Summary
Diese Studie beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Zellkomponentenanalyse von zerebralen Blutgerinnseln durch Gerinnselauflösung, Zellfärbung und routinemäßige Blutuntersuchung.
Abstract
Die Hirnthrombose, ein Blutgerinnsel in einer Hirnarterie oder -vene, ist die häufigste Art von Hirninfarkt. Die Untersuchung der Zellbestandteile von Blutgerinnseln im Gehirn ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Prognose. Die derzeitigen Ansätze zur Untersuchung der Zellbestandteile der Gerinnsel basieren jedoch hauptsächlich auf der In-situ-Färbung , die für die umfassende Untersuchung der Zellbestandteile ungeeignet ist, da die Zellen fest in die Gerinnsel eingewickelt sind. In früheren Studien ist es gelungen, ein fibrinolytisches Enzym (sFE) aus Sipunculus nudus zu isolieren, das das vernetzte Fibrin direkt abbauen und die Zellbestandteile freisetzen kann. In dieser Studie wurde eine umfassende Methode auf Basis der sFE etabliert, um die Zellkomponenten des zerebralen Thrombus zu untersuchen. Dieses Protokoll umfasst die Auflösung von Gerinnseln, die Zellfreigabe, die Zellfärbung und die routinemäßige Blutuntersuchung. Nach dieser Methode konnten die Zellbestandteile quantitativ und qualitativ untersucht werden. Die repräsentativen Ergebnisse von Experimenten mit dieser Methode werden gezeigt.
Introduction
Zerebrovaskuläre Erkrankungen sind eine von drei Hauptkrankheiten, die die menschliche Gesundheit bedrohen können, von denen die ischämische zerebrovaskuläre Erkrankung mehr als 80 % ausmacht. Hirnthrombosen und Hirnvenenthrombosen sind heute die am stärksten betroffenen ischämischen zerebrovaskulären Erkrankungen, die hauptsächlich durch zerebrale Blutgerinnsel verursacht werden 1,2. Wenn die Behandlung nicht richtig durchgeführt wird, führt sie zu einer hohen Behinderungs- und Mortalitätsrate und einer hohen Rezidivrate nach der Entlassung3.
In jüngster Zeit hat eine wachsende Zahl von Studien gezeigt, dass die Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln eng mit der Diagnose, Behandlung und Prognose der Hirnthrombose korrelieren 4,5,6. Daher ist die Verfügbarkeit von Daten zur Thrombuszusammensetzung, insbesondere der Zellbestandteile, wichtig für die klinische Diagnose und Behandlung. Leider können die derzeit verfügbaren Methoden die Blutgerinnselkomponente nicht umfassend quantitativ und qualitativ analysieren. Zum Beispiel kann die auf Martius Scarlett Blue basierende In-situ-Färbung nur die roten/weißen Blutkörperchen bestimmter Schnitte des Gerinnsels7 untersuchen. Die auf Immunhistochemie (IHC) basierende In-situ-Färbung kann nur begrenzte Blutbestandteile bestimmter Schnitte des Gerinnsels anhand ihrer Antikörper untersuchen8. Die mikroskopischen bildbasierten Methoden befassen sich nur mit der spezifischen Struktur des Gerinnsels9. Darüber hinaus sind all diese Methoden mühsam und zeitaufwändig10. Bisher wurden die Verfahren zur quantitativen und qualitativen Untersuchung von zerebralen Thrombenzellbestandteilen nicht beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, dass das vernetzte Fibrin die Blutzellen fest in die Gerinnsel einwickelt11. Folglich ist der spezifische Abbau des vernetzten Fibrins und die Freisetzung der intakten Zellen entscheidend für die genaue Analyse von Zellbestandteilen.
In früheren Arbeiten wurde ein fibrinolytisches Enzym aus Sipunculus nudus (sFE) isoliert, das das Fibrin spezifisch und schnell abbauen kann12. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Analyse der Zellkomponenten der zerebralen Thromben basierend auf der einzigartigen Aktivität von sFE vorgeschlagen. Dieses Protokoll nutzte sFE, um zuerst das Fibrin von Gerinnseln abzubauen, und analysierte dann die Zellbestandteile durch Wright-Färbung und routinemäßige Blutuntersuchung13,14. Mit dieser Methode können die Zellbestandteile von Hirnthromben quantitativ und qualitativ untersucht werden. Dieses einfache und effektive Protokoll könnte für die Zellkomponentenanalyse anderer Blutgerinnsel angewendet werden.
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Protocol
Die Forschung wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der medizinischen Ethikkommission der Universität Huaqiao durchgeführt. Die zerebralen Blutgerinnsel wurden chirurgisch entfernt und im Quanzhou First Hospital, das der Fujian Medical University angegliedert ist, mit dem Einverständnis der Patienten entnommen.
1. Vorbehandlung von Blutgerinnseln
- Geben Sie die Gerinnsel auf eine saubere Schale, fügen Sie 5 ml physiologische Kochsalzlösung mit einer Pinzette hinzu, schütteln Sie die Schale vorsichtig und entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Spülung dreimal. - Die Gerinnsel mit einer Schere in kleinere Stücke (kleiner als 5 mm x 5 mm x 5 mm) schneiden. Fügen Sie 5 ml physiologische Kochsalzlösung hinzu, schütteln Sie die Schale vorsichtig und entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer Pipette.
HINWEIS: Wiederholen Sie die Spülung dreimal. Stellen Sie sicher, dass während des Spülens keine Gerinnselstücke abgesaugt werden. - Übertragen Sie die Gerinnsel auf eine andere saubere U-Platte.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden (Platte bei 2-8 °C lagern) und später neu gestartet werden.
2. Thrombolyse
- Bereiten Sie die sFE-Arbeitslösung vor, indem Sie die sFE-Konzentration mit physiologischer Kochsalzlösung auf 2000 U/ml einstellen.
HINWEIS: Die sFE wurde nach den etablierten Protokollen von Tang Lab15 erstellt. - Geben Sie 300 μl sFE-Arbeitslösung in die vorbehandelten Gerinnsel.
- Führen Sie die erste Abbaurunde durch.
- Das Gemisch aus sFE und Gerinnseln wird bei 37 °C für 0,5 h inkubiert.
HINWEIS: Der mit physiologischer Kochsalzlösung behandelte Blot wurde als Negativkontrolle festgelegt. Drehen Sie die Probe nicht auf dem Schüttler. - Mischen Sie die Probe vorsichtig. Füllen Sie den flüssigen Teil mit einer sauberen Pipette in ein anderes sauberes Röhrchen.
HINWEIS: Die verbleibenden Gerinnsel wurden für eine weitere Abbaurunde verwendet. - Der flüssige Teil wird bei 200 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Den Überstand mit einer Pipette in ein anderes sauberes Röhrchen überführen, um die zurückgewonnene sFE-Lösung zu erhalten.
- Mischen Sie die Zellpräzipitation vorsichtig mit 50 μl physiologischer Kochsalzlösung.
HINWEIS: Die Zellmischung wurde für die spätere Verwendung bei 2-8 °C gelagert.
- Das Gemisch aus sFE und Gerinnseln wird bei 37 °C für 0,5 h inkubiert.
- Führen Sie eine anschließende Verschlechterung durch.
- Die verbleibenden Gerinnsel (Schritt 2.3.2) werden mit der gewonnenen sFE-Lösung (Schritt 2.3.4) bei 37 °C für 0,5 h abgebaut.
HINWEIS: Die Ruheschritte waren die gleichen wie bei der ersten Abbaurunde. Der Abbauprozess wurde beendet, bis die gesamten Gerinnsel abgebaut waren.
- Die verbleibenden Gerinnsel (Schritt 2.3.2) werden mit der gewonnenen sFE-Lösung (Schritt 2.3.4) bei 37 °C für 0,5 h abgebaut.
- Führen Sie die Zellsammlung durch.
- Bereiten Sie die Blutkörperchenprobe vor, indem Sie die Zellmischung jeder Abbaurunde sammeln.
3. Wright-Färbung
- Führen Sie einen Zellabstrich durch.
- Stellen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1 x 106 Zellen/ml ein.
- Geben Sie 5 μl der Zellen in den mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger und schmieren Sie sie dann mit dem Deckglas ein.
- Verdampfen Sie die Flüssigkeit bei Raumtemperatur.
- Führen Sie die Färbung durch.
- Geben Sie 200 μl Wright-Farbstoff (siehe Materialtabelle) vorsichtig in den Zellabstrich und fügen Sie 600 μl Wright-Farbstoff B hinzu, um ihn gleichmäßig zu mischen. 10 min bei Raumtemperatur einfärben.
- Spülen Sie die Farbe vorsichtig mit klarem Wasser ab.
HINWEIS: Der gefärbte Zellausstrich kann zur späteren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Führen Sie mikroskopische Bildgebung durch.
- Untersuchen Sie die gefärbten Zellen mit einem Lichtmikroskop (siehe Materialtabelle).
4. Routinemäßige Blutuntersuchung
- Stellen Sie die Zellen auf eine Dichte von 1 x 106 Zellen/ml ein.
- Analysieren Sie die Zellbestandteile wie Blutplättchen, Erythrozyten, weiße Blutkörperchen, Lymphozyten, Neutrophile, Monozyten, Eosinophile, Basophile und unreife Granulozyten mit einem Autohämatologie-Analysegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
In der Anfangsphase des Abbauprozesses wurde festgestellt, dass die Blutgerinnsel eine rote, kompakte Struktur aufwiesen und die Arbeitslösung farblos war. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten färbte sich die Arbeitslösung hellrot, was darauf hindeutete, dass die gekreuzten Blutzellen in die Arbeitslösung freigesetzt wurden. Die meisten Gerinnsel lösten sich auf, wenn die Inkubationszeit auf 5 h verlängert wurde, und die Arbeitslösung wurde hellrot. Im Gegenteil, es gab auch nach 10 h Inkubation keine signifikante Veränderung in der physiologischen Kochsalzgruppe (NC) (Abbildung 1). Diese Ergebnisse zeigten, dass die in den Gerinnseln eingeschlossenen Blutzellen durch dieses Protokoll erfolgreich freigesetzt wurden.
Nach der Wright-Färbung wurden die Zellbestandteile unter dem Lichtmikroskop deutlich untersucht (Abbildung 2A). Unter den freigesetzten Blutzellen konnte eine große Anzahl reifer roter Blutkörperchen mit leicht konkaven und scheibenförmigen Oberflächen beobachtet werden. Auf dem Objektträger, den Blutplättchen, die aus den Blutgerinnseln freigesetzt wurden, wurde eine große Menge unregelmäßig geformter kleiner violett-roter Partikel beobachtet. Die weißen Blutkörperchen wiesen ein größeres Plasma auf und kondensierten Kern. Verschiedene Arten von Granulozyten, wie reife neutrophile Granulozyten, Eosinophile und Monozyten, wurden ebenfalls beobachtet.
Mit Hilfe des Auto-Hämatologie-Analysators wurden die Zellbestandteile quantitativ analysiert. Unter den nachgewiesenen Zellen machten Thrombozyten 51,25 % bzw. 45,24 % der nachgewiesenen Zellen aus. Diese Daten stimmen mit den Ergebnissen der Wright-Färbung überein. Andere Blutzellen wie weiße Blutkörperchen, Lymphozyten, Neutrophile, Monozyten, Eosinophile, Basophile und unreife Granulozyten wurden ebenfalls nachgewiesen (Tabelle 1). Diesem Protokoll folgend, können die Zellbestandteile eines zerebralen Thrombus nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ untersucht werden.
Abbildung 1: Auflösungsprozess. Der zerebrale Thrombus wurde in der Kochsalzlösung (NC) bzw. in der sFE aufgelöst. Die Fotos wurden bei 0 h, 5 h und 10 h aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Mikroskopie und Durchflusszytometrie der freigesetzten Zellen. (A) Die Zellen unter dem Mikroskop nach Wrights Färbung. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Durchflusszytometrische Ergebnisse der freigesetzten Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Routinemäßige Blutuntersuchung | ||
| Parameter | Befund | Einheit |
| Absolute Anzahl der unreifen Granulozyten (IG#) | 1 | 109/L |
| Prozentsatz der unreifen Granulozyten (IG%) | 3.7 | % |
| Erythrozytenzahl (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Spezifisches Volumen der roten Blutkörperchen (HCT) | 13.7 | % |
| Mittleres korpuskuläres Volumen (MCV) | 90.1 | F1 |
| Zahl der weißen Blutkörperchen (Leukozyten) | 26.98 | 109/L |
| Anzahl der Lymphozyten (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Lymphozyten-Anteil (LYM%) | 5.2 | % |
| Anzahl der Neutrophilen (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Anteil der neutrophilen Granulozyten (Neu%) | 89.2 | % |
| Anzahl der Monozyten (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Monozytenanteil (Mon%) | 3.8 | % |
| Anzahl der Eosinophilen (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Anteil der Eosinophilen (Eos%) | 1.3 | % |
| Anzahl der Basophilen (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Basophiler Anteil (Bas%) | 0.5 | % |
| Thrombozytenzahl (PLT) | 1722 | 109/L |
| Mittleres Thrombozytenvolumen (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabelle 1: Routinemäßige Blutuntersuchung.
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Discussion
sFE ist ein fibrinolytisches Mittel, das das Fibrin direkt und effektiv abbauen kann12,16. Hier wurde sFE eingesetzt, um das vernetzte Fibrin der zerebralen Blutgerinnsel abzubauen, die eingeschlossenen Zellen innerhalb der Gerinnsel freizusetzen und die Zellbestandteile der Gerinnsel qualitativ und quantitativ zu analysieren. Die mikroskopischen Daten und die routinemäßige Blutuntersuchung zeigten, dass die eingeschlossenen Zellen aus den Blutgerinnseln freigesetzt wurden. Darüber hinaus wurden die Zelltypen und Strukturen der freigesetzten Zellen nach der sFE-Behandlung nicht signifikant beeinflusst. Damit wurde erstmals eine einzigartige, einfache und effektive Methode zur Analyse der Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln geschaffen.
Da die freigesetzten Zellen nicht so stabil sind wie innerhalb der Gerinnsel, müssen die Abbaubedingungen optimiert werden, um das gebrochene Verhältnis der freigesetzten Zellen zu verringern, wie z. B. Temperatur, sFE-Dosis, Rotationsgeschwindigkeit und Abbauzeit. Wrights Färbeergebnisse zeigten, dass der Hintergrund der 10-stündigen Degradation trüber war als der der 5-stündigen. Diese Unterschiede sind wahrscheinlich auf Zelltrümmer und andere Zellfragmente zurückzuführen. Darüber hinaus zeigten die Daten der Durchflusszytometrie, dass die Zelltrümmer mit der Abbauzeit zunahmen (Abbildung 2B). Die Zelltrümmerrate von 10 h Abbau (32,5%) war signifikant höher als die von 5 h Abbau (11,2%). Daher war es wichtig, die freigesetzten Zellen so schnell wie möglich von der Arbeitslösung zu trennen. In dieser Studie wurden die Zellen also alle 0,5 h gesammelt. Ein weiterer wichtiger Punkt war die Rotation, die zwar den Abbau beschleunigen könnte, aber schlecht für die Erhaltung der intakten Zellstruktur der freigesetzten Zellen ist.
Obwohl die Abbaubedingungen optimiert wurden, können einige Zellen in diesem Prozess lysiert werden. Zelltrümmer können für die Zellmikroskopie und die routinemäßige Blutuntersuchung nachteilig sein17. Daher wird empfohlen, diese Zelltrümmer von den intakten Zellen zu trennen. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die Möglichkeit der Kontamination durch Mikroben. Der Grund für dieses Phänomen ist wahrscheinlich die lange Abbauzeit in Verbindung mit dem unsterilen Betrieb. Daher sollten in zukünftigen Studien einige geeignete Antibiotika hinzugefügt werden18. Es ist bekannt, dass verschiedene Blutgerinnsel ähnliche Gerinnselstrukturen aufweisen. Somit wird das hier beschriebene Protokoll für die Analyse von Zellbestandteilen anderer Blutgerinnsel geeignet sein. Darüber hinaus konnten mit Hilfe dieser Technik nicht nur die Zellbestandteile, sondern auch das Plasma mit den Gerinnseln qualitativ und quantitativ analysiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Wissenschafts- und Technologiebüro der Stadt Xiamen (3502Z20227197) und dem Wissenschafts- und Technologiebüro der Provinz Fujian (Nr. 2019J01070, Nr. 2021Y0027) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
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