Summary
تصف هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الدماغية من خلال إذابة الجلطة وتلطيخ الخلايا وفحص الدم الروتيني.
Abstract
الجلطة الدماغية ، وهي جلطة دموية في الشريان أو الوريد الدماغي ، هي أكثر أنواع الاحتشاء الدماغي شيوعا. دراسة مكونات الخلية من جلطات الدم الدماغية مهمة للتشخيص والعلاج والتشخيص. ومع ذلك ، فإن الأساليب الحالية لدراسة مكونات الخلية في الجلطات تعتمد بشكل أساسي على التلوين في الموقع ، وهو أمر غير مناسب للدراسة الشاملة لمكونات الخلية لأن الخلايا ملفوفة بإحكام في الجلطات. نجحت الدراسات السابقة في عزل إنزيم محلل للفبرين (sFE) من Sipunculus nudus ، والذي يمكن أن يؤدي إلى تحلل الفيبرين المتصالب مباشرة ، وإطلاق مكونات الخلية. أنشأت هذه الدراسة طريقة شاملة تعتمد على sFE لدراسة مكونات الخلية في الخثرة الدماغية. يتضمن هذا البروتوكول إذابة الجلطة ، وإطلاق الخلايا ، وتلطيخ الخلايا ، وفحص الدم الروتيني. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية كميا ونوعيا. يتم عرض النتائج التمثيلية للتجارب باستخدام هذه الطريقة.
Introduction
الأمراض الدماغية الوعائية هي واحدة من ثلاثة أمراض رئيسية يمكن أن تهدد صحة الإنسان ، من بينها الأمراض الدماغية الوعائية التي تمثل أكثر من 80 ٪. تجلط الدم الدماغي وتجلط الأوردة الدماغية هي أكثر الأمراض الدماغية الوعائية الإقفارية اليوم ، والتي تسببها بشكل رئيسي جلطات الدم الدماغية 1,2. إذا لم يتم العلاج بشكل صحيح ، فسيكون له معدلات عالية من الإعاقة والوفيات ومعدل تكرار مرتفع بعد الخروج3.
في الآونة الأخيرة ، أظهر عدد متزايد من الدراسات أن مكونات الخلايا في جلطات الدم الدماغية ترتبط ارتباطا وثيقا بتشخيص وعلاج وتشخيص تجلط الدم الدماغي4،5،6. لذلك ، فإن توافر البيانات حول تكوين الجلطة ، وخاصة مكونات الخلية ، مهم للتشخيص والعلاج السريري. لسوء الحظ ، لا يمكن للطرق المتاحة حاليا تحليل مكون جلطة الدم بشكل شامل كميا ونوعيا. على سبيل المثال ، يمكن للتلطيخ في الموقع القائم على Martius Scarlett Blue فقط دراسة خلايا الدم الحمراء / البيضاء لشرائح معينة من الجلطة7. يمكن للتلوين في الموقع القائم على الكيمياء المناعية (IHC) دراسة مكونات الدم المحدودة لشرائح معينة من الجلطة باستخدام أجسامهاالمضادة 8. تهتم الطرق المجهرية القائمة على الصور فقط بالبنية المحددة للجلطة9. علاوة على ذلك ، كل هذه الأساليب شاقة وتستغرق وقتاطويلا 10. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن إجراءات دراسة مكونات خلايا الجلطات الدماغية كميا ونوعيا. من المسلم به على نطاق واسع أن الفيبرين المتصالب يلف خلايا الدم بإحكام في الجلطات11. وبالتالي ، فإن التدهور المحدد للفيبرين المتصالب وإطلاق الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق لمكونات الخلية.
قامت الأعمال السابقة بعزل إنزيم محلل للفبرين من Sipunculus nudus (sFE) ، والذي يمكن أن يتحلل الفيبرين على وجه التحديد وبسرعة12. هنا ، تم اقتراح طريقة لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدماغية بناء على النشاط الفريد ل sFE. استخدم هذا البروتوكول sFE لتحلل الفيبرين من الجلطات أولا ثم تحليل مكونات الخلية عن طريق تلطيخ رايت وفحص الدمالروتيني 13،14. وفقا لهذه الطريقة ، يمكن دراسة مكونات الخلية من الجلطات الدموية الدماغية كميا ونوعيا. يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والفعال لتحليل مكونات الخلية للجلطات الدموية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء البحث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات الطبية بجامعة هواتشياو. تمت إزالة جلطات الدم الدماغية جراحيا وجمعها في مستشفى تشيوانتشو الأول ، التابع لجامعة فوجيان الطبية ، بموافقة مستنيرة من المرضى.
1. المعالجة المسبقة لجلطة الدم
- ضع الجلطات على طبق نظيف ، أضف 5 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي مع ملقط ، هز الطبق برفق ، وأزل المحلول الملحي باستخدام ماصة.
ملاحظة: كرر الشطف ثلاث مرات. - قطع الجلطات إلى قطع أصغر (أصغر من 5 مم × 5 مم × 5 مم) بمقص. أضف 5 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي ، وهز الطبق برفق ، وأزل المحلول الملحي باستخدام ماصة.
ملاحظة: كرر الشطف ثلاث مرات. تأكد من عدم شفط قطع الجلطة أثناء الشطف. - انقل الجلطات إلى لوحة U نظيفة أخرى.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا (قم بتخزين اللوحة عند 2-8 درجة مئوية) وإعادة تشغيلها لاحقا.
2. انحلال الخثرة
- تحضير محلول عمل sFE عن طريق ضبط تركيز sFE إلى 2000 وحدة / مل مع محلول ملحي فسيولوجي.
ملاحظة: تم إعداد sFE وفقا للبروتوكولات الراسخة لمختبر تانغ15. - أضف 300 ميكرولتر من محلول عمل sFE في الجلطات المعالجة مسبقا.
- أداء الجولة الأولى من التدهور.
- احتضان خليط sFE والجلطات عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
ملاحظة: تم تعيين اللطخة المعالجة بالمحلول الملحي الفسيولوجي كتحكم سلبي. لا تقم بتدوير العينة على الخفق. - امزج العينة برفق. انقل الجزء السائل إلى أنبوب نظيف آخر باستخدام ماصة نظيفة.
ملاحظة: تم استخدام الجلطات المتبقية لجولة أخرى من التحلل. - جهاز طرد مركزي الجزء السائل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف آخر باستخدام ماصة للحصول على محلول sFE المسترد.
- امزج ترسيب الخلية مع 50 ميكرولتر من المحلول الملحي الفسيولوجي بلطف.
ملاحظة: تم تخزين خليط الخلية 2-8 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
- احتضان خليط sFE والجلطات عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
- أداء تدهور لاحق.
- تحلل الجلطات المتبقية (الخطوة 2.3.2) باستخدام محلول sFE المستعاد (الخطوة 2.3.4) عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
ملاحظة: كانت الخطوات المتبقية هي نفسها في جولة التحلل الأولى. تم الانتهاء من عملية التحلل حتى تدهورت الجلطات بأكملها.
- تحلل الجلطات المتبقية (الخطوة 2.3.2) باستخدام محلول sFE المستعاد (الخطوة 2.3.4) عند 37 درجة مئوية لمدة 0.5 ساعة.
- إجراء جمع الخلايا.
- تحضير عينة خلايا الدم عن طريق جمع خليط الخلية من كل جولة من التدهور.
3. تلطيخ رايت
- أداء تشويه الخلية.
- اضبط الخلايا على كثافة 1 × 106 خلايا / مل.
- أضف 5 ميكرولتر من الخلايا إلى الشريحة الزجاجية المطلية بالليسين poly-L ، ثم قم بتلطيخها باستخدام قسيمة الغطاء.
- تتبخر السائل في درجة حرارة الغرفة.
- أداء تلطيخ.
- أضف 200 ميكرولتر من صبغة رايت (انظر جدول المواد) إلى مسحة الخلية برفق ، وأضف 600 ميكرولتر من صبغة رايت B لخلطها بالتساوي. صمة عار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- اشطف الصبغة برفق بالماء النظيف.
ملاحظة: يمكن تخزين مسحة الخلايا الملطخة في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها لاحقا.
- أداء التصوير المجهري.
- افحص الخلايا الملطخة باستخدام مجهر ضوئي (انظر جدول المواد).
4. فحص الدم الروتيني
- اضبط الخلايا على كثافة 1 × 106 خلايا / مل.
- تحليل مكونات الخلية مثل الصفائح الدموية ، كريات الدم الحمراء ، خلايا الدم البيضاء ، الخلايا الليمفاوية ، العدلات ، الوحيدات ، الحمضات ، الخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة غير الناضجة باستخدام محلل أمراض الدم الذاتية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في المرحلة الأولى من عملية التحلل ، وجد أن جلطات الدم لها بنية مدمجة حمراء ، وأن محلول العمل كان عديم اللون. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، تحول محلول العمل إلى اللون الأحمر الفاتح ، مما يشير إلى إطلاق خلايا الدم المتقاطعة في محلول العمل. تم إذابة معظم الجلطات عند إطالة وقت الحضانة إلى 5 ساعات ، وأصبح محلول العمل أحمر فاتح. على العكس من ذلك ، لم يكن هناك تغيير كبير في المجموعة الملحية الفسيولوجية (NC) حتى بعد حضانة 10 ساعات (الشكل 1). أظهرت هذه النتائج أن خلايا الدم المغلقة في الجلطات تم إطلاقها بنجاح بواسطة هذا البروتوكول.
بعد بقعة رايت ، تم فحص مكونات الخلية بوضوح تحت المجهر الضوئي (الشكل 2 أ). من بين خلايا الدم التي تم إطلاقها ، يمكن ملاحظة عدد كبير من خلايا الدم الحمراء الناضجة ذات الأسطح المقعرة قليلا وعلى شكل قرص. لوحظت كمية كبيرة من الجسيمات الصغيرة ذات اللون الأرجواني والأحمر غير المنتظمة الشكل على الشريحة الزجاجية ، وهي الصفائح الدموية المنبعثة من جلطات الدم. أظهرت خلايا الدم البيضاء بلازما أكبر ونووية مكثفة. كما لوحظت عدة أنواع من الخلايا المحببة ، مثل الخلايا المحببة الناضجة ، والحمضات ، والوحيدات.
بمساعدة محلل أمراض الدم التلقائي ، تم تحليل مكونات الخلية كميا. من بين الخلايا المكتشفة ، شكلت الصفائح الدموية وكريات الدم الحمراء 51.25 ٪ و 45.24 ٪ ، على التوالي. تتوافق هذه البيانات مع نتائج صبغة رايت. كما تم الكشف عن خلايا دم أخرى ، مثل خلايا الدم البيضاء ، والخلايا الليمفاوية ، والعدلات ، والوحيدات ، والحمضات ، والخلايا القاعدية ، والخلايا المحببة غير الناضجة (الجدول 1). وبالتالي ، باتباع هذا البروتوكول ، يمكن دراسة مكونات الخلية في الخثرة الدماغية ليس فقط من الناحية النوعية ولكن أيضا من الناحية الكمية.
الشكل 1: عملية الذوبان. تم إذابة الخثرة الدماغية في المياه المالحة (NC) و sFE ، على التوالي. تم التقاط الصور الفوتوغرافية في 0 ساعة و 5 ساعات و 10 ساعات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الفحص المجهري وقياس السريان الخلوي للخلايا المفرجة. أ: الخلايا الموجودة تحت المجهر بعد تلطيخ رايت. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) نتائج قياس التدفق الخلوي للخلايا المفرغة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فحص الدم الروتيني | ||
| البارامترات | النتائج | وحدة |
| العدد المطلق المحبب غير الناضج (IG #) | 1 | 109 / لتر |
| نسبة المحببات غير الناضجة (IG٪) | 3.7 | % |
| عدد كرات الدم الحمراء (RBC) | 1.52 | 1012 / لتر |
| حجم خلايا الدم الحمراء المحددة (HCT) | 13.7 | % |
| متوسط حجم الجسيمات (MCV) | 90.1 | إف 1 |
| رقم خلايا الدم البيضاء (WBC) | 26.98 | 109 / لتر |
| عدد الخلايا الليمفاوية (LYM) | 1.41 | 109 / لتر |
| نسبة الخلايا الليمفاوية (LYM٪) | 5.2 | % |
| رقم العدلات (Neu #) | 24.08 | 109 / لتر |
| نسبة العدلات (نيو٪) | 89.2 | % |
| عدد الوحيدات (Mon#) | 1.02 | 109 / لتر |
| نسبة الوحيدات (الاثنين٪) | 3.8 | % |
| عدد الحمضات (Eos #) | 0.34 | 109 / لتر |
| نسبة الحمضات (Eos٪) | 1.3 | % |
| عدد الخلايا القاعدية (Bas#) | 0.13 | 109 / لتر |
| نسبة الخلايا القاعدية (Bas٪) | 0.5 | % |
| عدد الصفائح الدموية (PLT) | 1722 | 109 / لتر |
| متوسط حجم الصفائح الدموية (MPV) | 11.6 | إف 1 |
الجدول 1: فحص الدم الروتيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE هو عامل تحلل الفيبرين الذي يمكن أن يحلل الفيبرين مباشرة وفعالية12,16. هنا ، تم استخدام sFE لتحلل الفيبرين المتصالب للجلطات الدموية الدماغية ، وإطلاق الخلايا المغلقة داخل الجلطات ، وتحليل مكونات الخلية للجلطات نوعيا وكميا. أشارت بيانات الفحص المجهري وفحص الدم الروتيني إلى أن الخلايا المغلقة تم إطلاقها من جلطات الدم. علاوة على ذلك ، لم تتأثر أنواع الخلايا وهياكل الخلايا المنبعثة بشكل كبير بعد علاج sFE. وبالتالي ، تم إنشاء طريقة فريدة وبسيطة وفعالة لأول مرة لتحليل مكونات الخلايا في جلطات الدم الدماغية.
نظرا لأن الخلايا التي تم إطلاقها ليست مستقرة كما هو الحال داخل الجلطات ، يجب تحسين ظروف التحلل لتقليل النسبة المكسورة للخلايا المنبعثة ، مثل درجة الحرارة وجرعة sFE وسرعة الدوران ووقت التدهور. أظهرت نتائج تلطيخ رايت أن خلفية تدهور 10 ساعات كانت غائمة أكثر من خلفية 5 ساعات. ربما تكون هذه الاختلافات بسبب حطام الخلايا وشظايا الخلايا الأخرى. علاوة على ذلك ، أشارت بيانات قياس التدفق الخلوي إلى أن حطام الخلية زاد مع وقت التحلل (الشكل 2 ب). كان معدل حطام الخلايا البالغ 10 ساعات (32.5٪) أعلى بكثير من معدل تدهور 5 ساعات (11.2٪). لذلك ، كان من الأهمية بمكان فصل الخلايا المنبعثة عن محلول العمل في أسرع وقت ممكن. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم جمع الخلايا كل 0.5 ساعة. نقطة رئيسية أخرى هي الدوران ، والذي يمكن أن يسرع التدهور ولكنه سيء للحفاظ على بنية الخلية السليمة للخلايا المفرج عنها.
على الرغم من تحسين ظروف التدهور ، قد يتم تحلل بعض الخلايا في هذه العملية. قد يكون حطام الخلايا ضارا بالفحص المجهري للخلايا وفحص الدم الروتيني17. لذلك ، يوصى بفصل حطام الخلايا عن الخلايا السليمة. قيد آخر لهذه التقنية هو إمكانية تلوث الميكروب. ربما يكون السبب الكامن وراء هذه الظاهرة هو وقت التدهور الطويل مع العملية غير المعقمة. لذلك ، يجب إضافة بعض المضادات الحيوية المناسبة في الدراسات المستقبلية18. من المعروف أن جلطات الدم المختلفة تشترك في هياكل جلطات مماثلة. وبالتالي ، فإن البروتوكول المذكور هنا سيكون مناسبا لتحليل مكونات الخلية لجلطات الدم الأخرى. علاوة على ذلك ، بمساعدة هذه التقنية ، لا يمكن تحليل مكونات الخلية فحسب ، بل أيضا البلازما مع الجلطات نوعيا وكميا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ، ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
