesure de l’ADN et de l’ARN. Habituellement, 1 unité OD = 33 μg/mL d’ADN. - Préparer 200 μL du mélange de sonde pour chaque puits (1,2 μL-10 μL de sonde, 70 μL de tampon d’hybridation, compléter le volume avec du ddH2O à 200 μL traité par DEPC) et mettre en place une série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL et 6 μg/mL.
REMARQUE : La concentration de la sonde doit être explorée expérimentalement à l’avance. Une concentration élevée de sonde conduira à une liaison non spécifique des ARNlnc, tandis qu’une faible concentration de sonde conduira à une détection insensible ou à l’échec de la détection des ARNlnc. - Dénaturer le mélange de sonde à 73 °C pendant 5 min.
REMARQUE : Si la sonde d’ADN marquée Cy3 est double brin, dénaturez la sonde en ADN simple brin à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez rapidement pendant 2 minutes sur de la glace.
2. Préparation des cellules
- Ensemencer 50 000 cellules 143B par puits sur des lamelles de verre stériles dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits et les incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2) dans du DMEM.
REMARQUE : Le nombre spécifique de cellules ensemencées ici varie en fonction de la taille des cellules, ce qui est approprié pour que les cellules ensemencées atteignent une confluence de 50% après avoir été incubées pendant 24 h. Les lamelles en verre stériles sont rondes pour s’adapter à la plaque à 12 puits. - Retirez le milieu et lavez pendant 2 x 5 min avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE : Préparez 1x PBS avec du ddH2O traité par DEPC. Le PBS sans traitement DEPC ne peut pas être utilisé car il contient de la RNase. Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions exemptes de RNase. - Retirez 1x PBS et ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits pour fixer pendant 15 min à température ambiante.
- Retirer l’éthanol, ajouter 200 μL de Triton X-100 à 0,1 % (dans 1 PBS) dans chaque puits et incuber pendant 15 min à température ambiante.
REMARQUE : Le temps doit être strictement contrôlé avec la perméabilisation Triton X-100 et ne doit pas être trop long. - Retirez 0,1 % de Triton X-100 et lavez 2 x 5 min avec 1x PBS.
REMARQUE : Si le protocole doit être interrompu ici, remplacez le PBS par de l’éthanol à 70% (dilution de l’éthanol à 100% avec du ddH2O sans RNase) et conservez l’échantillon à 4 °C jusqu’à 3 mois. - Retirer 1x PBS, ajouter 200 μL de tampon 2x citrate salin de sodium (SSC) (dilution de 20x SSC avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits, et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Retirez 2 tampons SSC, ajoutez 200 μL d’éthanol à 70 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.
- Jeter l’éthanol à 70 %, ajouter 200 μL d’éthanol à 85 % (dilution de l’éthanol à 100 % avec du ddH2O sans RNase) dans chaque puits et incuber pendant 3 min à température ambiante.
- Jetez l’éthanol à 85 %, ajoutez 200 μL d’éthanol à 100 % dans chaque puits et incubez pendant 3 minutes à température ambiante.
- Absorber et jeter 100 % d’éthanol ; Laissez sécher les puits.
3. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
- Ajouter 200 μL de mélange de sondes (dénaturé comme à l’étape 1.5) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant la nuit (16-18 h).
NOTE : Il existe une forte corrélation positive entre la température d’hybridation et la concentration de la sonde ; Par conséquent, pour optimiser le bruit de fond, la température d’hybridation et la concentration de la sonde doivent être réduites. - Le lendemain, prélevez des échantillons à 37 °C et jetez le mélange de sondes. Ajouter 200 μL de tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20 dans chaque puits (préchauffé à 65 °C) et laver pendant 2 min à température ambiante.
- Retirez le tampon 0,4x SSC/0,3 % Tween-20, ajoutez 200 μL de tampon 2x SSC/0,1 % Tween-20 dans chaque puits et lavez pendant 2 minutes à température ambiante.
- Retirer 2 tampons SSC/0,1 % Tween-20, ajouter 200 μL de solution colorante 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) et colorer pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.
- Jetez la solution de colorant DAPI et lavez avec 1x PBS pendant 2 min à température ambiante.
- Ajoutez 50 μL de médium de montage contenant de la gomme sur la lame et placez la lamelle en verre sur la lame pour la fixer.
REMARQUE : Assurez-vous de placer la lamelle sur la lame avec le côté de la cellule vers le bas. - Observez au microscope à fluorescence.
REMARQUE : Utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal laser ; Ce dernier produit une imagerie plus sensible et plus claire.
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Representative Results
Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées (Figure 2). Le contrôle négatif est traité avec la sonde Ctrl négative ; Le contrôle positif est traité avec la sonde U6 20. La sonde SNHG6 et la sonde U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN, qui émet une fluorescence bleue. Ce résultat montre que SNHG6 est principalement localisé dans le cytoplasme, et cette information peut fournir une direction importante pour une étude ultérieure de SNHG6.
Si une très forte concentration de sonde est utilisée, une couleur de fond peut être vue au microscope à fluorescence. La figure 3 montre les images représentatives lorsqu’une forte concentration de sonde SNHG6 est utilisée dans l’ARN FISH. Les flèches blanches représentent une coloration non spécifique.
Figure 1 : Organigramme du protocole RNA FISH pour l’ARNlnc. Ce tableau montre le protocole clé du processus expérimental RNA FISH. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence ; lncRNA = long ARN non codant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Localisation de l’ARNlnc (SNHG6) dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B). Le contrôle négatif est traité à l’aide d’une sonde de contrôle négatif. Le contrôle positif est traité à l’aide d’une sonde U6. Les sondes SNHG6 et U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN et émet une fluorescence bleue. Le rouge et le bleu fusionnent pour former du rose. Les images sont prises à l’aide d’un microscope à fluorescence. Barre d’échelle = 10 μm. Abréviations : ARNlnc = long ARN non codant ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Les images représentatives de la forte concentration de la sonde SNHG6 dans l’ARN FISH.Les sondes SNHG6 sont marquées avec du Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN et émet une fluorescence bleue. Le rouge et le bleu fusionnent pour former du rose. Les images sont prises à l’aide d’un microscope à fluorescence. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Composition des solutions utilisées dans l’expérience d’hybridation ARN FISH. Toutes les dilutions doivent être effectuées avec de l’eau stérile et exempte de RNase. Toute l’eau ajoutée est traitée au DEPC ddH2O. Abréviations : FISH = hybridation in situ par fluorescence ; DEPC = diéthylpyrocarbonate. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Toutes les séquences de sondes utilisées dans cette expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Ce protocole RNA FISH peut non seulement détecter la localisation des ARNlnc dans les cellules, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines dans les cellules, qui peuvent également être utilisés pour détecter l’emplacement des ARNlnc dans les tissus enrobés de paraffine. Cependant, le protocole spécifique dans de tels cas est différent car les tissus enrobés de paraffine doivent être déparaffinés21. Cette procédure expérimentale peut être appliquée dans des plaques de 48 ou 96 puits, mais les plaques de 384 puits sont trop petites pour être utilisées ici.
Plusieurs étapes critiques de cette méthode doivent être notées, notamment l’environnement exempt de RNase, la concentration de la sonde, la température d’hybridation et le réglage des témoins négatifs et positifs. Tout d’abord, la condition sans RNase est cruciale car la RNase brise les liaisons entre les nucléotides et conduit à la dégradation des ARNlnc en général. Deuxièmement, la concentration couramment recommandée pour la sonde varie de 5 à 50 μg/mL. Une concentration élevée de la sonde conduira à une liaison non spécifique des ARNlnc, tandis qu’une faible concentration de la sonde conduira à une détection insensible ou à l’échec de la détection des ARNlnc19. Si une très forte concentration de sonde est utilisée, une couleur de fond peut être vue au microscope à fluorescence même en présence d’une sonde brouillée (un témoin négatif) uniquement ; Par conséquent, les mêmes concentrations de témoins négatifs sont généralement utilisées pour établir la ligne de base (la même que pour le contrôle interne) au cours des expériences préliminaires explorant la concentration de sonde appropriée afin d’éviter toute liaison non spécifique. La concentration de sonde la plus élevée sans couleur de fond dans le groupe témoin négatif, présentant la signalisation la plus forte sans liaison non spécifique, a été utilisée dans les expériences suivantes. Troisièmement, il est recommandé de concevoir au moins deux ou trois sondes pour l’optimisation avec un ARNlnc spécifique. Dans le même temps, deux sondes ou plus peuvent également être mélangées pour améliorer la sensibilité de détection des ARNlnc cibles. Quatrièmement, la température normale d’hybridation de la sonde d’ARNlnc est de 37 °C. Pendant le processus d’hybridation, la température d’hybridation doit être maintenue constante et uniforme. La plage de température d’hybridation entre les différentes sondes est de 34 à 38 °C. La température d’hybridation est fortement corrélée positivement avec la concentration de la sonde ; Par conséquent, pour optimiser le bruit de fond, la concentration de la sonde doit être réduite. Enfin, il est également essentiel de définir des contrôles négatifs et positifs. Le groupe sans sonde est utilisé comme contrôle négatif pour obtenir des signaux de fond. Une sonde U6 ou une sonde à ARN ribosomique est utilisée comme témoin positif pour exclure la possibilité de résultats faussement positifs.
Cette approche présente plusieurs avantages. La couleur de fluorescence des sondes d’ARNlnc peut être modifiée. La fluorescence verte est émise par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), la fluorescéine (FAM) et Alexa Fluor 488, tandis que la fluorescence rouge est émise par Cy3 et Alexa Fluor 555. FITC est utilisé pour le vert typique et Cy3 pour le rouge typique. De plus, les images peuvent être obtenues à l’aide d’un microscope à fluorescence ou d’un microscope confocal laser. Les images de ce dernier sont plus sensibles et plus claires que celles acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence.
La limite de la méthode RNA FISH est qu’il s’agit d’une méthode qualitative ; Par conséquent, les résultats ne sont pas quantifiables. En raison de la modification du temps d’hybridation et de l’influence de facteurs subjectifs lors de l’observation au microscope à fluorescence, l’expression de l’ARNlnc ne peut pas être quantifiée avec précision dans les cellules. Les niveaux d’expression des ARNlnc dans différentes fractions cellulaires ne peuvent être évalués que qualitativement. Cependant, avec l’amélioration de la technique, une méthode d’hybridation in situ fluorescente à molécule unique (smFISH)22 a été développée pour quantifier le niveau d’expression de l’ARN ; D’autres détections de smFISH pourraient être signalées à l’avenir.
La technique RNA FISH a un large éventail d’applications. La détection de localisation intracellulaire des ARNlnc bénéficiera à l’étude des mécanismes biologiques des ARNlnc. Dans le même temps, cette technique peut également être utilisée pour détecter la localisation d’autres ARN non codants dans les cellules, notamment les circARN, les miARN et les ARNt.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ces travaux sont soutenus par des subventions de (1) le Programme national de recherche et développement clés de la Chine (2020YFE0201600) ; (2) la National Nature Science Foundation (81973877 et 82174408) ; (3) Centre d’innovation collaborative de Shanghai pour la transformation industrielle de la préparation de la MTC hospitalière ; (4) Projets de recherche dans le cadre du budget de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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