Summary
מחקר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים באמצעות המסת קרישי דם, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית.
Abstract
פקקת מוחית, קריש דם בעורק מוחי או בווריד, הוא הסוג הנפוץ ביותר של אוטם מוחי. חקר מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים חשוב לאבחון, טיפול ופרוגנוזה. עם זאת, הגישות הנוכחיות לחקר מרכיבי התא של קרישי הדם מבוססות בעיקר על צביעה באתרה , שאינה מתאימה למחקר מקיף של מרכיבי התא מכיוון שהתאים עטופים היטב בקרישי הדם. מחקרים קודמים בודדו בהצלחה אנזים פיברינוליטי (sFE) מ-Sipunculus nudus, שיכול לפרק את הפיברין הצולב, באופן ישיר, ולשחרר את מרכיבי התא. מחקר זה ביסס שיטה מקיפה המבוססת על sFE לחקר מרכיבי התא של פקקת מוחית. פרוטוקול זה כולל המסת קרישי דם, שחרור תאים, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית. על פי שיטה זו, ניתן היה לחקור את מרכיבי התא באופן כמותי ואיכותי. התוצאות המייצגות של ניסויים בשיטה זו מוצגות.
Introduction
מחלת כלי דם במוח היא אחת משלוש מחלות עיקריות שיכולות לאיים על בריאות האדם, ביניהן מחלת כלי דם איסכמית במוח מהווה יותר מ -80%. פקקת מוחית ופקקת ורידים מוחיים הן מחלות כלי הדם האיסכמיות המודאגות ביותר כיום, הנגרמות בעיקר על ידי קרישי דם מוחיים 1,2. אם הטיפול לא נעשה כראוי, יהיו לו שיעורי נכות ותמותה גבוהים ושיעור הישנות גבוה לאחר השחרור3.
לאחרונה, מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים נמצאים בקורלציה הדוקה עם האבחון, הטיפול והפרוגנוזה של פקקת מוחית 4,5,6. לכן, זמינות הנתונים על הרכב פקקת, במיוחד מרכיבי התא, חשובה לאבחון קליני וטיפול. למרבה הצער, השיטות הקיימות כיום אינן יכולות לנתח באופן מקיף את מרכיב קריש הדם באופן כמותי ואיכותי. לדוגמה, צביעה באתרו המבוססת על Martius Scarlett Blue יכולה לחקור רק את תאי הדם האדומים/לבנים של פרוסות מסוימות של קריש הדם7. צביעה באתרו המבוססת על אימונוהיסטוכימיה (IHC) יכולה לחקור רק רכיבי דם מוגבלים של פרוסות מסוימות של הקרישבאמצעות נוגדנים 8. השיטות המיקרוסקופיות מבוססות התמונה עוסקות רק במבנה הספציפי של קריש9. יתר על כן, כל השיטות האלה הן מייגעות וגוזלות זמן10. עד כה, לא דווחו ההליכים ללימוד כמותי ואיכותי של מרכיבי תאי תרומבי מוחיים. ידוע כי הפיברין הצולב עוטף בחוזקה את תאי הדם בקרישי הדם11. כתוצאה מכך, הפירוק הספציפי של הפיברין הצולב, ושחרור התאים השלמים, הוא קריטי לניתוח מדויק של מרכיבי התא.
עבודות קודמות בודדו אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus (sFE), שיכול לפרק את הפיברין באופן ספציפי ומהיר12. כאן הוצעה שיטה לניתוח מרכיבי התא של תרומבי המוח בהתבסס על הפעילות הייחודית של sFE. פרוטוקול זה השתמש ב- sFE כדי לפרק את הפיברין של קרישי דם תחילה ולאחר מכן ניתח את מרכיבי התא על ידי צביעת רייט ובדיקת דם שגרתית13,14. על פי שיטה זו, ניתן ללמוד כמותית ואיכותית את מרכיבי התא של תרומבי מוחי. פרוטוקול פשוט ויעיל זה עשוי להיות מיושם עבור ניתוח רכיבי התא של קרישי דם אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות של ועדת האתיקה הרפואית של אוניברסיטת Huaqiao. קרישי הדם המוחיים הוסרו בניתוח ונאספו בבית החולים הראשון Quanzhou, המסונף לאוניברסיטה הרפואית פוג'יאן, בהסכמה מדעת של החולים.
1. טיפול מקדים לקריש דם
- מניחים את הקרישים על צלחת נקייה, מוסיפים 5 מ"ל מלח פיזיולוגי עם טוויטר, מנערים את התבשיל בעדינות ומסירים את המלח עם פיפטה.
הערה: יש לחזור על השטיפה שלוש פעמים. - חותכים את הקרישים לחתיכות קטנות יותר (קטנות מ 5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ) עם מספריים. מוסיפים 5 מ"ל מלח פיזיולוגי, מנערים את המנה בעדינות ומסירים את המלח עם פיפטה.
הערה: יש לחזור על השטיפה שלוש פעמים. יש לוודא שלא נפלטות חתיכות קריש דם במהלך השטיפה. - מעבירים את הקרישים לצלחת U נקייה אחרת.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן (לאחסן את הצלחת ב 2-8 ° C) ולהפעיל מחדש מאוחר יותר.
2. טרומבוליזה
- הכן את פתרון העבודה sFE על ידי התאמת ריכוז sFE ל 2000 U/mL עם מלוחים פיזיולוגיים.
הערה: ה-sFE הוכן בהתאם לפרוטוקולים המבוססים היטב של מעבדת טאנג15. - הוסף 300 μL של תמיסת עבודה sFE לקרישי הדם שטופלו מראש.
- בצע את סבב ההשפלה הראשון.
- לדגור על תערובת של sFE וקרישי דם ב 37 ° C במשך 0.5 שעות.
הערה: הכתם שטופל במי מלח פיזיולוגיים הוגדר כבקרה שלילית. אין לסובב את הדגימה על השייקר. - מערבבים את הדגימה בעדינות. מעבירים את החלק הנוזלי לצינור נקי אחר עם פיפטה נקייה.
הערה: הקרישים הנותרים שימשו לסבב נוסף של התפרקות. - צנטריפוגה את החלק הנוזלי ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי אחר עם פיפטה כדי לקבל את תמיסת ה-sFE המשוחזרת.
- מערבבים את משקעים התא עם 50 μL של מלוחים פיזיולוגיים בעדינות.
הערה: תערובת התאים אוחסנה 2-8 °C לשימוש מאוחר יותר.
- לדגור על תערובת של sFE וקרישי דם ב 37 ° C במשך 0.5 שעות.
- בצע השפלה לאחר מכן.
- יש לפרק את הקרישים הנותרים (שלב 2.3.2) עם תמיסת sFE המשוחזרת (שלב 2.3.4) ב-37°C למשך 0.5 שעות.
הערה: שאר השלבים היו זהים לסבב ההשפלה הראשון. תהליך הפירוק הסתיים עד שכל הקרישים התפרקו.
- יש לפרק את הקרישים הנותרים (שלב 2.3.2) עם תמיסת sFE המשוחזרת (שלב 2.3.4) ב-37°C למשך 0.5 שעות.
- ביצוע איסוף תאים.
- הכינו את דגימת תאי הדם על ידי איסוף תערובת התאים של כל סבב התפרקות.
3. הכתמים של רייט
- בצע מריחת תאים.
- התאם תאים לצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל.
- הוסף 5 μL של התאים לשקופית זכוכית מצופה פולי-L ליזין, ולאחר מכן מרח אותם באמצעות החלקת הכיסוי.
- יש לאדות את הנוזל בטמפרטורת החדר.
- בצעו את הצביעה.
- הוסיפו 200 μL של הצבע של רייט (ראו טבלת חומרים) למריחת התא בעדינות, והוסיפו 600 μL של צבע B של רייט כדי לערבב באופן שווה. יש להכתים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את הצבע בעדינות במים נקיים.
הערה: ניתן לאחסן את כתם התאים המוכתמים בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.
- בצע הדמיה מיקרוסקופית.
- בחנו את התאים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אור (ראו טבלת חומרים).
4. בדיקת דם שגרתית
- התאם תאים לצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל.
- לנתח את מרכיבי התא כגון טסיות דם, אריתרוציטים, תאי דם לבנים, לימפוציטים, נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים לא בשלים באמצעות מנתח אוטוהמטולוגיה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשלב הראשוני של תהליך ההשפלה, נמצא כי קרישי הדם היו בעלי מבנה קומפקטי אדום, ותמיסת העבודה הייתה חסרת צבע. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, תמיסת העבודה הפכה לאדומה בהירה, מה שמצביע על כך שתאי הדם המוצלבים שוחררו לתמיסת העבודה. רוב הקרישים הומסו בעת הארכת זמן הדגירה ל-5 שעות, ותמיסת העבודה הפכה לאדומה בהירה. להיפך, לא היה שינוי משמעותי בקבוצת המלח הפיזיולוגית (NC) אפילו לאחר דגירה של 10 שעות (איור 1). תוצאות אלה הראו כי תאי הדם הסגורים בקרישי הדם שוחררו בהצלחה על ידי פרוטוקול זה.
לאחר הכתם של רייט, מרכיבי התא נבדקו בבירור תחת מיקרוסקופ אור (איור 2A). בין תאי הדם ששוחררו, ניתן היה להבחין במספר רב של תאי דם אדומים בוגרים עם משטחים קעורים מעט בצורת דיסק. כמות גדולה של חלקיקים סגולים-אדומים קטנים בעלי צורה לא סדירה נצפתה במגלשת הזכוכית, שהיו טסיות הדם ששוחררו מקרישי הדם. תאי הדם הלבנים הציגו פלזמה גדולה יותר וגרעיניים מעובים. נצפו גם מספר סוגים של גרנולוציטים, כגון גרנולוציטים נויטרופילים בוגרים, אאוזינופילים ומונוציטים.
בעזרת מנתח המטולוגיה אוטומטי, רכיבי התא נותחו כמותית. מבין התאים שזוהו, טסיות דם ואריתרוציטים היוו 51.25% ו -45.24%, בהתאמה. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם תוצאות הכתם של רייט. תאי דם אחרים, כגון תאי דם לבנים, לימפוציטים, נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים, בזופילים וגרנולוציטים לא בשלים, התגלו גם הם (טבלה 1). לכן, בעקבות פרוטוקול זה, מרכיבי התא של פקקת מוחית ניתן ללמוד לא רק איכותית אלא גם כמותית.
איור 1: תהליך המסה. פקקת המוח הומסה במי מלח (NC) וב- sFE, בהתאמה. הצילום צולם ב-0 שעות, 5 שעות ו-10 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה של התאים ששוחררו . (A) התאים מתחת למיקרוסקופ לאחר צביעתו של רייט. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) תוצאות ציטומטריית זרימה של התאים ששוחררו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| בדיקת דם שגרתית | ||
| פרמטרים | תוצאות | יחידה |
| גרנולוציטים לא בשלים מספר מוחלט (IG#) | 1 | 109/ליטר |
| אחוז גרנולוציטים לא בשלים (IG%) | 3.7 | % |
| ספירת אריתרוציטים (RBC) | 1.52 | 1012/ליטר |
| נפח ספציפי לתאי דם אדומים (HCT) | 13.7 | % |
| נפח קורפוסקולרי ממוצע (MCV) | 90.1 | ו1 |
| מספר תאי דם לבנים (WBC) | 26.98 | 109/ליטר |
| מספר לימפוציטים (LYM) | 1.41 | 109/ליטר |
| אחוז לימפוציטים (LYM%) | 5.2 | % |
| מספר נויטרופילים (Neu#) | 24.08 | 109/ליטר |
| אחוז נויטרופילים (נוי%) | 89.2 | % |
| מספר מונוציטים (Mon#) | 1.02 | 109/ליטר |
| אחוז מונוציטים (Mon%) | 3.8 | % |
| מספר אאוזינופילים (Eos#) | 0.34 | 109/ליטר |
| אחוז אאוזינופילים (Eos%) | 1.3 | % |
| מספר בזופילים (Bas#) | 0.13 | 109/ליטר |
| אחוז הבזופילים (בס%) | 0.5 | % |
| ספירת טסיות (PLT) | 1722 | 109/ליטר |
| נפח טסיות ממוצע (MPV) | 11.6 | ו1 |
טבלה 1: בדיקת דם שגרתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE הוא סוכן פיברינוליטי שיכול לפרק את הפיברין באופן ישיר ויעיל12,16. כאן, נעשה שימוש ב-sFE כדי לפרק את הפיברין הצולב-מקושר של קרישי הדם במוח, לשחרר את התאים הסגורים בתוך קרישי הדם, ולנתח את מרכיבי התאים של הקרישים באופן איכותי וכמותי. נתוני המיקרוסקופ ובדיקת הדם השגרתית הצביעו על כך שהתאים הסגורים שוחררו מקרישי הדם. יתר על כן, סוגי התאים והמבנים של התאים ששוחררו לא הושפעו באופן משמעותי לאחר טיפול sFE. כך נוצרה לראשונה שיטה ייחודית, פשוטה ויעילה לניתוח מרכיבי התאים של קרישי דם מוחיים.
מכיוון שהתאים המשוחררים אינם יציבים כמו בתוך קרישי הדם, יש למטב את תנאי הפירוק כדי להפחית את היחס השבור של התאים המשוחררים, כגון טמפרטורה, מינון sFE, מהירות סיבוב וזמן התפרקות. תוצאות הצביעה של רייט הראו כי הרקע של השפלה של 10 שעות היה מעונן יותר מזה של 5 שעות. הבדלים אלה נובעים ככל הנראה מפסולת תאים ושברי תאים אחרים. יתר על כן, נתוני ציטומטריית הזרימה הצביעו על כך שפסולת התא גדלה עם זמן הפירוק (איור 2B). שיעור פירוק פסולת התא של 10 שעות (32.5%) היה גבוה משמעותית מזה של השפלה של 5 שעות (11.2%). לכן, היה קריטי להפריד את התאים המשוחררים מפתרון העבודה בהקדם האפשרי. אז, במחקר זה, התאים נאספו כל 0.5 שעות. נקודת מפתח נוספת הייתה הסיבוב, שיכול להאיץ את ההתפרקות אך מזיק לשמירה על מבנה התא השלם של התאים המשוחררים.
למרות שתנאי הפירוק עברו אופטימיזציה, תאים מסוימים עשויים לעבור ליזה בתהליך זה. פסולת תאים עלולה להיות שלילית במיקרוסקופ תאים ובבדיקת דם שגרתית17. לכן, מומלץ להפריד את פסולת התאים מהתאים השלמים. מגבלה נוספת של טכניקה זו היא האפשרות של זיהום מיקרואורגניזם. הסיבה הבסיסית לתופעה זו היא כנראה זמן ההשפלה הארוך בשילוב עם הניתוח הלא סטרילי. לכן, יש להוסיף כמה אנטיביוטיקה מתאימה במחקרים עתידיים18. ידוע היטב כי קרישי דם שונים חולקים מבני קרישי דם דומים. לפיכך, הפרוטוקול המדווח כאן יתאים לניתוח רכיבי תאים של קרישי דם אחרים. יתר על כן, בעזרת טכניקה זו, לא רק את רכיבי התא אלא גם את הפלזמה עם קרישי ניתן לנתח איכותית וכמותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197), ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
