Summary
Denne studien beskriver en rask og effektiv metode for cellekomponentanalyse av cerebrale blodpropper gjennom blodproppoppløsning, cellefarging og rutinemessig blodundersøkelse.
Abstract
Cerebral trombose, en blodpropp i en cerebral arterie eller vene, er den vanligste typen hjerneinfarkt. Studien av cellekomponentene i cerebral blodpropp er viktig for diagnose, behandling og prognose. Imidlertid er de nåværende tilnærmingene til å studere cellekomponentene i blodproppene hovedsakelig basert på in situ-farging , noe som er uegnet for omfattende studier av cellekomponentene fordi cellene er tett pakket inn i blodproppene. Tidligere studier har vellykket isolert et fibrinolytisk enzym (sFE) fra Sipunculus nudus, som kan nedbryte den tverrbundne fibrin direkte og frigjøre cellekomponentene. Denne studien etablerte en omfattende metode basert på sFE for å studere cellekomponentene i cerebral trombus. Denne protokollen inkluderer blodproppoppløsning, cellefrigjøring, cellefarging og rutinemessig blodundersøkelse. Ifølge denne metoden kunne cellekomponentene studeres kvantitativt og kvalitativt. De representative resultatene av eksperimenter ved hjelp av denne metoden er vist.
Introduction
Cerebrovaskulær sykdom er en av tre store sykdommer som kan true menneskers helse, blant annet iskemisk cerebrovaskulær sykdom står for mer enn 80%. Cerebral trombose og cerebral venetrombose er de mest bekymrede iskemiske cerebrovaskulære sykdommene i dag, hovedsakelig forårsaket av cerebrale blodpropper 1,2. Dersom behandlingen ikke gjøres riktig, vil den ha høy invaliditets- og dødelighet og høyt tilbakefall etter utskrivning3.
Nylig har et økende antall studier vist at cellekomponentene i cerebral blodpropp er tett korrelert med diagnosen, behandlingen og prognosen av cerebral trombose 4,5,6. Derfor er tilgjengeligheten av data om trombussammensetning, spesielt cellekomponentene, viktig for klinisk diagnose og behandling. Dessverre kan de tilgjengelige metodene ikke analysere blodproppkomponenten kvantitativt og kvalitativt. For eksempel kan Martius Scarlett Blue-basert in situ-farging bare studere de røde / hvite blodcellene i visse skiver av blodproppen7. Immunhistokjemi (IHC) basert in situ farging kan bare studere begrensede blodkomponenter av visse skiver av blodproppen ved hjelp av antistoffene8. De mikroskopiske bildebaserte metodene er bare opptatt av den spesifikke strukturen til blodproppen9. Dessuten er alle disse metodene arbeidskrevende og tidkrevende10. Hittil har prosedyrene for kvantitativt og kvalitativt studier av cerebrale trombiske cellekomponenter ikke blitt rapportert. Det er allment anerkjent at den tverrbundne fibrin tett pakker blodcellene i blodproppene11. Følgelig er den spesifikke nedbrytningen av det tverrbundne fibrin og frigjøring av de intakte cellene kritisk for nøyaktig analyse av cellekomponenter.
Tidligere arbeider isolerte et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus (sFE), som kan nedbryte fibrin spesifikt og raskt12. Her ble det foreslått en metode for å analysere cellekomponentene i hjernetrombi basert på den unike aktiviteten til sFE. Denne protokollen benyttet sFE til å nedbryte fibrin av blodpropper først og deretter analysert cellekomponentene ved Wrights farging og rutinemessig blodundersøkelse13,14. Ifølge denne metoden kan cellekomponentene i cerebral trombi studeres kvantitativt og kvalitativt. Denne enkle og effektive protokollen kan brukes for cellekomponentanalyse av andre blodpropper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene fra Medical Ethics Committee of Huaqiao University. De cerebrale blodproppene ble kirurgisk fjernet og samlet inn ved Quanzhou First Hospital, tilknyttet Fujian Medical University, med informert samtykke fra pasientene.
1. Forbehandling av blodpropp
- Legg blodproppene på et rent fat, tilsett 5 ml fysiologisk saltvann med en pinsett, rist fatet forsiktig og fjern saltvannet med en pipette.
MERK: Gjenta skyllingen tre ganger. - Klipp blodproppene i mindre biter (mindre enn 5 mm x 5 mm x 5 mm) med en saks. Tilsett 5 ml fysiologisk saltvann, rist fatet forsiktig og fjern saltvannet med en pipette.
MERK: Gjenta skyllingen tre ganger. Forsikre deg om at ingen koagulasjonsbiter aspireres under skyllingen. - Overfør blodproppene til en annen ren U-plate.
MERK: Protokollen kan settes på pause her (oppbevar platen ved 2-8 °C) og startes på nytt senere.
2. Trombolyse
- Forbered sFE-arbeidsløsningen ved å justere konsentrasjonen av sFE til 2000 U / ml med fysiologisk saltvann.
MERK: sFE ble utarbeidet i henhold til de veletablerte protokollene til Tang Lab15. - Tilsett 300 μL sFE arbeidsoppløsning i de forbehandlede blodproppene.
- Utfør den første runden med nedbrytning.
- Inkuber blandingen av sFE og blodpropper ved 37 °C i 0,5 timer.
MERK: Blotet behandlet med fysiologisk saltvann ble satt som negativ kontroll. Ikke roter prøven på shakeren. - Bland prøven forsiktig. Overfør væskedelen til et annet rent rør med en ren pipette.
MERK: De resterende blodproppene ble brukt til en ny runde med nedbrytning. - Sentrifuger væskedelen ved 200 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et annet rent rør med en pipette for å oppnå den gjenvunnede sFE-oppløsningen.
- Bland celleutfellingen med 50 μL fysiologisk saltvann forsiktig.
MERK: Celleblandingen ble lagret 2-8 °C for senere bruk.
- Inkuber blandingen av sFE og blodpropper ved 37 °C i 0,5 timer.
- Utfør etterfølgende nedbrytning.
- Bryt ned de resterende vuggene (trinn 2.3.2) med den gjenvunnede sFE oppløsningen (trinn 2.3.4) ved 37 °C i 0,5 timer.
MERK: Hviletrinnene var de samme som den første degraderingsrunden. Nedbrytningsprosessen ble avsluttet til hele blodproppene var nedbrutt.
- Bryt ned de resterende vuggene (trinn 2.3.2) med den gjenvunnede sFE oppløsningen (trinn 2.3.4) ved 37 °C i 0,5 timer.
- Utfør celleinnsamling.
- Forbered blodcelleprøven ved å samle celleblandingen av hver nedbrytningsrunde.
3. Wrights farging
- Utfør cellesmøring.
- Juster celler til en tetthet på 1 x 106 celler / ml.
- Tilsett 5 μL av cellene til poly-L-lysinbelagt glassglass, og smør dem deretter med dekselet.
- Fordamp væsken ved romtemperatur.
- Utfør fargingen.
- Tilsett 200 μL av Wrights fargestoff (se materialfortegnelse) til celleutstryket forsiktig, og tilsett 600 μL Wrights fargestoff B for å blande jevnt. Beis i 10 min ved romtemperatur.
- Skyll fargestoffet forsiktig med rent vann.
MERK: Det fargede celleutstryket kan oppbevares ved romtemperatur for senere bruk.
- Utfør mikroskopisk avbildning.
- Undersøk de fargede cellene ved hjelp av et lysmikroskop (se materialfortegnelse).
4. Rutinemessig blodundersøkelse
- Juster celler til en tetthet på 1 x 106 celler / ml.
- Analyser cellekomponentene som blodplater, erytrocytter, hvite blodlegemer, lymfocytter, nøytrofiler, monocytter, eosinofiler, basofiler og umodne granulocytter ved hjelp av en autohematologianalysator i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den første fasen av nedbrytningsprosessen ble det funnet at blodproppene hadde en rød kompakt struktur, og arbeidsløsningen var fargeløs. Etter inkubering i 30 minutter ble arbeidsløsningen lys rød, noe som indikerte at de kryssede blodcellene ble frigjort i arbeidsløsningen. De fleste blodpropper ble oppløst ved forlengelse av inkubasjonstiden til 5 timer, og arbeidsløsningen ble lysrød. Tvert imot var det ingen signifikant endring i den fysiologiske saltvannsgruppen (NC) selv etter 10 timers inkubasjon (figur 1). Disse resultatene viste at blodcellene innelukket i blodproppene ble frigjort vellykket av denne protokollen.
Etter Wrights flekk ble cellekomponentene undersøkt tydelig under et lysmikroskop (figur 2A). Blant de frigjorte blodcellene kunne et stort antall modne røde blodlegemer med litt konkave og skiveformede overflater observeres. En stor mengde uregelmessig formede små lillarøde partikler ble observert på glassglasset, som var blodplatene som ble frigjort fra blodproppene. De hvite blodcellene viste større plasma og kondensert kjernefysisk. Flere typer granulocytter, som moden nøytrofil granulocytt, eosinofil og monocytt, ble også observert.
Ved hjelp av autohematologisk analysator ble cellekomponentene analysert kvantitativt. Blant de oppdagede cellene utgjorde blodplater og erytrocytter henholdsvis 51,25% og 45,24%. Disse dataene stemmer overens med resultatene av Wrights flekk. Det ble også påvist andre blodceller, som hvite blodlegemer, lymfocytter, nøytrofiler, monocytter, eosinofiler, basofile celler og umodne granulocytter (tab 1). Således, etter denne protokollen, kan cellekomponentene i en cerebral trombus studeres ikke bare kvalitativt, men også kvantitativt.
Figur 1: Oppløsningsprosess. Trombe i cerebrigt vann (NC) og sFE ble oppløst i henholdsvis saltvann (NC) og sFE. Fotograferingen ble tatt ved 0 timer, 5 timer og 10 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Mikroskopi og flowcytometri av de frigjorte cellene. (A) Cellene under mikroskopet etter Wrights farging. Skala bar = 20 μm. (B) Flow cytometri resultater av de frigjorte cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Rutinemessig blodprøve | ||
| Parametere | Resultater | Enhet |
| Umodent granulocytt absolutt antall (IG#) | 1 | 109/L |
| Umoden granulocyttprosent (IG%) | 3.7 | % |
| Antall erytrocytter (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Røde blodlegemer spesifikt volum (HCT) | 13.7 | % |
| Gjennomsnittlig korpuskulært volum (MCV) | 90.1 | F1 |
| Antall hvite blodlegemer (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Antall lymfocytter (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Lymfocytter prosent (LYM%) | 5.2 | % |
| Nøytrofiltall (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Nøytrofile prosent (Neu%) | 89.2 | % |
| Monocytter nummer (man #) | 1.02 | 109/L |
| Monocytter prosent (Mon%) | 3.8 | % |
| Eosinofilnummer (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Eosinofil prosent (Eos%) | 1.3 | % |
| Basofil nummer (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Basofil prosentandel (Bas%) | 0.5 | % |
| blodplatetall (PLT) | 1722 | 109/L |
| Gjennomsnittlig blodplatevolum (MPV) | 11.6 | F1 |
Tabell 1: Rutinemessig blodprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE er et fibrinolytisk middel som kan nedbryte fibrin direkte og effektivt12,16. Her ble sFE brukt til å nedbryte den tverrbundne fibrin av cerebrale blodpropper, frigjøre de lukkede cellene i blodproppene og analysere cellekomponentene i blodproppene kvalitativt og kvantitativt. Mikroskopidata og rutinemessig blodprøve tydet på at de lukkede cellene ble frigjort fra blodproppene. Videre ble celletyper og strukturer av de frigjorte cellene ikke påvirket signifikant etter sFE-behandling. Dermed ble en unik, enkel og effektiv metode opprettet for første gang for å analysere cellekomponentene i cerebrale blodpropper.
Fordi de frigjorte cellene ikke er like stabile som i blodproppene, må nedbrytningsbetingelsene optimaliseres for å redusere det ødelagte forholdet mellom frigjorte celler, for eksempel temperatur, dosen av sFE, rotasjonshastighet og nedbrytningstid. Wrights fargeresultater viste at bakgrunnen for 10 timers nedbrytningen var mer overskyet enn den på 5 timer. Disse forskjellene skyldes sannsynligvis cellerester og andre cellefragmenter. Videre indikerte flowcytometridataene at cellerestene økte med nedbrytningstiden (figur 2B). Celleavfallshastigheten på 10 timers nedbrytning (32,5%) var signifikant høyere enn 5 timers nedbrytning (11,2%). Derfor var det avgjørende å skille de frigjorte cellene fra arbeidsløsningen så snart som mulig. Så i denne studien ble cellene samlet hver 0,5 time. Et annet sentralt punkt var rotasjonen, som kan akselerere nedbrytning, men er dårlig for å holde den intakte cellestrukturen til de frigjorte cellene.
Selv om nedbrytningsforholdene er optimalisert, kan noen celler lyseres i denne prosessen. Celleavfall kan være ugunstig for cellemikroskopi og rutinemessig blodundersøkelse17. Derfor anbefales det å skille disse cellerestene fra de intakte cellene. En annen begrensning av denne teknikken er muligheten for mikrobe forurensning. Den bakenforliggende årsaken til dette fenomenet er trolig den lange nedbrytningstiden i par med den ikke-sterile operasjonen. Så noen egnede antibiotika bør legges til i fremtidige studier18. Det er velkjent at forskjellige blodpropper deler lignende blodpropperstrukturer. Dermed vil protokollen rapportert her være egnet for cellekomponentanalyse av andre blodpropper. Videre, ved hjelp av denne teknikken, kunne ikke bare cellekomponentene, men også plasmaet med blodproppene analyseres kvalitativt og kvantitativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197), og Science and Technology Bureau of Fujian Province (nr. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
