Summary
El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.
Abstract
Se han estudiado las funciones importantes de los ARN largos no codificantes (ARNnc) en el cáncer, como la regulación de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la migración, la infiltración y la autofagia de las células cancerosas. La detección de localización de lncRNAs en las células puede proporcionar información sobre sus funciones. Mediante el diseño de la secuencia de cadena antisentido específica de lncRNA seguida de marcaje con colorantes fluorescentes, se puede aplicar la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para detectar la localización celular de lncRNAs. Junto con el desarrollo de la microscopía, las técnicas de ARN FISH permiten ahora incluso la visualización de los lncRNAs mal expresados. Este método no solo puede detectar la localización de lncRNAs por sí solo, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor. Aquí, hemos incluido el procedimiento de operación experimental detallado y las precauciones de ARN FISH mediante el uso del gen huésped de ARN nucleolar pequeño de lncRNA 6 (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B) como ejemplo, para proporcionar una referencia para los investigadores que desean realizar experimentos de ARN FISH, especialmente lncRNA FISH.
Introduction
Nuestra comprensión del genoma humano se ha ampliado enormemente gracias a los recientes avances en la tecnología del genoma completo. Alrededor del 93% del genoma humano se puede transcribir en ARN, pero solo el 2% de los ARN se pueden traducir en proteínas; el 98% restante de los ARN que no tienen función de traducción de proteínas se denominan ARN no codificante (ncRNA)1. Como una clase de ARN no codificantes (ncRNAs), los ncRNAs largos (lncRNAs), que contienen más de 200 nucleótidos2, han atraído cada vez más atención debido a su participación en muchos procesos fisiológicos y patológicos de las células, como la diferenciación, el control del ciclo, la apoptosis, la migración y la invasión 3,4,5. Los LncRNAs desempeñan sus funciones a través de diversos mecanismos, como la regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica nuclear, el control del proceso de empalme del ARNm y la modificación postranscripcional6. Los LncRNAs regulan la aparición, el desarrollo y la metástasis de las neoplasias malignas tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. La regulación transcripcional se realiza en el núcleo afectando la transcripción del ARN a través de la unión a las estructuras cromosómicas, mientras que la regulación postranscripcional se realiza en el citoplasma mediante el control de los genes diana a través de un mecanismo endógeno de ARN competitivo (ARNce) 5,7,8. El CeRNA ha revelado un nuevo mecanismo de interacción del ARN, a saber, que los lncRNAs pueden actuar como una esponja para adsorber miRNAs e inhibir la degradación mediada por miRNAsde genes diana relacionados. Por lo tanto, la información sobre la localización subcelular de los lncRNAs, ya sea que un lncRNA específico se encuentre en el citoplasma o en el núcleo, es importante para ayudar a identificar sus funciones biológicas.
En la actualidad, la localización de lncRNA se detecta principalmente mediante dos métodos, uno es mediante el ensayo de aislamiento de la fracción de núcleo/citoplasma y el otro es mediante ARN FISH. En el primero, se extraen los ARN de las fracciones citoplasmática y nuclear respectivamente, y luego se realiza la amplificación por PCR con cebadores específicos de lncRNA para detectar la proporción de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. La ventaja de este método es la eficiencia del tiempo, mientras que la desventaja es que la localización real del lncRNA no se refleja directamente en la proporción relativa de lncRNAs en el citoplasma y el núcleo. RNA FISH puede detectar la localización de lncRNA en las células mediante el diseño de secuencias de cadenas antisentido específicas de lncRNA seguidas de marcaje con colorantes fluorescentes10. Los métodos FISH de ARN se han mejorado con avances en las técnicas de sonda y los métodos de detección, incluidos los conjuntos de sondas de múltiples oligonucleótidosmarcados con fluoróforos 11, las sondas LNA 12 y las sondas de ADN ramificado (ADNb)13. RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNA, sino también detectar la colocalización de otros ARN, ADN o proteínas mediante el uso de inmunofluorescencia bicolor o multicolor14.
En este trabajo, hemos incluido como ejemplo el protocolo detallado de detección de localización intracelular del gen huésped de ARN nucleolar pequeño 6 (SNHG6) de lncRNA en células de osteosarcoma (143B) mediante ARN FISH. SNHG6 es un lncRNA de 600-730 nucleótidos en su forma madura empalmada e identificado como un nuevo oncogén en diversos cánceres humanos, incluido el cáncer colorrectal, el cáncer gástrico, el carcinoma de células claras de ovario, el osteosarcoma y el carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Los estudios han confirmado la participación de SNHG6 en los comportamientos biológicos de las células cancerosas, como la proliferación, la EMT y la autofagia, y han demostrado la localización citoplasmática de SNHG6 donde puede afectar a los genes diana mediante la unión (esponja) de los miRNAs15,16,17. En este documento se presenta este protocolo detallado de detección de la localización intracelular de SNHG6 mediante ARN FISH.
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Protocol
Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles de todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo. La Figura 1 muestra el protocolo general para ARN FISH; La Tabla 1 contiene la composición de todas las soluciones y la Tabla 2 contiene las secuencias de cebadores utilizadas en este protocolo.
1. Preparación de la sonda
- Identificar y adquirir la secuencia FASTA de un lncRNA diana de interés, por ejemplo, de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Siguiendo las indicaciones del sitio web, diseñe las sondas ISH en línea19 y revise las sugerencias del algoritmo de diseño para enumerar las sondas que se pedirán con la etiqueta Cy3.
- Incubar el tampón de hibridación a 37 °C durante 2 h de antelación.
- Disuelva 4 sondas de densidad óptica (OD) en 160 μL de ddH2O tratado con dietilpirocarbonato (DEPC) a una concentración de 1 mg/ml lejos de la luz.
NOTA: La densidad óptica (DO) representa la unidad de medida del ADN y el ARN. Por lo general, 1 unidad OD = 33 μg/mL de ADN. - Prepare 200 μL de la mezcla de la sonda para cada pocillo (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampón de hibridación, componga el volumen con ddH2 O tratadocon DEPC a 200 μL) y configure una serie de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL y 6 μg/mL.
NOTA: La concentración de la sonda debe explorarse experimentalmente de antemano. Una concentración alta de la sonda conducirá a una unión inespecífica de lncRNAs, mientras que una concentración baja de la sonda conducirá a una detección insensible o fallida de lncRNAs. - Desnaturalizar la mezcla de la sonda a 73 °C durante 5 min.
NOTA: Si la sonda de ADN marcada con Cy3 es bicatenaria, desnaturalice la sonda a ADN monocatenario a 95 °C durante 5 minutos, luego enfríe rápidamente durante 2 minutos en hielo.
2. Preparación celular
- Siembre 50.000 células 143B por pocillo en cubreobjetos de vidrio estériles en una placa de cultivo celular de 12 pocillos e incube durante 24 h (37 °C, 5% de CO2) en DMEM.
NOTA: El número específico de células sembradas aquí varía con el tamaño de la célula, lo cual es apropiado para que las células sembradas alcancen una confluencia del 50% después de ser incubadas durante 24 h. Los cubreobjetos de vidrio estéril son redondos para ser adecuados para la placa de 12 pocillos. - Retire el medio y lave durante 2 x 5 minutos con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: Prepare 1x PBS con ddH2O. No se puede usar PBS sin tratamiento con DEPC porque contiene RNasa. Realice todos los pasos siguientes en condiciones libres de RNasa. - Retire 1x PBS y agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo para fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Retire el etanol, agregue 200 μL de Triton X-100 al 0,1% (en 1x PBS) en cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: El tiempo debe controlarse estrictamente con la permeabilización Triton X-100 y no puede ser demasiado largo. - Retire Triton X-100 al 0,1% y lave 2 x 5 min con 1x PBS.
NOTA: Si el protocolo tiene que ser pausado aquí, reemplace el PBS con etanol al 70% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de RNasa) y almacene la muestra a 4 °C durante un máximo de 3 meses. - Retirar 1x PBS, añadir 200 μL de tampón de citrato salino sódico (SSC) 2x (dilución de 20x SSC con ddH2O sin RNasa) en cada pocillo e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Retire 2 tampones SSC, agregue 200 μL de etanol al 70% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Deseche el etanol al 70%, agregue 200 μL de etanol al 85% (dilución de etanol al 100% con ddH2O libre de ARNasa) en cada pocillo e incube durante 3 min a temperatura ambiente.
- Deseche el etanol al 85%, agregue 200 μL de etanol al 100% en cada pocillo e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Absorber y desechar etanol al 100%; Deja que los pozos se sequen.
3. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
- Añadir 200 μL de mezcla de sonda (desnaturalizada como en el paso 1.5) a cada pocillo e incubar a 37 °C durante la noche (16-18 h).
NOTA: Existe una fuerte correlación positiva entre la temperatura de hibridación y la concentración de la sonda; Por lo tanto, para optimizar el fondo, se debe reducir tanto la temperatura de hibridación como la concentración de la sonda. - Al día siguiente, saque muestras a 37 °C y deseche la mezcla de sonda. Añadir 200 μL de tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada pocillo (precalentado a 65 °C) y lavar durante 2 min a temperatura ambiente.
- Retire el tampón 0,4x SSC/0,3% Tween-20, agregue 200 μL de tampón 2x SSC/0,1% Tween-20 a cada pocillo y lave durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Retirar 2x SSC/tampón Tween-20 al 0,1%, añadir 200 μl de solución de tinción 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/ml) y teñir durante 20 minutos lejos de la luz.
- Deseche la solución de tinte DAPI y lave con 1x PBS durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Agregue 50 μL de medio de montaje que contenga goma en el portaobjetos y coloque el cubreobjetos de vidrio en el portaobjetos para fijarlo.
NOTA: Asegúrese de colocar el cubreobjetos en el portaobjetos con la celda hacia abajo. - Observar bajo un microscopio de fluorescencia.
NOTA: Utilice un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal láser; Este último produce una imagen de mayor sensibilidad y claridad.
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Representative Results
Se muestran imágenes representativas de SNHG6 FISH en células de osteosarcoma humano (Figura 2). El control negativo se trata con la sonda Ctrl negativa; el control positivo se trata con la sonda U6 20. La sonda SNHG6 y la sonda U6 están marcadas con Cy3, que emite fluorescencia roja. El DAPI es un tinte que tiñe el ADN, que emite fluorescencia azul. Este resultado muestra que SNHG6 se localiza principalmente en el citoplasma, y esta información puede proporcionar una dirección importante para futuros estudios de SNHG6.
Si se utiliza una concentración muy alta de sonda, se puede ver un color de fondo bajo el microscopio de fluorescencia. La Figura 3 muestra las imágenes representativas cuando se utiliza una alta concentración de sonda SNHG6 en ARN FISH. Las flechas blancas representan una tinción inespecífica.
Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo RNA FISH para lncRNA. Este gráfico muestra el protocolo clave del proceso del experimento ARN FISH. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; lncRNA = ARN largo no codificante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Localización de LncRNA (SNHG6) en células de osteosarcoma humano (143B). El control negativo se trata con una sonda de control negativo. El control positivo se trata con una sonda U6 . Las sondas SNHG6 y U6 están marcadas con Cy3, que emite fluorescencia roja. El DAPI es un tinte que tiñe el ADN y emite fluorescencia azul. El rojo y el azul se fusionan para formar el rosa. Las imágenes se toman con un microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: LncRNA = ARN largo no codificante; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las imágenes representativas de la alta concentración de la sonda SNHG6 en ARN FISH.Las sondas SNHG6 están marcadas con Cy3, que emite fluorescencia roja. El DAPI es un tinte que tiñe el ADN y emite fluorescencia azul. El rojo y el azul se fusionan para formar el rosa. Las imágenes se toman con un microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas en el experimento de hibridación ARN FISH. Todas las diluciones deben realizarse con agua estéril y libre de ARNasa. Toda el agua añadida es ddH2O tratada con DEPC. Abreviaturas: FISH = hibridación fluorescente in situ ; DEPC = dietilpirocarbonato. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Todas las secuencias de sonda utilizadas en este experimento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Este protocolo RNA FISH no solo puede detectar la localización de lncRNAs en las células, sino también detectar la colocalización de otros RNAs, ADN o proteínas en las células, que también se pueden utilizar para detectar la ubicación de lncRNAs en tejidos embebidos en parafina. Sin embargo, el protocolo específico en estos casos es diferente porque los tejidos embebidos en parafina necesitan ser desparafinados21. Este procedimiento experimental se puede aplicar en placas de 48 o 96 pocillos, pero las placas de 384 pocillos son demasiado pequeñas para ser utilizadas aquí.
Es necesario tener en cuenta varios pasos críticos de este método, incluido el entorno libre de RNasa, la concentración de la sonda, la temperatura de hibridación y el establecimiento de controles negativos y positivos. En primer lugar, la condición libre de ARNasa es crucial porque la ARNasa rompe los enlaces entre nucleótidos y conduce a la degradación de los lncRNAs en general. En segundo lugar, la concentración de sonda comúnmente recomendada oscila entre 5 y 50 μg/mL. Una concentración alta de la sonda conducirá a la unión inespecífica de lncRNAs, mientras que una concentración baja de la sonda conducirá a una detección insensible o fallida de lncRNAs19. Si se utiliza una concentración muy alta de sonda, se puede ver un color de fondo bajo el microscopio de fluorescencia incluso en presencia de una sonda codificada (un control negativo) solamente; Por lo tanto, las mismas concentraciones de controles negativos se utilizan generalmente para establecer la línea de base (igual que el control interno) durante los experimentos preliminares que exploran la concentración de sonda adecuada para evitar cualquier unión no específica. La mayor concentración de sonda sin color de fondo en el grupo de control negativo, presentando la señalización más fuerte sin unión inespecífica, se utilizó en los siguientes experimentos. En tercer lugar, se recomienda diseñar al menos dos o tres sondas para la optimización con un lncRNA específico. Al mismo tiempo, también se pueden mezclar dos o más sondas para mejorar la sensibilidad de detección de lncRNAs diana. En cuarto lugar, la temperatura normal de hibridación de la sonda lncRNA es de 37 °C. Durante el proceso de hibridación, la temperatura de hibridación debe mantenerse constante y uniforme. El rango de temperatura de hibridación entre diferentes sondas es de 34 a 38 °C. La temperatura de hibridación se correlaciona positivamente con la concentración de la sonda; Por lo tanto, para optimizar el fondo, se debe reducir la concentración de la sonda. Por último, también es fundamental establecer controles negativos y positivos. El grupo sin sonda se utiliza como control negativo para obtener señales de fondo. Se utiliza una sonda U6 o una sonda de ARN ribosómico como control positivo para descartar la posibilidad de resultados falsos positivos.
Este enfoque tiene varias ventajas. Se puede cambiar el color de fluorescencia de las sondas de lncRNA. La fluorescencia verde es emitida por el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la fluoresceína (FAM) y Alexa Fluor 488, mientras que la fluorescencia roja es emitida por Cy3 y Alexa Fluor 555. FITC se utiliza para el verde típico y Cy3 para el rojo típico. Además, las imágenes se pueden obtener utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal láser. Las imágenes de este último son más sensibles y claras que las adquiridas mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
La limitación del método ARN FISH es que se trata de un método cualitativo; por lo tanto, los resultados no son cuantificables. Debido al cambio en el tiempo de hibridación y a la influencia de factores subjetivos durante la observación con microscopio de fluorescencia, la expresión de lncRNA no se puede cuantificar con precisión en las células. Los niveles de expresión de lncRNAs en diferentes fracciones celulares solo pueden evaluarse cualitativamente. Sin embargo, con la mejora de la técnica, se ha desarrollado un método de hibridación in situ fluorescente de una sola molécula (smFISH)22 para cuantificar el nivel de expresión de ARN; Es posible que en el futuro se informe de más detecciones de smFISH.
La técnica RNA FISH tiene una amplia gama de aplicaciones. La detección de localización intracelular de lncRNAs beneficiará el estudio de los mecanismos biológicos de lncRNAs. Al mismo tiempo, esta técnica también se puede utilizar para detectar la localización de otros ARN no codificantes en las células, incluidos los circARN, los miARN y los ARNt.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de (1) el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2020YFE0201600); (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408); (3) Centro de Innovación Colaborativa de Shanghái de Transformación Industrial de Preparación de MTC Hospitalaria; (4) Proyectos de investigación dentro del presupuesto de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
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