Summary
Questo studio descrive un metodo rapido ed efficace per l'analisi dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale attraverso la dissoluzione del coagulo, la colorazione cellulare e l'esame del sangue di routine.
Abstract
La trombosi cerebrale, un coagulo di sangue in un'arteria o vena cerebrale, è il tipo più comune di infarto cerebrale. Lo studio dei componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale è importante per la diagnosi, il trattamento e la prognosi. Tuttavia, gli attuali approcci allo studio dei componenti cellulari dei coaguli si basano principalmente sulla colorazione in situ , che non è adatta per lo studio completo dei componenti cellulari perché le cellule sono strettamente avvolte nei coaguli. Studi precedenti hanno isolato con successo un enzima fibrinolitico (sFE) da Sipunculus nudus, che può degradare direttamente la fibrina reticolata, rilasciando i componenti cellulari. Questo studio ha stabilito un metodo completo basato sull'sFE per studiare i componenti cellulari del trombo cerebrale. Questo protocollo include la dissoluzione del coagulo, il rilascio cellulare, la colorazione cellulare e l'esame del sangue di routine. Secondo questo metodo, i componenti cellulari potrebbero essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Vengono mostrati i risultati rappresentativi degli esperimenti che utilizzano questo metodo.
Introduction
La malattia cerebrovascolare è una delle tre principali malattie che possono minacciare la salute umana, tra le quali la malattia cerebrovascolare ischemica rappresenta oltre l'80%. La trombosi cerebrale e la trombosi venosa cerebrale sono oggi le malattie cerebrovascolari ischemiche più preoccupanti, causate principalmente da coaguli di sangue cerebrale 1,2. Se il trattamento non viene eseguito correttamente, avrà alti tassi di disabilità e mortalità e un alto tasso di recidiva dopo la dimissione3.
Recentemente, un numero crescente di studi ha dimostrato che i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale sono strettamente correlati con la diagnosi, il trattamento e la prognosi della trombosi cerebrale 4,5,6. Pertanto, la disponibilità di dati sulla composizione del trombo, in particolare sui componenti cellulari, è importante per la diagnosi clinica e il trattamento. Sfortunatamente, i metodi attualmente disponibili non sono in grado di analizzare in modo completo la componente del coagulo di sangue quantitativamente e qualitativamente. Ad esempio, la colorazione in situ a base di Martius Scarlett Blue può studiare solo i globuli rossi/bianchi di alcune fette del coagulo7. La colorazione in situ basata sull'immunoistochimica (IHC) può studiare solo i componenti limitati del sangue di alcune fette del coagulo utilizzando i loro anticorpi8. I metodi basati su immagini microscopiche riguardano solo la struttura specifica del coagulo9. Inoltre, tutti questi metodi sono laboriosi e richiedono molto tempo10. Ad oggi, le procedure per lo studio quantitativo e qualitativo dei componenti delle cellule trombiformi cerebrali non sono state riportate. È ampiamente riconosciuto che la fibrina reticolata avvolge strettamente le cellule del sangue nei coaguli11. Di conseguenza, la degradazione specifica della fibrina reticolata e il rilascio delle cellule intatte sono fondamentali per l'analisi accurata dei componenti cellulari.
Lavori precedenti hanno isolato un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus (sFE), che può degradare la fibrina in modo specifico e rapido12. In questo caso, è stato proposto un metodo per analizzare i componenti cellulari dei trombi cerebrali basato sull'attività unica di sFE. Questo protocollo ha utilizzato sFE per degradare prima la fibrina dei coaguli e poi ha analizzato i componenti cellulari mediante colorazione di Wright ed esame del sanguedi routine 13,14. Secondo questo metodo, i componenti cellulari dei trombi cerebrali possono essere studiati quantitativamente e qualitativamente. Questo protocollo semplice ed efficace potrebbe essere applicato per l'analisi della componente cellulare di altri coaguli di sangue.
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Protocol
La ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali del Comitato di Etica Medica dell'Università di Huaqiao. I coaguli di sangue cerebrale sono stati rimossi chirurgicamente e raccolti presso il Quanzhou First Hospital, affiliato alla Fujian Medical University, con il consenso informato dei pazienti.
1. Pretrattamento del coagulo di sangue
- Disporre i coaguli su un piatto pulito, aggiungere 5 ml di soluzione fisiologica con una pinzetta, agitare delicatamente il piatto e rimuovere la soluzione fisiologica con una pipetta.
NOTA: Ripetere il risciacquo tre volte. - Tagliare i coaguli in pezzi più piccoli (più piccoli di 5 mm x 5 mm x 5 mm) con una forbice. Aggiungere 5 mL di soluzione fisiologica, agitare delicatamente la capsula e rimuovere la soluzione fisiologica con una pipetta.
NOTA: Ripetere il risciacquo tre volte. Assicurarsi che non vengano aspirati pezzi di coagulo durante il risciacquo. - Trasferire i coaguli su un'altra piastra a U pulita.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui (conservare la piastra a 2-8 °C) e riavviato in un secondo momento.
2. Trombolisi
- Preparare la soluzione di lavoro sFE regolando la concentrazione di sFE a 2000 U/mL con soluzione fisiologica.
NOTA: L'sFE è stato preparato secondo i protocolli consolidati di Tang Lab15. - Aggiungere 300 μL di soluzione di lavoro sFE nei coaguli pretrattati.
- Eseguire il primo ciclo di degradazione.
- Incubare la miscela di sFE e coaguli a 37 °C per 0,5 ore.
NOTA: Il blot trattato con soluzione fisiologica è stato impostato come controllo negativo. Non ruotare il campione sull'agitatore. - Mescolare delicatamente il campione. Trasferire la parte liquida in un'altra provetta pulita con una pipetta pulita.
NOTA: I coaguli rimanenti sono stati utilizzati per un altro ciclo di degradazione. - Centrifugare la parte liquida a 200 × g per 5 min a 4 °C.
- Trasferire il surnatante in un'altra provetta pulita con una pipetta per ottenere la soluzione di sFE recuperata.
- Miscelare delicatamente la precipitazione cellulare con 50 μL di soluzione fisiologica.
NOTA: La miscela cellulare è stata conservata a 2-8 °C per un uso successivo.
- Incubare la miscela di sFE e coaguli a 37 °C per 0,5 ore.
- Eseguire la successiva degradazione.
- Degradare i coaguli rimanenti (fase 2.3.2) con la soluzione di sFE recuperata (fase 2.3.4) a 37 °C per 0,5 ore.
NOTA: Le fasi di riposo sono state le stesse del primo ciclo di degradazione. Il processo di degradazione è stato completato fino a quando l'intero coagulo non è stato degradato.
- Degradare i coaguli rimanenti (fase 2.3.2) con la soluzione di sFE recuperata (fase 2.3.4) a 37 °C per 0,5 ore.
- Eseguire la raccolta delle celle.
- Preparare il campione di cellule del sangue raccogliendo la miscela cellulare di ogni ciclo di degradazione.
3. La colorazione di Wright
- Eseguire lo striscio cellulare.
- Regolare le celle su una densità di 1 x 106 cellule/mL.
- Aggiungere 5 μL di cellule al vetrino rivestito di poli-L con lisina, quindi spalmarle con il vetrino coprioggetto.
- Evaporare il liquido a temperatura ambiente.
- Eseguire la colorazione.
- Aggiungere delicatamente 200 μL di colorante di Wright (vedere la tabella dei materiali) allo striscio cellulare e aggiungere 600 μL di colorante B di Wright per mescolare uniformemente. Colorare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Risciacquare delicatamente la tintura con acqua pulita.
NOTA: Lo striscio di cellule colorate può essere conservato a temperatura ambiente per un uso successivo.
- Eseguire l'imaging microscopico.
- Esaminare le cellule colorate con un microscopio ottico (vedere la tabella dei materiali).
4. Esame del sangue di routine
- Regolare le celle su una densità di 1 x 106 cellule/mL.
- Analizzare i componenti cellulari come piastrine, eritrociti, globuli bianchi, linfociti, neutrofili, monociti, eosinofili, basofili e granulociti immaturi utilizzando un analizzatore autoematologico secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
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Representative Results
Nella fase iniziale del processo di degradazione, è stato riscontrato che i coaguli di sangue avevano una struttura compatta rossa e la soluzione di lavoro era incolore. Dopo un'incubazione di 30 minuti, la soluzione di lavoro è diventata di colore rosso chiaro, il che indica che le cellule del sangue incrociate sono state rilasciate nella soluzione di lavoro. La maggior parte dei coaguli si è dissolta quando si è allungato il tempo di incubazione a 5 ore e la soluzione di lavoro è diventata rosso chiaro. Al contrario, non c'è stato alcun cambiamento significativo nel gruppo fisiologico salino (NC) anche dopo 10 ore di incubazione (Figura 1). Questi risultati hanno mostrato che le cellule del sangue racchiuse nei coaguli sono state rilasciate con successo da questo protocollo.
Dopo la colorazione di Wright, i componenti cellulari sono stati esaminati chiaramente al microscopio ottico (Figura 2A). Tra quelle cellule del sangue rilasciate, è stato osservato un gran numero di globuli rossi maturi con superfici leggermente concave e a forma di disco. Sul vetrino è stata osservata una grande quantità di piccole particelle rosso-viola di forma irregolare, che erano le piastrine rilasciate dai coaguli di sangue. I globuli bianchi hanno mostrato plasma più grande e nucleare condensato. Sono stati osservati anche diversi tipi di granulociti, come i granulociti neutrofili maturi, gli eosinofili e i monociti.
Con l'aiuto dell'analizzatore ematologico automatico, i componenti cellulari sono stati analizzati quantitativamente. Tra le cellule rilevate, le piastrine e gli eritrociti rappresentavano rispettivamente il 51,25% e il 45,24%. Questi dati sono coerenti con i risultati della colorazione di Wright. Sono state rilevate anche altre cellule del sangue, come globuli bianchi, linfociti, neutrofili, monociti, eosinofili, basofili e granulociti immaturi (Tabella 1). Pertanto, seguendo questo protocollo, i componenti cellulari di un trombo cerebrale possono essere studiati non solo qualitativamente ma anche quantitativamente.
Figura 1: Processo di dissoluzione. Il trombo cerebrale è stato disciolto rispettivamente nella soluzione fisiologica (NC) e nella sFE. La fotografia è stata scattata a 0 h, 5 h e 10 h. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Microscopia e citometria a flusso delle cellule rilasciate . (A) Le cellule al microscopio dopo la colorazione di Wright. Barra di scala = 20 μm. (B) Risultati della citometria a flusso delle cellule rilasciate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Esame del sangue di routine | ||
| Parametri | Risultati | Unità |
| Numero assoluto di granulociti immaturi (IG#) | 1 | 109/L |
| Percentuale di granulociti immaturi (IG%) | 3.7 | % |
| Conta degli eritrociti (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Volume specifico dei globuli rossi (HCT) | 13.7 | % |
| Volume corpuscolare medio (MCV) | 90.1 | F1 |
| Numero di globuli bianchi (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Numero di linfociti (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Percentuale di linfociti (LYM%) | 5.2 | % |
| Numero di neutrofili (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Percentuale di neutrofili (Neu%) | 89.2 | % |
| Numero di monociti (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Percentuale di monociti (Mon%) | 3.8 | % |
| Numero di eosinofili (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Percentuale di eosinofili (Eos%) | 1.3 | % |
| Numero di basofili (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Percentuale di basofili (Bas%) | 0.5 | % |
| Conta piastrinica (PLT) | 1722 | 109/L |
| Volume piastrinico medio (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabella 1: Esame del sangue di routine.
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Discussion
sFE è un agente fibrinolitico in grado di degradare la fibrina direttamente ed efficacemente12,16. Qui, sFE è stato impiegato per degradare la fibrina reticolata dei coaguli di sangue cerebrale, rilasciare le cellule racchiuse all'interno dei coaguli e analizzare qualitativamente e quantitativamente i componenti cellulari dei coaguli. I dati della microscopia e l'esame del sangue di routine hanno indicato che le cellule racchiuse sono state rilasciate dai coaguli di sangue. Inoltre, i tipi di cellule e le strutture delle cellule rilasciate non sono stati influenzati in modo significativo dopo il trattamento con sFE. Così, per la prima volta è stato creato un metodo unico, semplice ed efficace per analizzare i componenti cellulari dei coaguli di sangue cerebrale.
Poiché le cellule rilasciate non sono stabili come all'interno dei coaguli, le condizioni di degradazione devono essere ottimizzate per ridurre il rapporto rotto delle cellule rilasciate, come la temperatura, la dose di sFE, la velocità di rotazione e il tempo di degradazione. I risultati della colorazione di Wright hanno mostrato che il fondo della degradazione di 10 ore era più nuvoloso di quello di 5 ore. Queste differenze sono probabilmente dovute a detriti cellulari e altri frammenti cellulari. Inoltre, i dati della citometria a flusso hanno indicato che i detriti cellulari aumentavano con il tempo di degradazione (Figura 2B). Il tasso di detritivi cellulari di degradazione in 10 ore (32,5%) è stato significativamente superiore a quello di degradazione in 5 ore (11,2%). Pertanto, era fondamentale separare le cellule rilasciate dalla soluzione di lavoro il prima possibile. Quindi, in questo studio, le cellule sono state raccolte ogni 0,5 ore. Un altro punto chiave era la rotazione, che potrebbe accelerare la degradazione ma è dannosa per mantenere intatta la struttura cellulare delle cellule rilasciate.
Sebbene le condizioni di degradazione siano state ottimizzate, alcune cellule possono essere lisate in questo processo. I detriti cellulari possono essere avversi alla microscopia cellulare e all'esame del sangue di routine17. Pertanto, si consiglia di separare i detriti cellulari dalle cellule intatte. Un'altra limitazione di questa tecnica è la possibilità di contaminazione microbica. La ragione alla base di questo fenomeno è probabilmente il lungo tempo di degradazione in coppia con l'operazione non sterile. Quindi, alcuni antibiotici adatti dovrebbero essere aggiunti in studi futuri18. È noto che diversi coaguli di sangue condividono strutture simili di coaguli. Pertanto, il protocollo qui riportato sarà adatto per l'analisi dei componenti cellulari di altri coaguli di sangue. Inoltre, con l'aiuto di questa tecnica, non solo i componenti cellulari ma anche il plasma con i coaguli potrebbe essere analizzato qualitativamente e quantitativamente.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
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