Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.

Abstract

התפקידים החשובים של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) בסרטן נחקרו, כגון ויסות ההתפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), הגירה, חדירה ואוטופגיה של תאים סרטניים. זיהוי לוקליזציה של lncRNA בתאים יכול לספק תובנה לגבי תפקודיהם. על ידי תכנון רצף שרשרת האנטיסנס הספציפי ל-lncRNA ואחריו תיוג בצבעים פלואורסצנטיים, ניתן ליישם הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA (FISH) כדי לזהות את הלוקליזציה התאית של lncRNAs. יחד עם התפתחות המיקרוסקופ, טכניקות RNA FISH מאפשרות כעת אפילו הדמיה של lncRNA מבוטא בצורה גרועה. שיטה זו יכולה לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA לבד, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNA אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או multicolor immunofluorescence. כאן, כללנו את הליך הפעולה הניסויי המפורט ואת אמצעי הזהירות של RNA FISH באמצעות lncRNA גרעין קטן RNA מארח גן 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B) כדוגמה, כדי לספק התייחסות לחוקרים שרוצים לבצע ניסויים RNA FISH, במיוחד lncRNA דגים.

Introduction

הבנתנו את הגנום האנושי הורחבה מאוד על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הגנום השלם. כ-93% מהגנום האנושי ניתן לשעתוק לרנ"א, אך רק 2% מהרנ"א ניתן לתרגם לחלבונים; 98% הנותרים של RNA שאין להם פונקציית תרגום חלבונים נקראים RNA לא מקודד (ncRNA)1. כקבוצה של רנ"א לא מקודד (ncRNAs), ncRNA ארוך (lncRNAs), המכיל מעל 200 נוקלאוטידים2, משכו תשומת לב גוברת בשל מעורבותם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של התאים, כגון התמיינות, בקרת מחזור, אפופטוזיס, הגירה ופלישה 3,4,5. LncRNA ממלאים את תפקידם באמצעות מנגנונים שונים, כגון ויסות מבנה הכרומטין וביטוי גנים גרעיניים, שליטה בתהליך השחבור mRNA, ושינוי לאחר שעתוק6. LncRNAs מווסתים את ההתרחשות, ההתפתחות והגרורות של ממאירויות הן ברמת השעתוק והן ברמת השעתוק שלאחר השעתוק. ויסות השעתוק מתממש בגרעין על ידי השפעה על שעתוק RNA באמצעות קשירה למבנים הכרומוזומליים, בעוד שהוויסות שלאחר השעתוק מתממש בציטופלסמה על ידי שליטה בגני המטרה באמצעות מנגנון RNA תחרותי אנדוגני(ceRNA) 5,7,8. CeRNA חשפה מנגנון חדש של אינטראקציית RNA, כלומר ש-lncRNA יכול לשמש כספוג כדי לספוח miRNA ולעכב את הפירוק בתיווך miRNA של גני מטרה קשורים9. לכן, המידע לגבי לוקליזציה תת-תאית של lncRNAs, האם lncRNA מסוים ממוקם בציטופלסמה או בגרעין, חשוב כדי לסייע בזיהוי הפונקציות הביולוגיות שלהם.

כיום, לוקליזציה של lncRNA מזוהה בעיקר על ידי שתי שיטות, האחת היא על ידי בדיקת בידוד שברים גרעין/ציטופלסמה, והשנייה היא על ידי RNA FISH. בראשון, RNAs בשברים הציטופלזמיים והגרעיניים מופקים בהתאמה, ולאחר מכן הגברה PCR מבוצעת עם פריימרים ספציפיים lncRNA כדי לזהות את היחס של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. היתרון של שיטה זו הוא יעילות הזמן, בעוד החיסרון הוא כי לוקליזציה lncRNA בפועל אינו משתקף ישירות על ידי החלק היחסי של lncRNA בציטופלסמה ובגרעין. RNA FISH יכול לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים באמצעות תכנון רצפי שרשרת אנטיסנס ספציפיים ל-lncRNA ולאחר מכן תיוג בצבעים פלואורסצנטיים10. שיטות RNA FISH שופרו עם התקדמות בטכניקות בדיקה ושיטות זיהוי, כולל ערכות בדיקה מרובות אוליגו11 המסומנות בפלואורופור, בדיקות LNA 12 ובדיקות DNA מסועף (bDNA)13. RNA FISH יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או צבעוני immunofluorescence14.

בעבודה זו, כללנו את פרוטוקול זיהוי הלוקליזציה התוך-תאי המפורט של lncRNA גן מארח גרעין קטן RNA 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה (143B) על ידי RNA FISH כדוגמה. SNHG6 הוא lncRNA נוקלאוטיד 600-730 בצורתו השחבור הבוגר ומזוהה כאונקוגן חדשני במגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל סרטן המעי הגס, סרטן קיבה, קרצינומה של תאים צלולים בשחלות, אוסטאוסרקומה וקרצינומה הפטוצלולרית15,16,17,18. מחקרים אישרו את מעורבותו של SNHG6 בהתנהגויות ביולוגיות של תאים סרטניים, כגון התפשטות, EMT ואוטופגיה, והראו לוקליזציה ציטופלזמית של SNHG6 שם הוא עשוי להשפיע על גני המטרה על ידי קשירה (ספוג) של miRNA15,16,17. פרוטוקול זיהוי מפורט זה של לוקליזציה תוך-תאית SNHG6 על ידי RNA FISH מוצג כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. איור 1 מראה את הפרוטוקול הכולל של דגי RNA; טבלה 1 מכילה את ההרכב של כל הפתרונות וטבלה 2 מכילה את רצפי הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת בדיקה

  1. זהה ורכוש את רצף FASTA של lncRNA יעד של עניין, למשל, מ GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). בעקבות האינדיקציות באתר, עצבו את הגשושיות ISH באינטרנט19, ועיינו בהצעות של אלגוריתם העיצוב לרשום את הגשושיות שיש להזמין עם תווית Cy3.
  2. יש לדגור על מאגר ההכלאה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים מראש.
  3. יש להמיס 4 בדיקות בצפיפות אופטית (OD) ב-160 מיקרוליטר של דיאתילפירוקרבונט (DEPC) המטופל ב-ddH2O בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל הרחק מהאור.
    הערה: צפיפות אופטית (OD) מייצגת את יחידת המידה של DNA ו-RNA. בדרך כלל, 1 יחידת OD = 33 מיקרוגרם / מ"ל DNA.
  4. הכינו 200 μL של תערובת הבדיקה עבור כל באר (1.2 μL-10 μL של בדיקה, 70 μL של חיץ הכלאה, להשלים את הנפח עם ddH2O עד 200 μL מטופל DEPC), ולהגדיר סדרה של 50 מיקרוגרם / מ"ל, 25 מיקרוגרם / מ"ל, 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ו 6 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: ריכוז הגשושית צריך להיחקר באופן ניסיוני מראש. ריכוז בדיקה גבוה יוביל לקשירה לא ספציפית של lncRNAs, בעוד שריכוז בדיקה נמוך יוביל לזיהוי לא רגיש או כושל של lncRNAs.
  5. נטרל את תערובת הבדיקה ב 73 ° C במשך 5 דקות.
    הערה: אם בדיקת הדנ"א המסומנת ב-Cy3 היא דו-גדילית, יש לפרק את הגשושית לדנ"א חד-גדילי בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות, ואז לקרר במהירות למשך 2 דקות על קרח.

2. הכנת תאים

  1. זרעו 50,000 תאי 143B לבאר על כיסויי זכוכית סטריליים בצלחת תרבית תאים של 12 בארות ודגרו עליהם במשך 24 שעות (37°C, 5% CO2) ב-DMEM.
    הערה: מספר התאים הספציפי שנזרע כאן משתנה בהתאם לגודל התא, המתאים לתאי הזרע להגיע למפגש של 50% לאחר הדגירה במשך 24 שעות. כיסויי הזכוכית הסטריליים עגולים כדי להתאים לצלחת 12 בארות.
  2. הסר את המדיום ושטוף במשך 2 x 5 דקות עם 1x מי מלח חוצצים פוספט (PBS).
    הערה: הכן PBS 1x עם ddH2O. PBS ללא טיפול DEPC לא ניתן להשתמש מכיוון שהוא מכיל RNase. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים נטולי RNase.
  3. הסר PBS 1x והוסף 200 μL של 100% אתנול בכל באר כדי לתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוציאים את האתנול, מוסיפים 200 μL של 0.1% Triton X-100 (ב-1x PBS) בכל באר, ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הזמן צריך להיות נשלט בקפידה עם חדירות Triton X-100 ולא יכול להיות ארוך מדי.
  5. יש להסיר 0.1% Triton X-100 ולשטוף 2 x 5 דקות עם 1x PBS.
    הערה: אם יש להשהות את הפרוטוקול כאן, החלף את PBS באתנול 70% (דילול של 100% אתנול עם ddH2O נטול RNase) ואחסן את הדגימה ב- 4 ° C למשך עד 3 חודשים.
  6. הסר 1x PBS, הוסף 200 μL של 2x סודיום ציטראט מלח (SSC) חיץ (דילול של 20x SSC עם ddH2O ללא RNase) לתוך כל באר, ודגרה במשך 30 דקות ב 37 ° C.
  7. יש להסיר 2x SSC buffer, להוסיף 200 μL של 70% אתנול לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. יש להשליך את 70% האתנול, להוסיף 200 μL של 85% אתנול (דילול של 100% אתנול עם ddH2O נטול RNase) לתוך כל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. יש להשליך את 85% האתנול, להוסיף 200 μL של 100% אתנול לכל באר, ולדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. לספוג ולהשליך 100% אתנול; תנו לבארות להתייבש.

3. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)

  1. הוסיפו 200 מיקרוליטר של תערובת בדיקה (מפורקת כמו בשלב 1.5) לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה (16-18 שעות).
    הערה: קיים מתאם חיובי חזק בין טמפרטורת ההכלאה לבין ריכוז הבדיקה; לכן, כדי לייעל את הרקע, יש להפחית הן את טמפרטורת ההכלאה והן את ריכוז הבדיקה.
  2. למחרת, להוציא דגימות מ 37 מעלות צלזיוס ולהשליך את תערובת הבדיקה. יש להוסיף 200 μL של 0.4x SSC/0.3% Tween-20 buffer לכל באר (שחומם מראש ב-65°C) ולשטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את מאגר 0.4x SSC/0.3% Tween-20, הוסף 200 μL של חיץ 2x SSC/0.1% Tween-20 לכל באר ושטוף במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. יש להסיר 2x SSC/0.1% Tween-20 buffer, להוסיף 200 μL של תמיסת צביעה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם/מ"ל), ולהכתים למשך 20 דקות הרחק מאור.
  5. יש להשליך את תמיסת הצבע DAPI ולשטוף עם PBS אחד למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף 50 μL של אמצעי הרכבה המכיל מסטיק על המגלשה והנח את מכסה הזכוכית על המגלשה כדי לתקן.
    הערה: הקפד למקם את תלוש הכיסוי על השקופית כשצד התא כלפי מטה.
  7. התבוננו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקלי לייזר; האחרון מייצר רגישות גבוהה יותר הדמיה בהירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוצגות תמונות מייצגות של דגי SNHG6 בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (איור 2). השליטה השלילית מטופלת עם בדיקת Ctrl שלילית; בקרה חיובית מטופלת עם U6 probe 20. בדיקת SNHG6 וגשושית U6 מסומנות ב- Cy3, הפולט פלואורסצנטיות אדומה. DAPI הוא צבע שמכתים את הדנ"א, אשר פולט פלואורסצנטיות כחולה. תוצאה זו מראה כי SNHG6 הוא מקומי בעיקר בציטופלסמה, ומידע זה יכול לספק כיוון חשוב למחקר נוסף של SNHG6.

אם משתמשים בריכוז גבוה מאוד של בדיקה, ניתן לראות צבע רקע תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. איור 3 מראה את התמונות המייצגות כאשר משתמשים בריכוז גבוה של בדיקת SNHG6 בדגי RNA. החצים הלבנים מייצגים צביעה לא ספציפית.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול RNA FISH עבור lncRNA. תרשים זה מציג את פרוטוקול המפתח של תהליך ניסוי RNA FISH. קיצורים: FISH = הכלאה פלואורסצנטית באתר ; lncRNA = RNA ארוך שאינו מקודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לוקליזציה של LncRNA (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B). שליטה שלילית מטופלת עם בדיקת שליטה שלילית. בקרה חיובית מטופלת באמצעות בדיקת U6. בדיקות SNHG6 ו-U6 מסומנות ב-Cy3, הפולט פלואורסצנטיות אדומה. DAPI הוא צבע שמכתים את הדנ"א ופולט פלואורסצנטיות כחולה. אדום וכחול מתמזגים ליצירת ורוד. התמונות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: LncRNA = RNA ארוך שאינו מקודד; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התמונות המייצגות של ריכוז גבוה של בדיקת SNHG6 בדגי RNA.בדיקות SNHG6 מסומנות ב- Cy3, הפולט פלואורסצנטיות אדומה. DAPI הוא צבע שמכתים את הדנ"א ופולט פלואורסצנטיות כחולה. אדום וכחול מתמזגים ליצירת ורוד. התמונות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הרכב התמיסות ששימשו בניסוי ההכלאה של RNA FISH. כל הדילולים צריכים להיעשות עם מים סטריליים, ללא RNase. כל המים המוספים מטופלים ב-DEPC ddH2O. קיצורים: FISH = הכלאה פלואורסצנטית באתר ; DEPC = דיאתילפירוקרבונט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: כל רצפי הגשושיות ששימשו בניסוי זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול RNA FISH זה יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים, אלא גם לזהות את הקולוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים בתאים, אשר יכול לשמש גם כדי לזהות את המיקום של lncRNA ברקמות משובצות פרפין. עם זאת, הפרוטוקול הספציפי במקרים כאלה שונה מכיוון שהרקמות המשובצות בפרפין צריכות להיות בשעווה21. הליך ניסיוני זה יכול להיות מיושם בצלחות של 48 או 96 בארות, אך צלחות 384 בארות קטנות מכדי שניתן יהיה להשתמש בהן כאן.

יש לציין מספר שלבים קריטיים של שיטה זו, כולל הסביבה נטולת RNase, ריכוז הבדיקה, טמפרטורת הכלאה והגדרת בקרות שליליות וחיוביות. ראשית, המצב נטול ה-RNase הוא קריטי מכיוון שה-RNase מפרק את הקשרים בין נוקלאוטידים ומוביל לפירוק של lncRNA באופן כללי. שנית, ריכוז הבדיקה המומלץ בדרך כלל נע בין 5 ל -50 מיקרוגרם / מ"ל. ריכוז בדיקה גבוה יוביל לקשירה לא ספציפית של lncRNAs, בעוד שריכוז בדיקה נמוך יוביל לזיהוי לא רגיש או כושל של lncRNA19. אם משתמשים בריכוז גבוה מאוד של גשושית, ניתן לראות צבע רקע תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי גם בנוכחות בדיקה מקושקשת (בקרה שלילית) בלבד; לכן, אותם ריכוזים של בקרות שליליות משמשים בדרך כלל כדי להגדיר את קו הבסיס (זהה לבקרה הפנימית) במהלך הניסויים המקדימים הבוחנים את ריכוז הגשושית המתאים כדי למנוע קישור לא ספציפי. ריכוז הגשושית הגבוה ביותר ללא צבע רקע בקבוצת הביקורת השלילית, המציג את האיתות החזק ביותר ללא קשירה לא ספציפית, שימש בניסויים הבאים. שלישית, מומלץ לתכנן לפחות שתיים או שלוש בדיקות לאופטימיזציה עם lncRNA ספציפי. במקביל, ניתן גם לערבב שתי בדיקות או יותר כדי לשפר את רגישות הזיהוי של lncRNA מטרה. רביעית, טמפרטורת ההכלאה הרגילה של בדיקת lncRNA היא 37 מעלות צלזיוס. בתהליך ההכלאה יש לשמור על טמפרטורת הכלאה קבועה ואחידה. טווח טמפרטורת ההכלאה בין בדיקות שונות הוא 34 עד 38 מעלות צלזיוס. טמפרטורת ההכלאה נמצאת בקורלציה חיובית חזקה עם ריכוז הבדיקה; לכן, כדי לייעל את הרקע, ריכוז הבדיקה צריך להיות מופחת. לבסוף, זה גם קריטי להגדיר בקרות שליליות וחיוביות. הקבוצה ללא בדיקה משמשת כבקרה שלילית לקבלת אותות רקע. בדיקת U6 או בדיקת RNA ריבוזומלית משמשת כבקרה חיובית כדי לשלול את האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות.

לגישה זו מספר יתרונות. ניתן לשנות את הצבע הפלואורסצנטי של בדיקות lncRNA. פלואורסצנטיות ירוקה נפלטת על-ידי פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC), פלואורסצאין (FAM) ואלכסה פלואור 488, בעוד פלואורסצנטיות אדומה נפלטת על-ידי Cy3 ו-Alexa Fluor 555. FITC משמש עבור ירוק טיפוסי ו- Cy3 עבור אדום טיפוסי. בנוסף, ניתן לקבל את התמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר. התמונות של האחרון רגישות וברורות יותר מאלה שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

המגבלה של שיטת RNA FISH היא שמדובר בשיטה איכותית; לכן, התוצאות אינן ניתנות לכימות. בשל השינוי בזמן ההכלאה והשפעת גורמים סובייקטיביים במהלך תצפית במיקרוסקופ פלואורסצנטי, לא ניתן לכמת במדויק את ביטוי lncRNA בתאים. רמות הביטוי של lncRNA בשברים תאיים שונים ניתנות להערכה איכותית בלבד. עם זאת, עם שיפור הטכניקה, פותחה שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של מולקולה בודדת (smFISH)22 לכימות רמת ביטוי הרנ"א; ייתכן שידווח על זיהוי smFISH נוסף בעתיד.

לטכניקת RNA FISH מגוון רחב של יישומים. זיהוי לוקליזציה תוך-תאי של lncRNA יועיל לחקר המנגנונים הביולוגיים של lncRNAs. במקביל, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות לוקליזציה של RNA אחרים שאינם מקודדים בתאים, כולל circRNAs, miRNAs, ו tRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ (1) תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2020YFE0201600); (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408); (3) מרכז שנגחאי לחדשנות שיתופית של טרנספורמציה תעשייתית של הכנת TCM בבית חולים; (4) פרויקטים מחקריים במסגרת תקציב אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047).

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
  3. Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
  4. Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
  5. Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
  6. Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
  7. Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
  8. Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
  9. Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
  10. Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
  11. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
  12. Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
  13. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  14. Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
  15. Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
  16. Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
  17. Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
  18. Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
  19. Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
  20. Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
  21. Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
  22. Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).

Tags

RNA פלואורסצנטי באתרו RNA ארוך שאינו מקודד סרטן התפשטות מעבר אפיתל-מזנכימלי הגירה חדירה אוטופגיה לוקליזציה תאית צבעים פלואורסצנטיים טכניקות RNA FISH מיקרוסקופיה LncRNA מבוטא גרוע לוקליזציה אימונופלואורסנציה בצבע כפול אימונופלואורסנציה מרובת צבעים הליך פעולה ניסיוני אמצעי זהירות
RNA פלואורסצנטי <em>באתרו</em> הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou,… More

Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter