Summary
यह अध्ययन थक्के के घुलने, सेल धुंधला होने और नियमित रक्त परीक्षा के माध्यम से मस्तिष्क रक्त के थक्कों के सेल घटक विश्लेषण के लिए एक तेज और प्रभावी विधि का वर्णन करता है।
Abstract
सेरेब्रल थ्रोम्बोसिस, सेरेब्रल धमनी या नस में रक्त का थक्का, मस्तिष्क रोधगलन का सबसे आम प्रकार है। सेरेब्रल रक्त के थक्कों के कोशिका घटकों का अध्ययन निदान, उपचार और रोग का निदान के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, थक्कों के सेल घटकों का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण मुख्य रूप से सीटू धुंधला होने पर आधारित हैं, जो सेल घटकों के व्यापक अध्ययन के लिए अनुपयुक्त है क्योंकि कोशिकाओं को थक्कों में कसकर लपेटा जाता है। पिछले अध्ययनों ने सिपुन्कुलस न्यूडस से एक फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम (एसएफई) को सफलतापूर्वक अलग किया है, जो सेल घटकों को जारी करते हुए सीधे क्रॉस-लिंक्ड फाइब्रिन को नीचा दिखा सकता है। इस अध्ययन ने सेरेब्रल थ्रोम्बस के सेल घटकों का अध्ययन करने के लिए एसएफई पर आधारित एक व्यापक विधि स्थापित की। इस प्रोटोकॉल में थक्का घुलना, सेल रिलीजिंग, सेल धुंधला होना और नियमित रक्त परीक्षा शामिल है। इस पद्धति के अनुसार, सेल घटकों का मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से अध्ययन किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करने वाले प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं।
Introduction
सेरेब्रोवास्कुलर रोग तीन प्रमुख बीमारियों में से एक है जो मानव स्वास्थ्य को खतरे में डाल सकता है, जिनमें से इस्केमिक सेरेब्रोवास्कुलर रोग 80% से अधिक है। सेरेब्रल थ्रोम्बोसिस और सेरेब्रल वेन थ्रोम्बोसिस आज सबसे अधिक चिंतित इस्केमिक सेरेब्रोवास्कुलर रोग हैं, जो मुख्य रूप से सेरेब्रल रक्त के थक्कों 1,2 के कारण होते हैं। यदि उपचार ठीक से नहीं किया जाता है, तो इसमें उच्च विकलांगता और मृत्यु दर और डिस्चार्जके बाद उच्च पुनरावृत्ति दर होगी।
हाल ही में, अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि सेरेब्रल रक्त के थक्कों के कोशिका घटक सेरेब्रल थ्रोम्बोसिस 4,5,6 के निदान, उपचार और पूर्वानुमान के साथ कसकर सहसंबद्ध हैं। इसलिए, थ्रोम्बस संरचना, विशेष रूप से सेल घटकों पर डेटा की उपलब्धता, नैदानिक निदान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण है। दुर्भाग्य से, वर्तमान में उपलब्ध विधियां रक्त के थक्के घटक का मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से व्यापक रूप से विश्लेषण नहीं कर सकती हैं। उदाहरण के लिए, मार्टियस स्कारलेट ब्लू आधारित इन-सीटू धुंधला केवल थक्के7 के कुछ स्लाइस के लाल / सफेद रक्त कोशिकाओं का अध्ययन कर सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) आधारित इन-सीटू धुंधला केवल उनके एंटीबॉडी8 का उपयोग करके थक्के के कुछ स्लाइस के सीमित रक्त घटकों का अध्ययन कर सकता है। सूक्ष्म छवि-आधारित विधियां केवल थक्के9 की विशिष्ट संरचना से संबंधित हैं। इसके अलावा, वे सभी विधियां श्रमसाध्य और समय लेने वालीहैं। आज तक, सेरेब्रल थ्रोम्बी सेल घटकों का मात्रात्मक और गुणात्मक अध्ययन करने की प्रक्रियाओं की सूचना नहीं दी गई है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि क्रॉस-लिंक्ड फाइब्रिन रक्त कोशिकाओं को थक्कोंमें कसकर लपेटता है। नतीजतन, सेल घटकों के सटीक विश्लेषण के लिए क्रॉस-लिंक्ड फाइब्रिन का विशिष्ट क्षरण और बरकरार कोशिकाओं की रिहाई महत्वपूर्ण है।
पिछले कार्यों ने सिपुन्कुलस न्यूडस (एसएफई) से एक फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम को अलग किया, जो फाइब्रिन को विशेष रूप से और जल्दी से12 कम कर सकता है। इसमें, एसएफई की अनूठी गतिविधि के आधार पर सेरेब्रल थ्रोम्बी के सेल घटकों का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तावित की गई थी। इस प्रोटोकॉल ने पहले थक्कों के फाइब्रिन को नीचा दिखाने के लिए एसएफई का उपयोग किया और फिर राइट के स्टेनिंग और नियमित रक्त परीक्षा13,14 द्वारा सेल घटकों का विश्लेषण किया। इस विधि के अनुसार, सेरेब्रल थ्रोम्बी के कोशिका घटकों का मात्रात्मक और गुणात्मक अध्ययन किया जा सकता है। यह सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल अन्य रक्त के थक्कों के सेल घटक विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।
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Protocol
शोध हुआकियाओ विश्वविद्यालय की चिकित्सा नैतिकता समिति के संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किया गया था। मरीजों की सहमति से फुजियान मेडिकल यूनिवर्सिटी से संबद्ध क्वानझोउ फर्स्ट अस्पताल में सेरेब्रल ब्लड क्लॉट ्स को सर्जरी से हटाया गया और एकत्र किया गया।
1. रक्त के थक्के की प्रथागत
- थक्कों को एक साफ पकवान पर रखें, एक चिमटी के साथ 5 मिलीलीटर शारीरिक लवण जोड़ें, पकवान को धीरे से हिलाएं, और एक पिपेट के साथ खारा निकालें।
नोट: कुल्ला तीन बार दोहराएं। - कैंची से थक्कों को छोटे टुकड़ों (5 मिमी x 5 मिमी x 5 मिमी से छोटे) में काट लें। शारीरिक लवण के 5 मिलीलीटर जोड़ें, पकवान को धीरे से हिलाएं, और एक पिपेट के साथ खारा हटा दें।
नोट: कुल्ला तीन बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि कुल्ला करने के दौरान थक्के के टुकड़े एस्पिरेटेड न हों। - थक्कों को किसी अन्य साफ यू-प्लेट में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है (प्लेट को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें) और बाद में फिर से शुरू करें।
2. थ्रोम्बोलिसिस
- शारीरिक लवण के साथ एसएफई की एकाग्रता को 2000 यू / एमएल में समायोजित करके एसएफई कार्य समाधान तैयार करें।
नोट: एसएफई तांग लैब15 के अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था। - प्रीट्रीटेड क्लॉट्स में एसएफई वर्किंग सॉल्यूशन के 300 μL जोड़ें।
- अवक्रमण का पहला दौर निष्पादित करें।
- एसएफई और थक्कों के मिश्रण को 0.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: शारीरिक खारा के साथ इलाज किए गए धब्बे को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किया गया था। नमूने को शेकर पर न घुमाएं। - नमूने को धीरे से मिलाएं। तरल भाग को एक साफ पाइप के साथ किसी अन्य साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: शेष थक्कों का उपयोग गिरावट के एक और दौर के लिए किया गया था। - तरल भाग को 200 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- बरामद एसएफई समाधान प्राप्त करने के लिए सुपरनैटेंट को पिपेट के साथ किसी अन्य साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- कोशिका वर्षा को 50 μL शारीरिक लवण के साथ धीरे से मिलाएं।
नोट: सेल मिश्रण बाद में उपयोग के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस संग्रहीत किया गया था।
- एसएफई और थक्कों के मिश्रण को 0.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- बाद में गिरावट करें।
- शेष थक्कों (चरण 2.3.2) को पुनर्प्राप्त एसएफई समाधान (चरण 2.3.4) के साथ 0.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नीचा दिखाएं।
नोट: बाकी चरण पहले गिरावट दौर के समान थे। गिरावट की प्रक्रिया तब तक समाप्त हो गई थी जब तक कि पूरे थक्के खराब नहीं हो गए थे।
- शेष थक्कों (चरण 2.3.2) को पुनर्प्राप्त एसएफई समाधान (चरण 2.3.4) के साथ 0.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नीचा दिखाएं।
- कक्ष संग्रह निष्पादित करें.
- गिरावट के प्रत्येक दौर के सेल मिश्रण को इकट्ठा करके रक्त कोशिका का नमूना तैयार करें।
3. राइट का धुंधलापन
- सेल स्मीयर करें।
- कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व में समायोजित करें।
- पॉली-एल लाइसिन-लेपित ग्लास स्लाइड में कोशिकाओं के 5 μL जोड़ें, फिर कवर स्लिप का उपयोग करके उन्हें स्मीयर करें।
- कमरे के तापमान पर तरल को वाष्पित करें।
- धुंधला पन करें।
- धीरे से सेल स्मीयर में राइट की डाई के 200 μL ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और समान रूप से मिश्रण करने के लिए राइट के डाई बी के 600 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए दाग लगाएं।
- डाई को साफ पानी से धीरे-धीरे धो लें।
नोट: दाग वाले सेल स्मीयर को बाद में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- सूक्ष्म इमेजिंग करें।
- प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दाग वाली कोशिकाओं की जांच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
4. नियमित रक्त परीक्षण
- कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व में समायोजित करें।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑटोहेमेटोलॉजी विश्लेषक का उपयोग करके प्लेटलेट्स, एरिथ्रोसाइट्स, सफेद रक्त कोशिकाओं, लिम्फोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स, ईोसिनोफिल, बेसोफिल और अपरिपक्व ग्रैनुलोसाइट्स जैसे सेल घटकों का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
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Representative Results
गिरावट प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण में, यह पाया गया कि रक्त के थक्कों में एक लाल कॉम्पैक्ट संरचना थी, और काम करने वाला समाधान रंगहीन था। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद, काम करने वाला समाधान हल्का लाल हो गया, जिसने संकेत दिया कि क्रॉस रक्त कोशिकाओं को कामकाजी समाधान में छोड़ दिया गया था। इनक्यूबेशन समय को 5 घंटे तक लंबा करने पर अधिकांश थक्के भंग हो गए, और काम करने वाला समाधान हल्का लाल हो गया। इसके विपरीत, 10 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद भी शारीरिक खारा समूह (एनसी) में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ (चित्रा 1)। इन परिणामों से पता चला कि थक्कों में संलग्न रक्त कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल द्वारा सफलतापूर्वक जारी किया गया था।
राइट के दाग के बाद, सेल घटकों को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 ए) के तहत स्पष्ट रूप से जांच की गई थी। उन जारी रक्त कोशिकाओं में, थोड़ी अवतल और डिस्क के आकार की सतहों के साथ परिपक्व लाल रक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या देखी जा सकती है। ग्लास स्लाइड पर अनियमित आकार के छोटे बैंगनी-लाल कणों की एक बड़ी मात्रा देखी गई, जो रक्त के थक्कों से जारी प्लेटलेट्स थे। सफेद रक्त कोशिकाओं ने बड़े प्लाज्मा और संघनित परमाणु का प्रदर्शन किया। कई प्रकार के ग्रैनुलोसाइट्स, जैसे परिपक्व न्यूट्रोफिल ग्रैनुलोसाइट, ईोसिनोफिल और मोनोसाइट, भी देखे गए।
ऑटो हेमेटोलॉजी विश्लेषक की सहायता से, सेल घटकों का मात्रात्मक विश्लेषण किया गया था। पता लगाए गए कोशिकाओं में, प्लेटलेट्स और एरिथ्रोसाइट्स क्रमशः 51.25% और 45.24% के लिए जिम्मेदार थे। ये डेटा राइट के दाग के परिणामों के अनुरूप हैं। अन्य रक्त कोशिकाओं, जैसे सफेद रक्त कोशिकाओं, लिम्फोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स, ईोसिनोफिल, बेसोफिल और अपरिपक्व ग्रैनुलोसाइट्स का भी पता लगाया गया था (तालिका 1)। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, सेरेब्रल थ्रोम्बस के सेल घटकों का अध्ययन न केवल गुणात्मक रूप से बल्कि मात्रात्मक रूप से भी किया जा सकता है।
चित्र 1: भंग करने की प्रक्रिया। सेरेब्रल थ्रोम्बस क्रमशः खारा (एनसी) और एसएफई में भंग हो गया था। फोटोग्राफी 0 घंटे, 5 घंटे और 10 घंटे पर ली गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: जारी कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री । (ए) राइट के धुंधला होने के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे की कोशिकाएं। स्केल बार = 20 μm. (B) जारी कोशिकाओं के फ्लो साइटोमेट्री परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नियमित रक्त परीक्षण | ||
| पैरामीटर | परिणाम | इकाई |
| अपरिपक्व ग्रैनुलोसाइट निरपेक्ष संख्या (IG#) | 1 | 109/L |
| अपरिपक्व ग्रैनुलोसाइट प्रतिशत (आईजी%) | 3.7 | % |
| एरिथ्रोसाइट गिनती (आरबीसी) | 1.52 | 1012/L |
| लाल रक्त कोशिका विशिष्ट मात्रा (एचसीटी) | 13.7 | % |
| औसत कॉर्पसकुलर वॉल्यूम (एमसीवी) | 90.1 | f1 |
| श्वेत रक्त कोशिका संख्या (WBC) | 26.98 | 109/L |
| लिम्फोसाइट्स संख्या (एलवाईएम) | 1.41 | 109/L |
| लिम्फोसाइट्स प्रतिशत (एलवाईएम%) | 5.2 | % |
| न्यूट्रोफिल संख्या (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| न्यूट्रोफिल प्रतिशत (न्यू%) | 89.2 | % |
| मोनोसाइट्स संख्या (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| मोनोसाइट्स प्रतिशत (मोन%) | 3.8 | % |
| ईोसिनोफिल्स संख्या (ईओएस #) | 0.34 | 109/L |
| ईोसिनोफिल्स प्रतिशत (ईओएस%) | 1.3 | % |
| बेसोफिल संख्या (बास #) | 0.13 | 109/L |
| बेसोफिल प्रतिशत (बीएएस%) | 0.5 | % |
| प्लेटलेट काउंट (पीएलटी) | 1722 | 109/L |
| औसत प्लेटलेट वॉल्यूम (एमपीवी) | 11.6 | f1 |
तालिका 1: नियमित रक्त परीक्षा।
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Discussion
एसएफई एक फाइब्रिनोलिटिक एजेंट है जो फाइब्रिन को सीधे और प्रभावी ढंग से12,16 कम कर सकता है। यहां, एसएफई को सेरेब्रल रक्त के थक्कों के क्रॉस-लिंक्ड फाइब्रिन को नीचा दिखाने, थक्कों के भीतर संलग्न कोशिकाओं को छोड़ने और गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से थक्कों के सेल घटकों का विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया था। माइक्रोस्कोपी डेटा और नियमित रक्त परीक्षा ने संकेत दिया कि संलग्न कोशिकाओं को रक्त के थक्कों से जारी किया गया था। इसके अलावा, जारी कोशिकाओं के सेल प्रकार और संरचनाएं एसएफई उपचार के बाद महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं हुईं। इस प्रकार, सेरेब्रल रक्त के थक्कों के कोशिका घटकों का विश्लेषण करने के लिए पहली बार एक अद्वितीय, सरल और प्रभावी विधि बनाई गई थी।
क्योंकि जारी कोशिकाएं थक्कों के भीतर स्थिर नहीं होती हैं, इसलिए जारी कोशिकाओं के टूटे हुए अनुपात को कम करने के लिए गिरावट की स्थिति को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, जैसे तापमान, एसएफई की खुराक, रोटेशन की गति और गिरावट का समय। राइट के धुंधला परिणामों से पता चला कि 10 घंटे की गिरावट की पृष्ठभूमि 5 घंटे की तुलना में अधिक बादल थी। ये अंतर संभवतः सेल मलबे और अन्य सेल टुकड़ों के कारण हैं। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री डेटा ने संकेत दिया कि सेल मलबे में गिरावट के समय के साथ वृद्धि हुई (चित्रा 2 बी)। 10 घंटे की गिरावट (32.5%) की सेल मलबे की दर 5 घंटे की गिरावट (11.2%) की तुलना में काफी अधिक थी। इसलिए, जितनी जल्दी हो सके जारी कोशिकाओं को कामकाजी समाधान से अलग करना महत्वपूर्ण था। इसलिए, इस अध्ययन में, कोशिकाओं को हर 0.5 घंटे में एकत्र किया गया था। एक और महत्वपूर्ण बिंदु रोटेशन था, जो गिरावट में तेजी ला सकता है लेकिन जारी कोशिकाओं की बरकरार सेल संरचना को बनाए रखने के लिए बुरा है।
यद्यपि गिरावट की स्थिति को अनुकूलित किया गया है, इस प्रक्रिया में कुछ कोशिकाओं को व्यवस्थित किया जा सकता है। सेल मलबे सेल माइक्रोस्कोपी और नियमित रक्त परीक्षाके लिए प्रतिकूल हो सकता है। इसलिए, उन सेल मलबे को बरकरार कोशिकाओं से अलग करने की सिफारिश की जाती है। इस तकनीक की एक और सीमा माइक्रोब संदूषण की संभावना है। इस घटना का अंतर्निहित कारण शायद गैर-बाँझ ऑपरेशन के साथ जोड़े में लंबे समय तक गिरावट का समय है। इसलिए, भविष्यके अध्ययनों में कुछ उपयुक्त एंटीबायोटिकदवाओं को जोड़ा जाना चाहिए। यह सर्वविदित है कि विभिन्न रक्त के थक्के समान थक्के संरचनाओं को साझा करते हैं। इस प्रकार, यहां बताया गया प्रोटोकॉल अन्य रक्त के थक्कों के सेल घटक विश्लेषण के लिए उपयुक्त होगा। इसके अलावा, इस तकनीक की सहायता से, न केवल कोशिका घटकों बल्कि थक्कों के साथ प्लाज्मा का भी गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को ज़ियामेन सिटी के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (3502Z20227197), और फ़ुज़ियान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (संख्या 2019J01070, No.2021Y0027) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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