Summary
В настоящем протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации РНК in situ для локализации днкРНК в клетках остеосаркомы человека.
Abstract
Изучена важная роль длинных некодирующих РНК (днкРНК) в раке, такая как регуляция пролиферации, эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), миграция, инфильтрация и аутофагия раковых клеток. Локализация днкРНК в клетках может дать представление об их функциях. Путем разработки последовательности антисмысловой цепи, специфичной для днкРНК, с последующим мечением флуоресцентными красителями, флуоресцентная гибридизация РНК in situ (FISH) может быть применена для обнаружения клеточной локализации днкРНК. Вместе с развитием микроскопии методы RNA FISH теперь позволяют визуализировать даже плохо экспрессируемые днкРНК. Этот метод позволяет не только обнаружить локализацию только днкРНК, но и обнаружить колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции. Здесь мы включили подробную процедуру экспериментальной эксплуатации и меры предосторожности RNA FISH на примере lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) в клетках остеосаркомы человека (143B), чтобы обеспечить справочную информацию для исследователей, которые хотят проводить эксперименты с РНК FISH, особенно с lncRNA FISH.
Introduction
Наше понимание генома человека значительно расширилось благодаря недавним достижениям в области полногеномных технологий. Около 93% генома человека могут быть транскрибированы в РНК, но только 2% РНК могут быть транстранслированы в белки; остальные 98% РНК, которые не имеют функции трансляции белков, называются некодирующими РНК (нРНК)1. Как класс некодирующих РНК (нРНК), длинные нРНК (днкРНК), содержащие более 200 нуклеотидов2, привлекают все большее внимание в связи с их участием во многих физиологических и патологических процессах клеток, таких как дифференцировка, контроль цикла, апоптоз, миграция и инвазия 3,4,5 . LncRNA играют свою роль через различные механизмы, такие как регуляция структуры хроматина и экспрессии ядерных генов, контроль процесса сплайсинга мРНК и посттранскрипционная модификация6. ДнкРНК регулируют возникновение, развитие и метастазирование злокачественных новообразований как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Транскрипционная регуляция реализуется в ядре путем воздействия на транскрипцию РНК через связывание с хромосомными структурами, в то время как посттранскрипционная регуляция осуществляется в цитоплазме путем управления генами-мишенями через механизм эндогенной конкурентной РНК (цРНК) 5,7,8. CeRNA выявила новый механизм взаимодействия РНК, а именно, что днкРНК могут действовать как губка, адсорбируя микроРНК и ингибируя опосредованную микроРНК деградацию родственных генов-мишеней9. Таким образом, информация о субклеточной локализации днкРНК, независимо от того, находится ли конкретная днкРНК в цитоплазме или ядре, важна для определения их биологических функций.
В настоящее время локализация днкРНК в основном определяется двумя методами: методом выделения фракции ядра/цитоплазмы и РНК FISH. В первом случае выделяют РНК в цитоплазматической и ядерной фракциях соответственно, а затем проводят ПЦР-амплификацию со специфическими праймерами днкРНК для определения соотношения днкРНК в цитоплазме и ядре. Преимуществом этого метода является экономия времени, в то время как недостатком является то, что фактическая локализация днкРНК не отражается напрямую на относительной доле днкРНК в цитоплазме и ядре. РНК FISH может обнаруживать локализацию днкРНК в клетках путем разработки специфичных для днкРНК антисмысловых цепных последовательностей с последующим мечением флуоресцентными красителями10. Методы RNA FISH были усовершенствованы благодаря достижениям в области зондовых техник и методов обнаружения, включая множественные наборы олигозондов, меченные флуорофорами11, зонды LNA 12 и зонды с разветвленной ДНК (бДНК)13. RNA FISH может не только обнаруживать локализацию lncRNA, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции14.
В данной работе в качестве примера был включен подробный протокол обнаружения внутриклеточной локализации малоядрышковой РНК гена хозяина 6 (SNHG6) lncRNA в клетках остеосаркомы (143B) с помощью РНК FISH. SNHG6 представляет собой 600-730 нуклеотидную днкРНК в зрелой сплайсированной форме и идентифицирован как новый онкоген при различных видах рака человека, включая колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточную карциному яичников, остеосаркому и гепатоцеллюлярную карциному15,16,17,18. Исследования подтвердили участие SNHG6 в биологическом поведении раковых клеток, таком как пролиферация, ЭМП и аутофагия, и показали цитоплазматическую локализацию SNHG6, где он может влиять на гены-мишени путем связывания (губирования) микроРНК15,16,17. В статье представлен подробный протокол детектирования внутриклеточной локализации SNHG6 с помощью РНК FISH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе. На рисунке 1 показан общий протокол для RNA FISH; Таблица 1 содержит состав всех растворов, а таблица 2 содержит последовательности праймеров, используемые в этом протоколе.
1. Подготовка зонда
- Идентификация и получение последовательности FASTA интересующей вас целевой днкРНК, например, из GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Следуя указаниям на веб-сайте, спроектируйте датчики ISH онлайн19 и ознакомьтесь с предложениями алгоритма проектирования, чтобы перечислить датчики, которые необходимо заказать, с маркировкой Cy3.
- Инкубируйте гибридизационный буфер при температуре 37 °C в течение 2 ч.
- Растворите 4 зонда оптической плотности (OD) в 160 мкл обработанного диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) ddH2O в концентрации 1 мг/мл вдали от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая плотность (OD) представляет собой единицу измерения ДНК и РНК. Обычно 1 единица OD = 33 мкг/мл ДНК. - Приготовьте 200 мкл зондовой смеси для каждой лунки (1,2–10 мкл зонда, 70 мкл гибридизационного буфера, дополните объем обработанным ДЭПК ddH2O до 200 мкл) и установите серию 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл и 6 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация зонда должна быть предварительно исследована экспериментально. Высокая концентрация зонда приведет к неспецифическому связыванию днкРНК, в то время как низкая концентрация зонда приведет к нечувствительному или неудачному обнаружению днкРНК. - Денатурировать смесь зонда при 73 °C в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если зонд ДНК с мечением Cy3 является двухцепочечным, денатурируйте зонд до одноцепочечной ДНК при 95 °C в течение 5 минут, затем быстро охладите в течение 2 минут на льду.
2. Подготовка клеток
- Высевают 50 000 клеток 143B на лунку на стерильные стеклянные покровные стекла в 12-луночный планшет для клеточных культур и инкубируют их в течение 24 ч (37 °C, 5%CO2) в DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретное количество клеток, засеянных здесь, зависит от размера клеток, что подходит для того, чтобы засеянные клетки достигали слияния 50% после инкубации в течение 24 часов. Стерильные стеклянные покровные стекла имеют круглую форму, что подходит для 12-луночной пластины. - Удалите средство и промойте в течение 2 x 5 минут 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1x PBS с обработанным DEPC ddH2O. PBS без обработки DEPC нельзя использовать, поскольку он содержит РНКазу. Выполните все следующие действия в условиях, свободных от РНКазы. - Удалите 1x PBS и добавьте 200 мкл 100% этанола в каждую лунку, чтобы зафиксировать на 15 минут при комнатной температуре.
- Удалите этанол, добавьте 200 мкл 0,1% Triton X-100 (в 1 PBS) в каждую лунку и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время должно строго контролироваться с помощью пермеабилизации Triton X-100, и оно не может быть слишком длинным. - Удалите 0,1% Triton X-100 и постирайте 2 x 5 мин с 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если здесь протокол необходимо приостановить, замените PBS 70% этанолом (разбавление 100% этанола безРНКазным ddH2O) и храните образец при 4 °C до 3 месяцев. - Удалите 1x PBS, добавьте 200 мкл 2x буфера солевого раствора натрия (SSC) (разведение 20x SSC с ddH2O, не содержащим РНКазы) в каждую лунку и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
- Удалите 2 буфера SSC, добавьте 200 мкл 70% этанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
- Выбросьте 70% этанол, добавьте 200 мкл 85% этанола (разбавление 100% этанола свободным РНКазой ddH2O) в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
- Выбросьте 85% этанол, добавьте 200 мкл 100% этанола в каждую лунку и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
- Абсорбировать и отбросить 100% этанол; Дайте лункам высохнуть.
3. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
- Добавьте 200 мкл смеси зондов (денатурированной, как на этапе 1.5) в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C в течение ночи (16-18 ч).
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует сильная положительная корреляция между температурой гибридизации и концентрацией зонда; Поэтому для оптимизации фона следует снизить как температуру гибридизации, так и концентрацию зонда. - На следующий день выньте пробы с температурой от 37 °C и выбросьте смесь зондов. Добавьте 200 мкл 0,4x SSC/0,3% Tween-20 буфера в каждую лунку (предварительно нагретого до 65 °C) и промывайте в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Удалите буфер 0,4x SSC/0,3% Tween-20, добавьте 200 мкл 2x буфера SSC/0,1% Tween-20 в каждую лунку и промывайте в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Удалить 2x SSC/0,1% Tween-20 буфера, добавить 200 мкл раствора для окрашивания 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (1 мкг/мл) и окрашивать в течение 20 минут вдали от света.
- Выбросьте раствор красителя DAPI и промойте 1x PBS в течение 2 минут при комнатной температуре.
- Добавьте 50 мкл монтажной среды, содержащей камедь, на предметное стекло и поместите стеклянный покровный стекло на предметное стекло для фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно положите покровный листок на предметное стекло стороной ячейки вниз. - Наблюдение под флуоресцентным микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуоресцентный микроскоп или лазерный конфокальный микроскоп; Последний обеспечивает более высокую чувствительность и четкость изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представлены репрезентативные изображения SNHG6 FISH в клетках остеосаркомы человека (рис. 2). Отрицательный элемент управления обрабатывается отрицательным зондом Ctrl; положительный контроль обрабатывается зондом U6 20. Зонд SNHG6 и зонд U6 помечены Cy3, который излучает красную флуоресценцию. DAPI — это краситель, окрашивающий ДНК, который излучает синюю флуоресценцию. Этот результат показывает, что SNHG6 в основном локализуется в цитоплазме, и эта информация может дать важное направление для дальнейшего изучения SNHG6.
Если используется очень высокая концентрация зонда, то под флуоресцентным микроскопом можно увидеть цвет фона. На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения при использовании зонда SNHG6 с высокой концентрацией в РНК FISH. Белые стрелки обозначают неспецифическое окрашивание.
Рисунок 1: Блок-схема протокола RNA FISH для lncRNA. На этом графике показан ключевой протокол процесса эксперимента RNA FISH. Сокращения: FISH = флуоресцентная гибридизация in situ ; lncRNA = длинная некодирующая РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Локализация LncRNA (SNHG6) в клетках остеосаркомы человека (143B). Отрицательный контроль обрабатывается отрицательным контрольным зондом. Положительный контроль обрабатывается зондом U6 . Зонды SNHG6 и U6 помечены Cy3, который излучает красную флуоресценцию. DAPI — это краситель, который окрашивает ДНК и излучает синюю флуоресценцию. Красный и синий сливаются, образуя розовый. Изображения делаются с помощью флуоресцентного микроскопа. Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: LncRNA = длинная некодирующая РНК; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения высокой концентрации зонда SNHG6 в РНК FISH. Зонды SNHG6 помечены Cy3, который излучает красную флуоресценцию. DAPI — это краситель, который окрашивает ДНК и излучает синюю флуоресценцию. Красный и синий сливаются, образуя розовый. Изображения делаются с помощью флуоресцентного микроскопа. Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав растворов, используемых в эксперименте по гибридизации РНК FISH. Все разведения следует проводить в стерильной воде, не содержащей РНКазы. Вся добавленная вода обработана DEPC ddH2O. Сокращения: FISH = флуоресцентная гибридизация in situ ; DEPC = диэтилпирокарбонат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Все последовательности зондов, использованные в этом эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол RNA FISH может не только обнаруживать локализацию днкРНК в клетках, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков в клетках, что также может быть использовано для обнаружения местоположения днкРНК в тканях, погруженных в парафин. Однако конкретный протокол в таких случаях отличается, поскольку ткани, залитые парафином, должны быть депарафинизированы21. Эта экспериментальная процедура может быть применена к 48- или 96-луночным планшетам, но 384-луночные планшеты слишком малы для использования здесь.
Необходимо отметить несколько критических этапов этого метода, включая свободную от РНКазы среду, концентрацию зонда, температуру гибридизации и установку отрицательного и положительного контроля. Во-первых, состояние отсутствия РНКазы имеет решающее значение, потому что РНКаза разрушает связи между нуклеотидами и приводит к деградации днкРНК в целом. Во-вторых, обычно рекомендуемая концентрация зонда колеблется от 5 до 50 мкг/мл. Высокая концентрация зонда приведет к неспецифическому связыванию днкРНК, в то время как низкая концентрация зонда приведет к нечувствительному или неудачному обнаружению днкРНК19. Если используется очень высокая концентрация зонда, то фоновый цвет можно увидеть под флуоресцентным микроскопом даже в присутствии скремблированного зонда (отрицательный контроль); Таким образом, одни и те же концентрации отрицательных контролей обычно используются для установления базового уровня (так же, как и внутренний контроль) во время предварительных экспериментов, изучающих соответствующую концентрацию зонда, чтобы избежать неспецифического связывания. В следующих экспериментах использовалась самая высокая концентрация зонда без фонового цвета в отрицательной контрольной группе, представляющая наиболее сильную сигнализацию без неспецифического связывания. В-третьих, рекомендуется спроектировать, по крайней мере, два или три зонда для оптимизации с конкретной днкРНК. В то же время два или более зондов также могут быть смешаны для повышения чувствительности обнаружения целевых днкРНК. В-четвертых, нормальная температура гибридизации зонда днкРНК составляет 37 °C. В процессе гибридизации температура гибридизации должна поддерживаться постоянной и равномерной. Диапазон температур гибридизации между различными зондами составляет от 34 до 38 °C. Температура гибридизации сильно положительно коррелирует с концентрацией зонда; Поэтому для оптимизации фона концентрацию зонда следует уменьшить. Наконец, также очень важно установить отрицательный и позитивный контроль. Группа без зонда используется в качестве отрицательного контроля для получения фоновых сигналов. Зонд U6 или зонд рибосомной РНК используется в качестве положительного контроля, чтобы исключить возможность ложноположительных результатов.
Такой подход имеет ряд преимуществ. Цвет флуоресценции зондов lncRNA может быть изменен. Зеленая флуоресценция излучается флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), флуоресцеином (FAM) и Alexa Fluor 488, в то время как красная флуоресценция излучается Cy3 и Alexa Fluor 555. FITC используется для типичного зеленого цвета, а Cy3 — для типичного красного. Кроме того, изображения могут быть получены с помощью флуоресцентного микроскопа или лазерного конфокального микроскопа. Изображения последних более чувствительны и четки, чем те, которые получены с помощью флуоресцентного микроскопа.
Ограничением метода РНК FISH является то, что это качественный метод; Таким образом, результаты не поддаются количественной оценке. Из-за изменения времени гибридизации и влияния субъективных факторов при наблюдении под флуоресцентным микроскопом экспрессия днкРНК не может быть точно количественно определена в клетках. Уровни экспрессии днкРНК в различных клеточных фракциях могут быть оценены только качественно. Однако с усовершенствованием метода был разработан метод одномолекулярной флуоресцентной гибридизации in situ (smFISH)22 для количественного определения уровня экспрессии РНК; В будущем может быть сообщено о большем количестве обнаружений smFISH.
Методика RNA FISH имеет широкий спектр применения. Обнаружение внутриклеточной локализации днкРНК будет способствовать изучению биологических механизмов днкРНК. В то же время этот метод также может быть использован для обнаружения локализации других некодирующих РНК в клетках, включая циркРНК, микроРНК и тРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддержана грантами (1) Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (2) Национальный фонд естественных наук (81973877 и 82174408); (3) Шанхайский совместный инновационный центр промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах; (4) Исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al.
Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012). - Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).