Summary
Denna studie beskriver en snabb och effektiv metod för cellkomponentanalys av cerebrala blodproppar genom proppupplösning, cellfärgning och rutinmässig blodundersökning.
Abstract
Cerebral trombos, en blodpropp i en hjärnartär eller ven, är den vanligaste typen av hjärninfarkt. Studiet av cellkomponenterna i hjärnans blodproppar är viktigt för diagnos, behandling och prognos. De nuvarande metoderna för att studera cellkomponenterna i blodpropparna är dock huvudsakligen baserade på in situ-färgning , vilket är olämpligt för omfattande studier av cellkomponenterna eftersom cellerna är tätt inlindade i blodpropparna. Tidigare studier har framgångsrikt isolerat ett fibrinolytiskt enzym (sFE) från Sipunculus nudus, som kan bryta ner det tvärbundna fibrinet direkt och frigöra cellkomponenterna. Denna studie etablerade en omfattande metod baserad på sFE för att studera cellkomponenterna i cerebral trombos. Detta protokoll inkluderar proppupplösning, cellfrigöring, cellfärgning och rutinmässig blodundersökning. Enligt denna metod kunde cellkomponenterna studeras kvantitativt och kvalitativt. De representativa resultaten av experiment med denna metod visas.
Introduction
Cerebrovaskulär sjukdom är en av tre stora sjukdomar som kan hota människors hälsa, bland vilka ischemisk cerebrovaskulär sjukdom står för mer än 80%. Cerebral trombos och cerebral ventrombos är de mest drabbade ischemiska cerebrovaskulära sjukdomarna idag, främst orsakade av cerebrala blodproppar 1,2. Om behandlingen inte görs på rätt sätt kommer den att ha höga funktionshinder och dödlighet och en hög återfallsfrekvens efter utskrivning3.
På senare tid har ett växande antal studier visat att cellkomponenterna i hjärnans blodproppar är nära korrelerade med diagnos, behandling och prognos av cerebral trombos 4,5,6. Därför är tillgången till data om trombernas sammansättning, särskilt cellkomponenterna, viktig för klinisk diagnos och behandling. Tyvärr kan de metoder som för närvarande finns tillgängliga inte analysera blodproppskomponenten kvantitativt och kvalitativt. Till exempel kan Martius Scarlett Blue-baserad in-situ-färgning bara studera de röda/vita blodkropparna i vissa skivor av propp7. Immunohistokemi (IHC) baserad in-situ färgning kan endast studera begränsade blodkomponenter i vissa delar av blodproppen med hjälp av deras antikroppar8. De mikroskopiska bildbaserade metoderna är endast intresserade av den specifika strukturen hos propp9. Dessutom är alla dessa metoder mödosamma och tidskrävande10. Hittills har procedurerna för kvantitativ och kvalitativ studie av cerebrala trombicellskomponenter inte rapporterats. Det är allmänt erkänt att det tvärbundna fibrinet tätt lindar in blodkropparna i blodpropparna11. Följaktligen är den specifika nedbrytningen av det tvärbundna fibrinet och frisättningen av de intakta cellerna avgörande för en korrekt analys av cellkomponenterna.
Tidigare arbeten isolerade ett fibrinolytiskt enzym från Sipunculus nudus (sFE), som kan bryta ned fibrinet specifikt och snabbt12. Här föreslogs en metod för att analysera cellkomponenterna i cerebrala trombi baserat på den unika aktiviteten hos sFE. Detta protokoll använde sFE för att bryta ned fibrinet i blodproppar först och analyserade sedan cellkomponenterna genom Wright's Staining och rutinmässig blodundersökning13,14. Enligt denna metod kan cellkomponenterna i cerebrala tromber studeras kvantitativt och kvalitativt. Detta enkla och effektiva protokoll kan användas för analys av cellkomponenter i andra blodproppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna från den medicinska etikkommittén vid Huaqiao University. De cerebrala blodpropparna opererades bort och samlades in på Quanzhou First Hospital, som är anslutet till Fujian Medical University, med informerat samtycke från patienterna.
1. Förbehandling av blodproppar
- Lägg blodpropparna på en ren tallrik, tillsätt 5 ml fysiologisk koksaltlösning med en pincett, skaka skålen försiktigt och ta bort saltlösningen med en pipett.
OBS: Upprepa sköljningen tre gånger. - Klipp blodpropparna i mindre bitar (mindre än 5 mm x 5 mm x 5 mm) med en sax. Tillsätt 5 ml fysiologisk koksaltlösning, skaka skålen försiktigt och ta bort saltlösningen med en pipett.
OBS: Upprepa sköljningen tre gånger. Se till att inga proppar sugs upp under sköljningen. - Överför blodpropparna till en annan ren U-platta.
OBS: Protokollet kan pausas här (förvara plattan vid 2-8 °C) och startas om senare.
2. Trombolys
- Bered sFE-arbetslösningen genom att justera koncentrationen av sFE till 2000 E/ml med fysiologisk koksaltlösning.
OBS: SFE har förberetts enligt de väletablerade protokollen från Tang Lab15. - Tillsätt 300 μL sFE-arbetslösning till de förbehandlade blodpropparna.
- Utför den första nedbrytningsomgången.
- Inkubera blandningen av sFE och blodproppar vid 37 °C i 0,5 timmar.
OBS: Bloten som behandlades med fysiologisk koksaltlösning var inställd som negativ kontroll. Rotera inte sample på shakern. - Blanda provet försiktigt. Överför den flytande delen till ett annat rent rör med en ren pipett.
OBS: De återstående blodpropparna användes för ytterligare en nedbrytningsomgång. - Centrifugera den flytande delen vid 200 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Överför supernatanten till en annan ren tubett för att erhålla den återvunna sFE-lösningen.
- Blanda cellutfällningen försiktigt med 50 μL fysiologisk koksaltlösning.
OBS: Cellblandningen förvarades 2-8 °C för senare användning.
- Inkubera blandningen av sFE och blodproppar vid 37 °C i 0,5 timmar.
- Utför efterföljande försämring.
- Bryt ned de återstående blodpropparna (steg 2.3.2) med den återvunna sFE-lösningen (steg 2.3.4) vid 37 °C i 0,5 timmar.
OBS: Vilostegen var desamma som den första nedbrytningsomgången. Nedbrytningsprocessen var avslutad tills hela blodpropparna var nedbrutna.
- Bryt ned de återstående blodpropparna (steg 2.3.2) med den återvunna sFE-lösningen (steg 2.3.4) vid 37 °C i 0,5 timmar.
- Utför cellinsamling.
- Bered blodprovet genom att samla upp cellblandningen från varje nedbrytningsomgång.
3. Wrights färgning
- Utför cellutstryk.
- Justera cellerna till en densitet på 1 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 5 μL av cellerna till det poly-L lysinbelagda glasglaset och smörj dem sedan med täckglaset.
- Avdunsta vätskan i rumstemperatur.
- Utför färgningen.
- Tillsätt försiktigt 200 μL av Wrights färgämne (se Materialtabell) till cellutstryket och tillsätt 600 μL av Wrights färgämne B för att blanda jämnt. Fläcka i 10 min i rumstemperatur.
- Skölj färgen försiktigt med rent vatten.
OBS: Det färgade cellutstryket kan förvaras i rumstemperatur för senare användning.
- Utför mikroskopisk avbildning.
- Undersök de färgade cellerna med hjälp av ett ljusmikroskop (se materialförteckning).
4. Rutinmässig blodundersökning
- Justera cellerna till en densitet på 1 x 106 celler/ml.
- Analysera cellkomponenterna såsom blodplättar, erytrocyter, vita blodkroppar, lymfocyter, neutrofiler, monocyter, eosinofiler, basofiler och omogna granulocyter med hjälp av en autohematologianalysator enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det inledande skedet av nedbrytningsprocessen visade det sig att blodpropparna hade en röd kompakt struktur och att arbetslösningen var färglös. Efter inkubation i 30 minuter blev arbetslösningen ljusröd, vilket indikerade att de korsade blodkropparna frigjordes i arbetslösningen. De flesta blodproppar löstes upp när inkubationstiden förlängdes till 5 timmar, och arbetslösningen blev ljusröd. Tvärtom sågs ingen signifikant förändring i den fysiologiska koksaltgruppen (NC) även efter 10 timmars inkubation (Figur 1). Dessa resultat visade att blodkropparna som var inneslutna i blodpropparna frigjordes framgångsrikt av detta protokoll.
Efter Wrights fläck undersöktes cellkomponenterna tydligt i ett ljusmikroskop (Figur 2A). Bland de frisatta blodkropparna kunde ett stort antal mogna röda blodkroppar med lätt konkava och diskformade ytor observeras. En stor mängd oregelbundet formade små lila-röda partiklar observerades på glasglaset, som var de blodplättar som frigjordes från blodpropparna. De vita blodkropparna uppvisade större plasma och kondenserad kärna. Flera typer av granulocyter, såsom mogna neutrofila granulocyter, eosinofiler och monocyter, observerades också.
Med hjälp av autohematologianalysator analyserades cellkomponenterna kvantitativt. Bland de upptäckta cellerna stod blodplättar och erytrocyter för 51,25 % respektive 45,24 %. Dessa data överensstämmer med resultaten av Wrights fläck. Andra blodkroppar, såsom vita blodkroppar, lymfocyter, neutrofiler, monocyter, eosinofiler, basofiler och omogna granulocyter, påvisades också (tabell 1). Således, enligt detta protokoll, kan cellkomponenterna i en cerebral tromb studeras inte bara kvalitativt utan också kvantitativt.
Bild 1: Upplösande process. Den cerebrala tromben löstes upp i koksaltlösning (NC) respektive sFE. Fotograferingen togs vid 0 h, 5 h och 10 h. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikroskopi och flödescytometri av de frigjorda cellerna . (A) Cellerna under mikroskopet efter Wrights färgning. Skalstapel = 20 μm. (B) Flödescytometriresultat för de frigjorda cellerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Rutinmässigt blodprov | ||
| Parametrar | Resultat | Enhet |
| Omogna granulocyter (IG#) | 1 | 109/L |
| Omogen granulocytprocent (IG%) | 3.7 | % |
| Antal erytrocyter (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Specifik volym för röda blodkroppar (HCT) | 13.7 | % |
| Genomsnittlig korpuskulär volym (MCV) | 90.1 | F1 |
| Antal vita blodkroppar (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Antal lymfocyter (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Lymfocytprocent (LYM%) | 5.2 | % |
| Antal neutrofiler (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Neutrofila granulocyter (Neu%) | 89.2 | % |
| Antal monocyter (mån#) | 1.02 | 109/L |
| Monocyter procentuell (mån%) | 3.8 | % |
| Eosinofiler nummer (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Eosinofiler i procent (Eos%) | 1.3 | % |
| Basofiler nummer (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Basofiler procent (Bas%) | 0.5 | % |
| Trombocytantal (PLT) | 1722 | 109/L |
| Genomsnittlig trombocytvolym (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabell 1: Rutinmässig blodundersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE är ett fibrinolytiskt medel som kan bryta ned fibrinet direkt och effektivt12,16. Här användes sFE för att bryta ned det tvärbundna fibrinet i hjärnblodpropparna, frigöra de inneslutna cellerna i koapelarna och analysera cellkomponenterna i blodpropparna kvalitativt och kvantitativt. Mikroskopidata och rutinmässig blodundersökning indikerade att de inneslutna cellerna frigjordes från blodpropparna. Celltyperna och strukturerna hos de frisatta cellerna påverkades inte heller signifikant efter sFE-behandling. Därmed skapades för första gången en unik, enkel och effektiv metod för att analysera cellkomponenterna i hjärnans blodproppar.
Eftersom de frisatta cellerna inte är lika stabila som i blodpropparna måste nedbrytningsförhållandena optimeras för att minska det brutna förhållandet mellan frigjorda celler, såsom temperatur, dos av sFE, rotationshastighet och nedbrytningstid. Wrights färgningsresultat visade att bakgrunden till 10 timmars nedbrytning var mer grumlig än den för 5 timmar. Dessa skillnader beror troligen på cellrester och andra cellfragment. Dessutom indikerade flödescytometridata att cellskräpet ökade med nedbrytningstiden (Figur 2B). Cellskräpsfrekvensen för 10 timmars nedbrytning (32,5 %) var signifikant högre än för 5 timmars nedbrytning (11,2 %). Därför var det viktigt att separera de frigjorda cellerna från arbetslösningen så snart som möjligt. Så i den här studien samlades cellerna in var 0,5:e timme. En annan viktig punkt var rotationen, som kan påskynda nedbrytningen men är dålig för att behålla den intakta cellstrukturen hos de frigjorda cellerna.
Även om nedbrytningsförhållandena har optimerats kan vissa celler lyseras i denna process. Cellrester kan vara skadliga för cellmikroskopi och rutinmässig blodundersökning17. Därför rekommenderas att separera dessa cellrester från de intakta cellerna. En annan begränsning med denna teknik är risken för mikrobkontaminering. Den bakomliggande orsaken till detta fenomen är troligen den långa nedbrytningstiden i kombination med den icke-sterila operationen. Så några lämpliga antibiotika bör läggas till i framtida studier18. Det är välkänt att olika blodproppar delar liknande blodproppsstrukturer. Således kommer det protokoll som rapporteras här att vara lämpligt för cellkomponentanalys av andra blodproppar. Med hjälp av denna teknik kunde dessutom inte bara cellkomponenterna utan även plasman med blodpropparna analyseras kvalitativt och kvantitativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) och Science and Technology Bureau of Fujian Province (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
