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Cancer Research

मानव ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं में लंबे समय तक गैर-कोडिंग आरएनए स्थानीयकरण के लिए सीटू संकरण में आरएनए प्रतिदीप्ति

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65545
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं में lncRNAs स्थानीयकरण करने के लिए स्वस्थानी संकरण में शाही सेना प्रतिदीप्ति की एक विधि का वर्णन करता है.

Abstract

कैंसर में लंबे समय तक गैर-कोडिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) की महत्वपूर्ण भूमिकाओं का अध्ययन किया गया है, जैसे कि प्रसार, उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी), प्रवासन, घुसपैठ और कैंसर कोशिकाओं के ऑटोफैगी को विनियमित करना। कोशिकाओं में lncRNAs का स्थानीयकरण पता लगाने उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग के बाद lncRNA-विशिष्ट एंटीसेंस चेन अनुक्रम को डिजाइन करके, स्वस्थानी संकरण (FISH) में RNA प्रतिदीप्ति को lncRNAs के सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है। माइक्रोस्कोपी के विकास के साथ-साथ, आरएनए फिश तकनीक अब खराब व्यक्त एलएनसीआरएनए के दृश्य के लिए भी अनुमति देती है। यह विधि न केवल अकेले lncRNAs के स्थानीयकरण का पता लगा सकती है, बल्कि डबल-रंग या बहुरंगी इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके अन्य RNAs, डीएनए या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकती है। यहां, हमने एक उदाहरण के रूप में मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (143B) में lncRNA छोटे न्यूक्लियोलर RNA होस्ट जीन 6 (SNHG6) का उपयोग करके RNA FISH की विस्तृत प्रयोगात्मक संचालन प्रक्रिया और सावधानियों को शामिल किया है, ताकि उन शोधकर्ताओं के लिए एक संदर्भ प्रदान किया जा सके जो RNA FISH प्रयोग करना चाहते हैं, विशेष रूप से lncRNA FISH।

Introduction

पूरे जीनोम प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति से मानव जीनोम की हमारी समझ का बहुत विस्तार हुआ है। मानव जीनोम के लगभग 93% को आरएनए में स्थानांतरित किया जा सकता है, लेकिन आरएनए के केवल 2% का प्रोटीन में अनुवाद किया जा सकता है; शेष 98% आरएनए जिनके पास कोई प्रोटीन अनुवाद कार्य नहीं है, उन्हें गैर-कोडिंग आरएनए (एनसीआरएनए)1 कहा जाता है। नॉनकोडिंग आरएनए (एनसीआरएनए) के एक वर्ग के रूप में, 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड्स2 युक्त लंबे एनसीआरएनए (एलएनसीआरएनए) ने कोशिकाओं की कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी के कारण बढ़ते ध्यान को आकर्षित किया है, जैसे भेदभाव, चक्र नियंत्रण, एपोप्टोसिस, प्रवास, और आक्रमण 3,4,5. LncRNAs क्रोमैटिन संरचना और परमाणु जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने, mRNA splicing प्रक्रिया को नियंत्रित करने, और पोस्टट्रांसक्रिप्शनल संशोधन6 के रूप में विभिन्न तंत्रों के माध्यम से अपनी भूमिका निभाते हैं। LncRNAs ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्टट्रांसक्रिप्शनल दोनों स्तरों पर दुर्दमताओं की घटना, विकास और मेटास्टेसिस को नियंत्रित करते हैं। क्रोमोसोमल संरचनाओं के लिए बाध्यकारी के माध्यम से आरएनए प्रतिलेखन को प्रभावित करके नाभिक में ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एहसास होता है, जबकि अंतर्जात प्रतिस्पर्धी आरएनए (सीईआरएनए) तंत्र 5,7,8 के माध्यम से लक्ष्य जीन को नियंत्रित करके साइटोप्लाज्म में पोस्टट्रांसक्रिप्शनल विनियमन का एहसास होता है। CeRNA शाही सेना बातचीत के एक नए तंत्र का पता चला है, अर्थात् lncRNAs adsorb miRNAs के लिए एक स्पंज के रूप में कार्य और संबंधित लक्ष्य जीन9 के miRNA मध्यस्थता गिरावट को रोकने. इसलिए, एलएनसीआरएनए के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के बारे में जानकारी, चाहे एक विशिष्ट एलएनसीआरएनए साइटोप्लाज्म या नाभिक में स्थित हो, उनके जैविक कार्यों की पहचान करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है।

वर्तमान में, lncRNA स्थानीयकरण मुख्य रूप से दो तरीकों से पता लगाया जाता है, एक नाभिक/साइटोप्लाज्म अंश अलगाव परख द्वारा है, और दूसरा आरएनए फिश द्वारा है। पूर्व में, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु अंशों में आरएनए क्रमशः निकाले जाते हैं, और फिर साइटोप्लाज्म और नाभिक में एलएनसीआरएनए के अनुपात का पता लगाने के लिए विशिष्ट एलएनसीआरएनए प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रवर्धन किया जाता है। इस पद्धति का लाभ समय दक्षता है, जबकि नुकसान यह है कि वास्तविक lncRNA स्थानीयकरण साइटोप्लाज्म और नाभिक में lncRNAs के सापेक्ष अनुपात से सीधे परिलक्षित नहीं होता है। आरएनए फिश फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग के बाद एलएनसीआरएनए-विशिष्ट एंटीसेंस चेन अनुक्रमों के डिजाइन के माध्यम से कोशिकाओं में एलएनसीआरएनए स्थानीयकरण का पता लगा सकताहै। आरएनए मछली विधियों फ्लोरोफोरे लेबल एकाधिक ओलिगो जांच सेट11, एलएनए जांच 12, और branched डीएनए (बीडीएनए) जांच13 सहित जांच तकनीकों और पता लगाने के तरीकों में प्रगति के साथ सुधार किया गया है. आरएनए फिश न केवल एलएनसीआरएनए के स्थानीयकरण का पता लगा सकता है, बल्कि डबल-रंग या बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस14का उपयोग करके अन्य आरएनए, डीएनए, या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकता है।

इस काम में, हमने एक उदाहरण के रूप में आरएनए फिश द्वारा ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (143बी) में एलएनसीआरएनए छोटे न्यूक्लियोलर आरएनए होस्ट जीन 6 (एसएनएचजी 6) के विस्तृत इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण डिटेक्शन प्रोटोकॉल को शामिल किया है। SNHG6 अपने परिपक्व स्प्लिस्ड रूप में एक 600-730 न्यूक्लियोटाइड lncRNA है और कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा, ओस्टियोसारकोमा और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा15,16,17,18 सहित विभिन्न मानव कैंसर में एक उपन्यास ऑन्कोजीन के रूप में पहचाना जाता है। अध्ययनों ने कैंसर कोशिकाओं के जैविक व्यवहार, जैसे प्रसार, EMT, और ऑटोफैगी में SNHG6 की भागीदारी की पुष्टि की है, और SNHG6 के साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण को दिखाया है जहां यह miRNAs15,16,17 को बाध्यकारी (स्पॉन्जिंग) द्वारा लक्ष्य जीन को प्रभावित कर सकता है। आरएनए फिश द्वारा SNHG6 इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण का यह विस्तृत पता लगाने वाला प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। चित्रा 1 आरएनए मछली के लिए समग्र प्रोटोकॉल दिखाता है; तालिका 1 में सभी समाधानों की संरचना शामिल है और तालिका 2 में इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर अनुक्रम शामिल हैं।

1. जांच की तैयारी

  1. ब्याज के लक्ष्य lncRNA के FASTA अनुक्रम को पहचानें और प्राप्त करें, उदाहरण के लिए, GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) से। वेबसाइट पर संकेतों के बाद, ISH जांच ऑनलाइन19 डिज़ाइन करें, और Cy3 लेबल के साथ ऑर्डर की जाने वाली जांच को सूचीबद्ध करने के लिए डिज़ाइन एल्गोरिथ्म के सुझावों की समीक्षा करें।
  2. अग्रिम में 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संकरण बफर सेते हैं.
  3. प्रकाश से दूर 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) -उपचारित डीडीएच2ओ के 160 माइक्रोन में 4 ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) जांच को भंग करें।
    नोट: ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) डीएनए और आरएनए की माप इकाई का प्रतिनिधित्व करता है। आमतौर पर, 1 आयुध डिपो इकाई = 33 माइक्रोग्राम/एमएल डीएनए।
  4. प्रत्येक कुएं के लिए जांच मिश्रण के 200 माइक्रोन तैयार करें (जांच के 1.2 माइक्रोन -10 माइक्रोन, संकरण बफर के 70 माइक्रोन, डीईपीसी-उपचारित डीडीएच2ओ से 200 माइक्रोन के साथ मात्रा बनाएं), और 50 माइक्रोग्राम / एमएल, 25 माइक्रोग्राम / एमएल, 12.5 माइक्रोग्राम / एमएल, और 6 माइक्रोग्राम / एमएल की एक श्रृंखला स्थापित करें।
    नोट: जांच एकाग्रता अग्रिम में प्रयोगात्मक पता लगाया जाना चाहिए. एक उच्च जांच एकाग्रता lncRNAs के गैर विशिष्ट बंधन के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि एक कम जांच एकाग्रता lncRNAs के असंवेदनशील या असफल पता लगाने के लिए नेतृत्व करेंगे.
  5. 5 मिनट के लिए 73 डिग्री सेल्सियस पर जांच मिश्रण को अस्वीकार करें।
    नोट: Cy3 लेबल डीएनए जांच डबल फंसे है, तो 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एकल असहाय डीएनए के लिए जांच denatured, तो जल्दी से बर्फ पर 2 मिनट के लिए शांत.

2. सेल की तैयारी

  1. बीज 50,000 143B एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में बाँझ गिलास coverslips पर अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं और DMEM में 24 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) के लिए उन्हें सेते हैं.
    नोट: यहां वरीयता प्राप्त विशिष्ट सेल नंबर सेल आकार के साथ बदलता रहता है, जो वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के लिए 24 घंटे के लिए ऊष्मायन होने के बाद 50% के संगम तक पहुंचने के लिए उपयुक्त है। बाँझ ग्लास coverslips 12 अच्छी तरह से थाली के लिए उपयुक्त होने के लिए दौर कर रहे हैं.
  2. मध्यम निकालें और 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ 2 x 5 मिनट के लिए धो लें।
    नोट: डीईपीसी-उपचारित डीडीएच2ओ पीबीएस के साथ 1x पीबीएस तैयार करें डीईपीसी-उपचार के बिना पीबीएस का उपयोग नहीं किया जा सकता क्योंकि इसमें आरएनएएसई शामिल है। RNase मुक्त स्थितियों में निम्न सभी चरणों का पालन करें।
  3. 1x पीबीएस निकालें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए तय करने के लिए प्रत्येक कुएं में 100% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें।
  4. इथेनॉल निकालें, प्रत्येक अच्छी तरह से 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (1x पीबीएस में) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्राइटन X-100 पारगम्यता के साथ समय को सख्ती से नियंत्रित करने की आवश्यकता है और यह बहुत लंबा नहीं हो सकता।
  5. 0.1% ट्राइटन X-100 निकालें और 1x पीबीएस के साथ 2 x 5 मिनट धो लें।
    नोट: यदि प्रोटोकॉल को यहां रोकना है, तो पीबीएस को 70% इथेनॉल (आरएनएएसई-मुक्त डीडीएच2ओ के साथ 100% इथेनॉल का कमजोर पड़ना) के साथ बदलें और नमूना को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. 1x पीबीएस निकालें, प्रत्येक कुएं में 2x सोडियम खारा साइट्रेट (एसएससी) बफर (आरएनएएसई-मुक्त डीडीएच2ओ के साथ 20x एसएससी का कमजोर पड़ना) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 2x एसएससी बफर निकालें, प्रत्येक अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. 70% इथेनॉल त्यागें, प्रत्येक कुएं में 85% इथेनॉल (आरएनएएसई-मुक्त डीडीएच2ओ के साथ 100% इथेनॉल का कमजोर पड़ना) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 85% इथेनॉल त्यागें, प्रत्येक कुएं में 100% इथेनॉल के 200 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  10. अवशोषित और त्यागें 100% इथेनॉल; कुओं को सूखने दें।

3. स्वस्थानी संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से जांच मिश्रण (चरण 1.5 के रूप में denatured) के 200 माइक्रोन जोड़ें और रात भर (16-18 एच) 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: संकरण तापमान और जांच एकाग्रता के बीच एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध है; इसलिए, पृष्ठभूमि को अनुकूलित करने के लिए, संकरण तापमान और जांच एकाग्रता दोनों को कम किया जाना चाहिए।
  2. अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस से नमूने बाहर ले लो और जांच मिश्रण त्यागें. प्रत्येक अच्छी तरह से 0.4x एसएससी/0.3% ट्वीन-20 बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें (65 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीटेड) और कमरे के तापमान पर 2 मिन के लिए धो लें।
  3. 0.4x एसएससी / 0.3% ट्वीन -20 बफर निकालें, प्रत्येक अच्छी तरह से 2x एसएससी / 0.1% ट्वीन -20 बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए धो लें।
  4. 2x SSC/0.1% ट्वीन-20 बफर निकालें, 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (DAPI) धुंधला समाधान (1 μg/mL) के 200 माइक्रोन जोड़ें, और प्रकाश से 20 मिनट दूर दाग दें।
  5. DAPI डाई समाधान त्यागें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ धो लें।
  6. स्लाइड पर गम युक्त बढ़ते माध्यम के 50 माइक्रोन जोड़ें और ठीक करने के लिए स्लाइड पर ग्लास कवरस्लिप रखें।
    नोट: नीचे सेल पक्ष के साथ स्लाइड पर coverslip जगह करने के लिए सुनिश्चित करें.
  7. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
    नोट: एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें; उत्तरार्द्ध एक उच्च संवेदनशीलता और स्पष्टता इमेजिंग पैदा करता है।

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Representative Results

मानव ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं में SNHG6 मछली की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है(चित्र 2)। नकारात्मक नियंत्रण को नकारात्मक Ctrl जांच के साथ व्यवहार किया जाता है; सकारात्मक नियंत्रण U6 जांच 20 के साथ इलाज किया जाता है. SNHG6 जांच और U6 जांच को Cy3 के साथ लेबल किया जाता है, जो लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। डीएपीआई एक डाई है जो डीएनए को दाग देती है, जो नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करती है। इस परिणाम से पता चलता है कि SNHG6 मुख्य रूप से साइटोप्लाज्म में स्थानीयकृत है, और यह जानकारी SNHG6 के आगे के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण दिशा प्रदान कर सकती है।

यदि जांच की एक बहुत ही उच्च एकाग्रता का उपयोग किया जाता है, तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एक पृष्ठभूमि रंग देखा जा सकता है। चित्रा 3 प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है जब SNHG6 जांच की एक उच्च एकाग्रता आरएनए मछली में प्रयोग किया जाता है. सफेद तीर निरर्थक धुंधला का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एलएनसीआरएनए के लिए आरएनए फिश प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट। यह चार्ट आरएनए फिश प्रयोग प्रक्रिया के प्रमुख प्रोटोकॉल को दर्शाता है। संक्षिप्ताक्षर: मछली = स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति; lncRNA = लंबी नॉनकोडिंग RNA। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (143 बी) में एलएनसीआरएनए (एसएनएचजी 6) का स्थानीयकरण। नकारात्मक नियंत्रण को नकारात्मक नियंत्रण जांच के साथ इलाज किया जाता है। सकारात्मक नियंत्रण का इलाज U6 जांच के साथ किया जाता है। SNHG6 और U6 जांच Cy3 के साथ लेबल कर रहे हैं, जो लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है. डीएपीआई एक डाई है जो डीएनए को दाग देती है और नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करती है। गुलाबी बनाने के लिए लाल और नीले रंग का विलय होता है। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया जाता है. स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: LncRNA = लंबी गैर-कोडिंग RNA; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आरएनए मछली में एसएनएचजी 6 जांच की उच्च एकाग्रता की प्रतिनिधि छवियां। SNHG6 जांच Cy3 के साथ लेबल कर रहे हैं, जो लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है. डीएपीआई एक डाई है जो डीएनए को दाग देती है और नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करती है। गुलाबी बनाने के लिए लाल और नीले रंग का विलय होता है। छवियों को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया जाता है. स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: आरएनए मछली संकरण प्रयोग में प्रयुक्त समाधानों की संरचना। सभी dilutions बाँझ, RNase मुक्त पानी के साथ किया जाना चाहिए. सभी जोड़ा पानी DEPC-उपचारित ddH2O. संक्षिप्ताक्षर है: मछली = स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति; DEPC = डायथाइलपाइरोकार्बोनेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी जांच अनुक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह आरएनए फिश प्रोटोकॉल न केवल कोशिकाओं में एलएनसीआरएनए के स्थानीयकरण का पता लगा सकता है, बल्कि कोशिकाओं में अन्य आरएनए, डीएनए या प्रोटीन के सहस्थानीयकरण का भी पता लगा सकता है, जिसका उपयोग पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों में एलएनसीआरएनए के स्थान का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, ऐसे मामलों में विशिष्ट प्रोटोकॉल अलग है क्योंकि पैराफिन एम्बेडेड ऊतकों21 dewaxed किया जा करने की जरूरत है. इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया 48- या 96 अच्छी तरह से प्लेटों में लागू किया जा सकता है, लेकिन 384 अच्छी तरह से प्लेटें भी यहाँ इस्तेमाल किया जा करने के लिए छोटे हैं.

इस विधि के कई महत्वपूर्ण कदम RNase मुक्त वातावरण, जांच एकाग्रता, संकरण तापमान, और नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण की स्थापना सहित ध्यान दिया जाना चाहिए. सबसे पहले, RNase-मुक्त स्थिति महत्वपूर्ण है क्योंकि RNase न्यूक्लियोटाइड के बीच के बंधन को तोड़ देता है और सामान्य रूप से lncRNAs के क्षरण की ओर जाता है। दूसरा, आमतौर पर अनुशंसित जांच एकाग्रता 5 से 50 माइक्रोग्राम / एमएल तक होती है। एक उच्च जांच एकाग्रता lncRNAs के गैर विशिष्ट बंधन के लिए नेतृत्व करेंगे, जबकि एक कम जांच एकाग्रता lncRNAs19 के असंवेदनशील या असफल पता लगाने के लिए नेतृत्व करेंगे. यदि जांच की एक बहुत ही उच्च एकाग्रता का उपयोग किया जाता है, तो केवल एक तले हुए जांच (एक नकारात्मक नियंत्रण) की उपस्थिति में भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत एक पृष्ठभूमि रंग देखा जा सकता है; इसलिए, नकारात्मक नियंत्रण के एक ही सांद्रता आमतौर पर किसी भी गैर विशिष्ट बाध्यकारी से बचने के लिए उपयुक्त जांच एकाग्रता की खोज प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान आधारभूत (आंतरिक नियंत्रण के रूप में ही) स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है. नकारात्मक नियंत्रण समूह में पृष्ठभूमि रंग के बिना उच्चतम जांच एकाग्रता, गैर विशिष्ट बाध्यकारी के बिना सबसे मजबूत संकेत पेश, निम्नलिखित प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था. तीसरा, एक विशिष्ट lncRNA के साथ अनुकूलन के लिए कम से कम दो या तीन जांच डिजाइन करने की सिफारिश की जाती है। इसी समय, लक्ष्य lncRNAs की पहचान संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए दो या दो से अधिक जांच को भी मिलाया जा सकता है। चौथा, lncRNA जांच का सामान्य संकरण तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है। संकरण प्रक्रिया के दौरान, संकरण तापमान को स्थिर और समान रखा जाना चाहिए। विभिन्न जांचों के बीच संकरण तापमान की सीमा 34 से 38 डिग्री सेल्सियस है। संकरण तापमान दृढ़ता से सकारात्मक जांच एकाग्रता के साथ सहसंबद्ध है; इसलिए, पृष्ठभूमि को अनुकूलित करने के लिए, जांच एकाग्रता को कम किया जाना चाहिए। अंत में, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण सेट करना भी महत्वपूर्ण है। जांच के बिना समूह पृष्ठभूमि संकेतों को प्राप्त करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. एक U6 जांच या एक राइबोसोमल आरएनए जांच का उपयोग झूठे सकारात्मक परिणामों की संभावना को खारिज करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है।

इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं। lncRNA जांच के प्रतिदीप्ति रंग बदला जा सकता है. ग्रीन प्रतिदीप्ति फ्लोरेसिन isothiocyanate (FITC), fluorescein (परिवार), और एलेक्सा फ्लोर 488 द्वारा उत्सर्जित है, जबकि लाल प्रतिदीप्ति Cy3 और एलेक्सा फ्लोर 555 द्वारा उत्सर्जित है. FITC का उपयोग विशिष्ट हरे रंग के लिए और Cy3 का उपयोग विशिष्ट लाल रंग के लिए किया जाता है। इसके अलावा, छवियों को या तो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक लेजर कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध की छवियां प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित लोगों की तुलना में अधिक संवेदनशील और स्पष्ट हैं।

आरएनए फिश विधि की सीमा यह है कि यह एक गुणात्मक विधि है; इसलिए, परिणाम मात्रात्मक नहीं हैं। संकरण समय में परिवर्तन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप अवलोकन के दौरान व्यक्तिपरक कारकों के प्रभाव के कारण, lncRNA अभिव्यक्ति को कोशिकाओं में सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है। विभिन्न सेलुलर अंशों में lncRNAs की अभिव्यक्ति के स्तर का केवल गुणात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि, तकनीक में सुधार के साथ, आरएनए अभिव्यक्ति स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वस्थानी संकरण (एसएमफिश) विधि22 में एक एकल अणु फ्लोरोसेंट विकसित किया गया है; भविष्य में अधिक smFISH का पता लगाने की सूचना दी जा सकती है।

आरएनए फिश तकनीक में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। lncRNAs के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण का पता लगाने से lncRNAs के जैविक तंत्र के अध्ययन में लाभ होगा। इसी समय, इस तकनीक का उपयोग कोशिकाओं में अन्य गैर-कोडिंग आरएनए के स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें circRNAs, miRNAs और tRNAs शामिल हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

यह काम (1) चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2020YFE0201600) से अनुदान द्वारा समर्थित है; (2) राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (81973877 और 82174408); (3) अस्पताल टीसीएम तैयारी के औद्योगिक परिवर्तन के शंघाई सहयोगी नवाचार केंद्र; (4) शंघाई यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (2021LK047) के बजट के भीतर अनुसंधान परियोजनाएं।

    

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Cell culture plate-12 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 3513,corning Place the coverslips in the plate
 Cell line (143B) Cell Bank of Chinese Academy of Sciences CRL-8303 osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
Coverslips Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd abs7026 The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe Shanghai GenePharma Co.,Ltd A10005 Detect SNHG6 location
DMEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Dry Bath Incubator Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. DKT200-2  Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%  Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd 10009218 dehydration
Fluorescence microscope Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus Observation and positioning
Incubator Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD DHP-9051 The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. E675004 Attach the coverslips to the slide
Shaker Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. TS-8S Washing sample
Slide Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 188105 The coverslips is placed on the slide
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600198 Permeable membrane and nuclear membrane
 Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Tween-20 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A600560 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
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Chang, J., Ma, X., Sun, X., Zhou, C., Zhao, P., Wang, Y., Yang, Y. RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells. J. Vis. Exp. (196), e65545, doi:10.3791/65545 (2023).

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