Summary
本研究描述了一种通过溶栓、细胞染色和常规血液检查对脑血凝块进行细胞成分分析的快速有效方法。
Abstract
脑血栓形成是脑动脉或静脉中的血凝块，是最常见的脑梗塞类型。脑血栓细胞成分的研究对诊断、治疗和预后具有重要意义。然而，目前研究凝块细胞成分的方法主要基于 原位 染色，由于细胞被紧密包裹在凝块中，因此不适合对细胞成分进行综合研究。先前的研究已成功从 Sipunculus nudus中分离出一种纤维蛋白溶解酶（sFE），该酶可以直接降解交联的纤维蛋白，释放细胞成分。本研究建立了一种基于sFE的综合方法，用于研究脑血栓的细胞成分。该方案包括凝块溶解、细胞释放、细胞染色和常规血液检查。根据这种方法，可以对细胞成分进行定量和定性研究。显示了使用该方法的实验的代表性结果。
Introduction
脑血管疾病是威胁人体健康的三大疾病之一，其中缺血性脑血管疾病占80%以上。脑血栓形成和脑静脉血栓形成是当今最受关注的缺血性脑血管疾病，主要由脑血栓引起1,2。如果治疗不当，将有很高的残疾率和死亡率，出院后复发率很高3.
最近，越来越多的研究表明，脑血栓的细胞成分与脑血栓形成的诊断、治疗和预后密切相关4,5,6。因此，血栓组成数据的可用性，尤其是细胞成分的数据，对于临床诊断和治疗非常重要。不幸的是，目前可用的方法无法定量和定性地全面分析血凝块成分。例如，基于 Martius Scarlett Blue 的原位染色只能研究凝块7 某些切片的红/白细胞。基于免疫组织化学 （IHC） 的原位染色只能使用其抗体研究凝块某些切片的有限血液成分8。基于显微图像的方法仅关注凝块9的特定结构。此外，所有这些方法都费力且耗时10.迄今为止，尚未报道定量和定性研究脑血栓细胞成分的程序。人们普遍认为，交联的纤维蛋白将血细胞紧紧包裹在凝块中11.因此，交联纤维蛋白的特异性降解和完整细胞的释放对于细胞成分的准确分析至关重要。
先前的工作是从 Sipunculus nudus （sFE） 中分离出一种纤维蛋白溶解酶，它可以特异性地快速降解纤维蛋白12。在此，提出了一种基于sFE独特活性的脑血栓细胞成分分析方法。该方案首先利用sFE降解凝块的纤维蛋白，然后通过Wright染色和常规血液检查分析细胞成分13,14。根据这种方法，可以对脑血栓的细胞成分进行定量和定性研究。这种简单有效的方案可用于其他血凝块的细胞成分分析。
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Protocol
该研究是按照华侨大学医学伦理委员会的机构指南进行的。经患者知情同意，在福建医科大学附属泉州市第一医院手术切除并采集脑血凝块。
1.血凝块预处理
- 将凝块放在干净的培养皿上，用镊子加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇晃培养皿，然后用移液管除去生理盐水。
注意： 重复冲洗三次。 - 用剪刀将凝块切成小块（小于 5 mm x 5 mm x 5 mm）。加入 5 mL 生理盐水，轻轻摇晃培养皿，然后用移液管除去生理盐水。
注意： 重复冲洗三次。确保在冲洗过程中没有凝块被吸入。 - 将凝块转移到另一个干净的 U 型板上。
注意：可以在此处暂停方案（将板储存在2-8°C）并稍后重新启动。
2. 溶栓
- 用生理盐水将sFE浓度调节至2000U / mL来制备sFE工作溶液。
注：sFE是根据Tang Lab15的既定方案制备的。 - 将 300 μL sFE 工作溶液加入预处理的凝块中。
- 执行第一轮降级。
- 将sFE和凝块的混合物在37°C孵育0.5小时。
注：用生理盐水处理的印迹设置为阴性对照。不要旋转样品在摇床上。 - 轻轻混合样品。用干净的移液管将液体部分转移到另一个干净的管中。
注意：剩余的凝块用于另一轮降解。 - 将液体部分在4°C下以200× g 离心5分钟。
- 用移液管将上清液转移到另一个干净的管中，以获得回收的sFE溶液。
- 将细胞沉淀物与 50 μL 生理盐水轻轻混合。
注：将细胞混合物储存在2-8°C以备后用。
- 将sFE和凝块的混合物在37°C孵育0.5小时。
- 执行后续降级。
- 用回收的sFE溶液（步骤2.3.4）在37°C下降解剩余的凝块（步骤2.3.2）0.5小时。
注意：其余步骤与第一轮降级相同。降解过程完成，直到整个凝块降解。
- 用回收的sFE溶液（步骤2.3.4）在37°C下降解剩余的凝块（步骤2.3.2）0.5小时。
- 执行单元格收集。
- 通过收集每轮降解的细胞混合物来制备血细胞样品。
3. 赖特染色
- 进行细胞涂片。
- 将细胞调节至 1 x 106 个细胞/mL 的密度。
- 将 5 μL 细胞加入 poly-L 赖氨酸包被的载玻片中，然后使用盖玻片涂抹它们。
- 在室温下蒸发液体。
- 进行染色。
- 向细胞涂片中轻轻加入 200 μL Wright 染料（参见 材料表），加入 600 μL Wright 染料 B 混合均匀。 在室温下染色10分钟。
- 用清水轻轻冲洗染料。
注意：染色的细胞涂片可以在室温下储存以备后用。
- 进行显微成像。
- 使用光学显微镜检查染色细胞（参见 材料表）。
4.血常规检查
- 将细胞调节至 1 x 106 个细胞/mL 的密度。
- 根据制造商的说明，使用自体血液分析仪分析细胞成分，例如血小板，红细胞，白细胞，淋巴细胞，中性粒细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和未成熟粒细胞（参见 材料表）。
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Representative Results
在降解过程的初始阶段，发现血凝块呈红色致密结构，工作溶液为无色。孵育30 min后，工作溶液变为浅红色，表明交叉的血细胞被释放到工作溶液中。当孵育时间延长至5 h时，大多数凝块溶解，工作溶液变为浅红色。相反，即使在孵育10小时后，生理盐水组（NC）也没有显着变化（图1）。这些结果表明，该方案成功释放了包裹在凝块中的血细胞。
Wright染色后，在光学显微镜下清楚地检查细胞成分（图2A）。在这些释放的血细胞中，可以观察到大量表面略微凹陷和圆盘状的成熟红细胞。在载玻片上观察到大量形状不规则的紫红色小颗粒，这些颗粒是从血凝块中释放出来的血小板。白细胞表现出较大的血浆和凝聚的细胞核。还观察到几种类型的粒细胞，例如成熟中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞。
借助自动血液分析仪，对细胞成分进行定量分析。在检测细胞中，血小板和红细胞分别占51.25%和45.24%。这些数据与赖特染色的结果一致。还检测到其他血细胞，如白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和未成熟粒细胞（表 1）。因此，按照该协议，不仅可以定性而且定量地研究脑血栓的细胞成分。
图1：溶解过程。 将脑血栓分别溶解在生理盐水 （NC） 和 sFE 中。摄影分别在0 h， 5 h， 和 10 h. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：释放细胞的显微镜和流式细胞术 。 （A）Wright染色后显微镜下的细胞。比例尺 = 20 μm。 （B） 释放细胞的流式细胞术结果。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 常规验血 | ||
| 参数 | 结果 | 单位 |
| 未成熟粒细胞绝对数 （IG#） | 1 | 109/升 |
| 未成熟粒细胞百分比 （IG%） | 3.7 | % |
| 红细胞计数 （RBC） | 1.52 | 1012/升 |
| 红细胞比容积（HCT） | 13.7 | % |
| 平均红细胞体积 （MCV） | 90.1 | F1系列 |
| 白细胞数 （WBC） | 26.98 | 109/升 |
| 淋巴细胞数 （LYM） | 1.41 | 109/升 |
| 淋巴细胞百分比 （LYM%） | 5.2 | % |
| 中性粒细胞数 （Neu#） | 24.08 | 109/升 |
| 中性粒细胞百分比 （Neu%） | 89.2 | % |
| 单核细胞数 （Mon#） | 1.02 | 109/升 |
| 单核细胞百分比 （Mon%） | 3.8 | % |
| 嗜酸性粒细胞数 （Eos#） | 0.34 | 109/升 |
| 嗜酸性粒细胞百分比 （Eos%） | 1.3 | % |
| 嗜碱性粒细胞数 （Bas#） | 0.13 | 109/升 |
| 嗜碱性粒细胞百分比 （Bas%） | 0.5 | % |
| 血小板计数 （PLT） | 1722 | 109/升 |
| 平均血小板体积 （MPV） | 11.6 | F1系列 |
表1：血常规检查。
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Discussion
sFE 是一种纤溶剂，可直接有效地降解纤维蛋白12,16。本研究采用sFE技术降解脑血凝块的交联纤维蛋白，释放血栓内封闭的细胞，并定性和定量分析血栓的细胞成分。显微镜数据和血常规检查表明，封闭的细胞从血凝块中释放出来。此外，sFE处理后释放细胞的细胞类型和结构没有受到显着影响。因此，首次创造了一种独特、简单、有效的方法来分析脑血栓的细胞成分。
由于释放的细胞不如凝块内稳定，因此需要优化降解条件以降低释放细胞的破碎比，例如温度、sFE剂量、旋转速度和降解时间。Wright染色结果显示，降解10 h的背景比降解5 h更浑浊。这些差异可能是由于细胞碎片和其他细胞碎片造成的。此外，流式细胞术数据表明，细胞碎片随着降解时间的增加而增加（图2B）。降解10 h的细胞碎片率（32.5%）显著高于降解5 h的细胞碎片率（11.2%）。因此，尽快将释放的细胞从工作溶液中分离出来至关重要。因此，在这项研究中，每 0.5 小时收集一次细胞。另一个关键点是旋转，这可能会加速降解，但不利于保持释放细胞的完整细胞结构。
尽管降解条件已经优化，但在此过程中可能会裂解一些细胞。细胞碎片可能对细胞显微镜检查和常规血液检查不利17.因此，建议将这些细胞碎片与完整的细胞分离。该技术的另一个局限性是微生物污染的可能性。造成这种现象的根本原因可能是降解时间长，再加上非无菌操作。因此，在未来的研究中应添加一些合适的抗生素18.众所周知，不同的血凝块具有相似的凝块结构。因此，这里报告的方案将适用于其他血凝块的细胞成分分析。此外，借助该技术，不仅可以定性和定量分析细胞成分，还可以对带有凝块的血浆进行定性和定量分析。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术局（No.2019J01070，No.2021Y0027）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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