Summary
본 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하기 위한 RNA 형광 in situ 교잡의 방법을 기술한다.
Abstract
암세포의 증식, 상피-중간엽 전이(EMT), 이동, 침투 및 자가포식을 조절하는 것과 같은 암에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 중요한 역할이 연구되었습니다. 세포에서 lncRNA의 국소화 검출은 세포의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 형광 염료로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열을 설계함으로써 RNA 형광 in situ hybridization(FISH)을 적용하여 lncRNA의 세포 국소화를 검출할 수 있습니다. 현미경 검사법의 발달과 함께, RNA 물고기 기술은 지금 잘 표현되지 않는 lncRNAs의 구상 조차 허용합니다. 이 방법은 lncRNA의 국소화를 단독으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다. 여기에서는 인간 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6)을 예로 들어 RNA FISH의 상세한 실험 조작 절차 및 주의사항을 포함하여, RNA FISH 실험, 특히 lncRNA FISH를 수행하고자 하는 연구자들에게 참고자료를 제공하였다.
Introduction
인간 게놈에 대한 우리의 이해는 최근 전체 게놈 기술의 발전으로 크게 확장되었습니다. 인간 게놈의 약 93%는 RNA로 전사될 수 있지만 RNA의 2%만 단백질로 번역될 수 있습니다. 단백질 번역 기능이 없는 나머지 98%의 RNA를 non-coding RNA(ncRNA)라고 합니다1. 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 긴 ncRNA(noncoding RNA(ncRNA)의 한 종류인 긴 ncRNA(lncRNA)는 분화, 주기 조절, 세포자멸사, 이동 및 침습과 같은 세포의 많은 생리학적 및 병리학적 과정에 관여하기 때문에 점점 더 주목을 받고 있습니다 3,4,5. LncRNA는 염색질 구조 및 핵 유전자 발현 조절, mRNA 접합 과정 제어, 전사 후 변형 등 다양한 메커니즘을 통해 역할을 수행합니다6. LncRNA는 전사 및 전사 후 수준 모두에서 악성 종양의 발생, 발달 및 전이를 조절합니다. 전사 조절은 염색체 구조에 대한 결합을 통해 RNA 전사에 영향을 미침으로써 핵에서 실현되는 반면, 전사 후 조절은 내인성 경쟁 RNA(ceRNA) 메커니즘을 통해 표적 유전자를 제어하여 세포질에서 실현됩니다 5,7,8. CeRNA는 RNA 상호 작용의 새로운 메커니즘, 즉 lncRNA가 miRNA를 흡착하고 관련 표적 유전자의 miRNA 매개 분해를 억제하는 스폰지 역할을 할 수 있음을 밝혔습니다9. 그러므로, lncRNAs의 subcellular 국소화에 관하여 정보는, 특정한 lncRNA가 세포질 또는 핵에서 있다는 것을, 그들의 생물학 기능을 확인하는 것을 돕도록 중요합니다.
현재 lncRNA 국소화는 주로 두 가지 방법으로 검출되는데, 하나는 핵/세포질 분획 분리 분석에 의한 것이고 다른 하나는 RNA FISH에 의한 것입니다. 전자에서는 세포질 및 핵 분획의 RNA를 각각 추출한 다음 특정 lncRNA 프라이머로 PCR 증폭을 수행하여 세포질과 핵에서 lncRNA의 비율을 검출합니다. 이 방법의 장점은 시간 효율성인 반면, 단점은 실제 lncRNA 국소화가 세포질과 핵에서 lncRNA의 상대적 비율에 의해 직접 반영되지 않는다는 것입니다. RNA FISH는 형광 염료10으로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열의 설계를 통해 세포에서 lncRNA 국소화를 검출할 수 있습니다. RNA FISH 분석법은 형광단 표지된 다중 올리고 프로브 세트(11), LNA 프로브(12) 및 분지형 DNA(bDNA) 프로브(13)를 포함한 프로브 기술 및 검출 방법의 발전으로 개선되었습니다. RNA FISH는 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다14.
이 연구에서는 RNA FISH에 의한 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6(SNHG6)의 상세한 세포 내 국소화 검출 프로토콜을 예로 포함했습니다. SNHG6는 성숙한 접합 형태의 600-730 뉴클레오티드 lncRNA이며 대장암, 위암, 난소 투명 세포 암종, 골육종 및 간세포 암종을 포함한 다양한 인간 암에서 새로운 종양 유전자로 확인되었습니다15,16,17,18. 연구에 따르면 SNHG6는 증식, EMT 및 자가포식과 같은 암세포의 생물학적 행동에 관여하는 것으로 확인되었으며, miRNA15,16,17에 결합(스폰지)하여 표적 유전자에 영향을 미칠 수 있는 SNHG6의 세포질 국소화를 보여주었습니다. RNA FISH에 의한 SNHG6 세포내 국소화의 상세한 검출 프로토콜이 본원에 제시되어 있다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 그림 1 은 RNA FISH에 대한 전체 프로토콜을 보여줍니다. 표 1 에는 모든 용액의 조성이 포함되어 있고 표 2 에는 이 프로토콜에 사용된 프라이머 서열이 포함되어 있습니다.
1. 프로브 준비
- 예를 들어 GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)에서 관심 표적 lncRNA의 FASTA 염기서열을 식별하고 획득합니다. 웹 사이트의 표시에 따라 온라인으로 ISH 프로브를 설계하고19 설계 알고리즘의 제안을 검토하여 Cy3 라벨로 주문할 프로브를 나열합니다.
- 혼성화 완충액을 37°C에서 2시간 전에 배양합니다.
- 4 광학 밀도(OD) 프로브를 160μL의 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리된 ddH2O에 1mg/mL 농도로 빛에서 멀리 떨어뜨립니다.
참고: 광학 밀도(OD)는 DNA와 RNA의 측정 단위를 나타냅니다. 일반적으로 1 OD 단위 = 33 μg/mL DNA. - 각 웰에 대해 200μL의 프로브 혼합물(프로브 1.2μL-10μL, 혼성화 완충액 70μL, DEPC 처리된 ddH 2O 내지 200μL로 부피 구성)을 준비하고, 50μg/mL, 25μg/mL, 12.5μg/mL 및 6μg/mL 시리즈를 설정합니다.
알림: 프로브 농도는 사전에 실험적으로 탐색해야 합니다. 높은 프로브 농도는 lncRNA의 비특이적 결합으로 이어지고, 낮은 프로브 농도는 lncRNA의 둔감하거나 검출 실패로 이어집니다. - 프로브 혼합물을 73°C에서 5분 동안 변성시킵니다.
참고: Cy3 표지 DNA 프로브가 이중 가닥인 경우 프로브를 95°C에서 5분 동안 단일 가닥 DNA로 변성시킨 다음 얼음에서 2분 동안 빠르게 냉각합니다.
2. 세포 준비
- 12웰 세포 배양 플레이트의 멸균 유리 커버슬립에 웰당 50,000개의 143B 세포를 파종하고 DMEM에서 24시간(37°C, 5% CO2) 동안 배양합니다.
참고: 여기에 파종된 특정 세포 수는 세포 크기에 따라 다르며, 이는 파종된 세포가 24시간 동안 배양된 후 50%의 합류점에 도달하는 데 적합합니다. 멸균 유리 커버슬립은 12웰 플레이트에 적합하도록 둥글게 되어 있습니다. - 배지를 제거하고 2x 인산염 완충 식염수(PBS)로 5 x 1분 동안 세척합니다.
참고: DEPC 처리된 ddH2O로 PBS 1개를 준비합니다. DEPC 처리가 없는 PBS는 RNase를 함유하고 있기 때문에 사용할 수 없습니다. RNase가 없는 조건에서 다음 단계를 모두 수행합니다. - 1x PBS를 제거하고 각 웰에 200μL의 100% 에탄올을 추가하여 실온에서 15분 동안 고정합니다.
- 에탄올을 제거하고 각 웰에 200μL의 0.1% Triton X-100(1x PBS 기준)을 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
참고: 시간은 Triton X-100 투과성으로 엄격하게 제어해야 하며 너무 길어서는 안 됩니다. - 0.1% Triton X-100을 제거하고 1x PBS로 2 x 5분 동안 세척합니다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지해야 하는 경우 PBS를 70% 에탄올로 교체하고(100% 에탄올을 RNase가 없는 ddH2O로 희석) 샘플을 4°C에서 최대 3개월 동안 보관합니다. - 1x PBS를 제거하고, 200μL의 2x 식염수 나트륨(SSC) 완충액(RNase가 없는 ddH 2O로20xSSC 희석)을 각 웰에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 2x SSC 버퍼를 제거하고 각 웰에 200μL의 70% 에탄올을 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 70% 에탄올을 버리고 200μL의 85% 에탄올(RNase가 없는 ddH2O로 100% 에탄올 희석)을 각 웰에 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 85% 에탄올을 버리고 각 웰에 200μL의 100% 에탄올을 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
- 100% 에탄올을 흡수하고 버리십시오. 우물을 말리십시오.
3. 형광 in situ hybridization (FISH)
- 200μL의 프로브 혼합물(1.5단계에서와 같이 변성됨)을 각 웰에 추가하고 37°C에서 밤새 배양합니다(16-18시간).
알림: 혼성화 온도와 프로브 농도 사이에는 강한 양의 상관 관계가 있습니다. 따라서 배경을 최적화하려면 혼성화 온도와 프로브 농도를 모두 줄여야 합니다. - 다음날 37 °C에서 샘플을 꺼내 프로브 혼합물을 폐기합니다. 각 웰에 0.4x SSC/0.3% Tween-20 완충액 200μL를 추가하고(65°C에서 예열) 실온에서 2분 동안 세척합니다.
- 0.4x SSC/0.3% Tween-20 완충액을 제거하고 각 웰에 2x SSC/0.1% Tween-20 완충액 200μL를 추가한 다음 실온에서 2분 동안 세척합니다.
- 2x SSC/0.1% 트윈-20 버퍼를 제거하고 200μL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 염색 용액(1μg/mL)을 추가하고 빛을 피해 20분 동안 염색합니다.
- DAPI 염료 용액을 버리고 실온에서 1x PBS로 2분 동안 세척합니다.
- 슬라이드에 껌이 들어 있는 장착 매체 50μL를 추가하고 유리 커버슬립을 슬라이드에 올려 고정합니다.
알림: 커버슬립은 셀 면이 아래로 향하게 하여 슬라이드에 놓아야 합니다. - 형광 현미경으로 관찰하십시오.
알림: 형광 현미경 또는 레이저 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 후자는 더 높은 감도와 선명도 이미징을 생성합니다.
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Representative Results
인간 골육종 세포에서 SNHG6 FISH의 대표적인 이미지가 표시됩니다(그림 2). 네거티브 컨트롤은 네거티브 Ctrl 프로브로 처리됩니다. 양성 대조군은 U6 프로브 20으로 처리됩니다. SNHG6 프로브와 U6 프로브는 적색 형광을 방출하는 Cy3로 표지되어 있습니다. DAPI는 청색 형광을 방출하는 DNA를 염색하는 염료입니다. 이 결과는 SNHG6가 주로 세포질에 국한되어 있음을 보여주며, 이 정보는 SNHG6의 추가 연구를 위한 중요한 방향을 제공할 수 있습니다.
매우 높은 농도의 프로브를 사용하면 형광 현미경에서 배경색을 볼 수 있습니다. 그림 3 은 RNA FISH에 고농도의 SNHG6 프로브를 사용했을 때의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 흰색 화살표는 비특이적 염색을 나타냅니다.
그림 1: lncRNA에 대한 RNA FISH 프로토콜의 흐름도. 이 차트는 RNA FISH 실험 프로세스의 주요 프로토콜을 보여줍니다. 약어: FISH = 형광 in situ hybridization; lncRNA = 긴 비암호화 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간 골육종 세포(143B)에서 LncRNA(SNHG6)의 국소화. 네거티브 컨트롤은 네거티브 컨트롤 프로브로 처리됩니다. 양성 대조군은 U6 프로브로 처리됩니다. SNHG6 및 U6 프로브는 적색 형광을 방출하는 Cy3로 라벨링됩니다. DAPI는 DNA를 염색하고 청색 형광을 방출하는 염료입니다. 빨간색과 파란색이 합쳐져 분홍색이 됩니다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영됩니다. 눈금 막대 = 10μm. 약어: LncRNA = 긴 비코딩 RNA; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RNA FISH에서 고농도의 SNHG6 프로브를 보여주는 대표적인 이미지. SNHG6 프로브는 적색 형광을 방출하는 Cy3로 표지되어 있습니다. DAPI는 DNA를 염색하고 청색 형광을 방출하는 염료입니다. 빨간색과 파란색이 합쳐져 분홍색이 됩니다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: RNA FISH 교잡 실험에 사용된 용액의 조성. 모든 희석은 RNase가 없는 멸균수로 수행해야 합니다. 첨가된 모든 물은 DEPC 처리된 ddH2O입니다. 약어: FISH = 형광 in situ hybridization; DEPC = 디에틸피로카보네이트. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 이 실험에 사용된 모든 프로브 시퀀스. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 RNA FISH 프로토콜은 세포에서 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 세포에서 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화를 검출할 수 있으며, 이는 파라핀 포매 조직에서 lncRNA의 위치를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 경우에서의 구체적인 프로토콜은 상이한데, 그 이유는 파라핀-포매 조직이 탈왁스될 필요가 있기 때문이다21. 이 실험 절차는 48웰 또는 96웰 플레이트에 적용할 수 있지만 384웰 플레이트는 너무 작아서 여기에 사용할 수 없습니다.
RNase가 없는 환경, 프로브 농도, 혼성화 온도, 음성 및 양성 대조군 설정을 포함하여 이 방법의 몇 가지 중요한 단계를 기록해야 합니다. 첫째, RNase가 뉴클레오티드 사이의 결합을 분해하고 일반적으로 lncRNA의 분해를 유도하기 때문에 RNase가 없는 상태가 중요합니다. 둘째, 일반적으로 권장되는 프로브 농도 범위는 5 - 50 μg/mL입니다. 프로브 농도가 높으면 lncRNA의 비특이적 결합이 발생하고, 프로브 농도가 낮으면 lncRNA의 검출이 둔감하거나 실패하게 된다19. 매우 높은 농도의 프로브를 사용하는 경우 스크램블된 프로브(음성 대조군)만 있는 경우에도 형광 현미경 아래에서 배경색을 볼 수 있습니다. 따라서 일반적으로 비특이적 결합을 피하기 위해 적절한 프로브 농도를 탐색하는 예비 실험 중에 기준선(내부 대조군과 동일)을 설정하는 데 동일한 농도의 음성 대조군이 사용됩니다. 비특이적 결합 없이 가장 강한 신호를 나타내는 음성 대조군에서 배경색이 없는 가장 높은 프로브 농도가 다음 실험에서 사용되었습니다. 셋째, 특정 lncRNA로 최적화를 위해 최소 2개 또는 3개의 프로브를 설계하는 것이 좋습니다. 동시에 두 개 이상의 프로브를 혼합하여 표적 lncRNA의 검출 감도를 향상시킬 수도 있습니다. 넷째, lncRNA 프로브의 정상 혼성화 온도는 37°C이다. 교잡 과정에서 교잡 온도는 일정하고 균일하게 유지되어야 합니다. 서로 다른 프로브 사이의 혼성화 온도 범위는 34 - 38 °C입니다. 혼성화 온도는 프로브 농도와 강한 양의 상관 관계가 있습니다. 따라서 배경을 최적화하려면 프로브 농도를 줄여야 합니다. 마지막으로, 네거티브 및 포지티브 컨트롤을 설정하는 것도 중요합니다. 프로브가 없는 그룹은 배경 신호를 얻기 위한 네거티브 컨트롤로 사용됩니다. U6 프로브 또는 리보솜 RNA 프로브는 위양성 결과의 가능성을 배제하기 위해 양성 대조군으로 사용됩니다.
이 접근 방식에는 몇 가지 장점이 있습니다. lncRNA 프로브의 형광 색상을 변경할 수 있습니다. 녹색 형광은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레세인(FAM) 및 Alexa Fluor 488에 의해 방출되는 반면, 적색 형광은 Cy3 및 Alexa Fluor 555에 의해 방출됩니다. FITC는 전형적인 녹색에 사용되고 Cy3는 전형적인 적색에 사용됩니다. 또한 형광 현미경 또는 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 얻을 수 있습니다. 후자의 이미지는 형광 현미경을 사용하여 얻은 이미지보다 더 민감하고 선명합니다.
RNA FISH 방법의 한계는 이것이 정성적 방법이라는 것입니다. 따라서 결과를 정량화할 수 없습니다. 혼성화 시간의 변화와 형광 현미경 관찰 중 주관적 요인의 영향으로 인해 세포에서 lncRNA 발현을 정확하게 정량화할 수 없습니다. 다른 세포 분획에서 lncRNA의 발현 수준은 정성적으로만 평가할 수 있습니다. 그러나, 기술의 개선과 함께, RNA 발현 수준을 정량화하기 위해 단일 분자 형광 in situ hybridization (smFISH) 방법22 가 개발되었다; 앞으로 더 많은 smFISH 검출이 보고될 수 있습니다.
RNA FISH 기법은 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. lncRNAs의 세포내 지방화 탐지는 lncRNAs의 생물학 기계장치의 학문을 도울 것입니다. 동시에 이 기술은 circRNA, miRNA 및 tRNA를 포함하여 세포에서 다른 non-coding RNA의 국소화를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 (1) 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600)의 보조금으로 지원됩니다. (2) 국립자연과학재단(National Nature Science Foundation, 81973877 및 82174408) (3) 병원 TCM 준비의 산업 전환의 상하이 협력 혁신 센터; (4) Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 예산 내 연구 프로젝트(2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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