Summary
この研究では、血栓の溶解、細胞染色、および定期的な血液検査による脳血栓の細胞成分分析のための迅速かつ効果的な方法について説明します。
Abstract
脳動脈や静脈に血栓ができる脳血栓症は、脳梗塞の最も一般的なタイプです。脳血栓の細胞成分の研究は、診断、治療、および予後にとって重要です。しかし、血栓の細胞成分を研究するための現在のアプローチは、主に in situ 染色に基づいており、細胞が血栓にしっかりと包まれているため、細胞成分の包括的な研究には適していません。これまでの研究では、 Sipunculus nudusから線溶酵素(sFE)を単離することに成功しており、架橋されたフィブリンを直接分解して細胞成分を放出することができます。本研究により、sFEに基づく脳血栓の細胞成分を網羅的に調べる方法を確立した。このプロトコルには、血栓溶解、細胞解放、細胞染色、および定期的な血液検査が含まれます。この方法によれば、細胞成分を定量的および定性的に研究することができる。この手法を用いた実験の代表的な結果を示す。
Introduction
脳血管疾患は、人間の健康を脅かす可能性のある3大疾患の1つであり、そのうち虚血性脳血管疾患は80%以上を占めています。脳血栓症と脳静脈血栓症は、主に脳血栓によって引き起こされる、今日最も懸念されている虚血性脳血管疾患です1,2。治療が適切に行われないと、障害率や死亡率が高くなり、退院後の再発率も高くなります3。
近年、脳血栓の細胞成分が脳血栓症の診断、治療、予後と密接な相関関係にあることを示す研究が増えています4,5,6。したがって、血栓組成、特に細胞成分に関するデータの可用性は、臨床診断と治療にとって重要です。残念ながら、現在利用可能な方法では、血栓成分を定量的にも定性的にも包括的に分析することはできません。例えば、Martius Scarlett Blueベースのin-situ染色では、血栓の特定のスライスの赤血球/白血球しか調べることができません7。免疫組織化学(IHC)に基づくin-situ染色では、抗体を用いて血栓の特定のスライスの限られた血液成分しか研究できません8。顕微鏡画像ベースの方法は、血栓9の特定の構造にのみ関係しています。さらに、これらの方法はすべて手間と時間がかかります10.現在まで、脳血栓細胞成分を定量的および定性的に研究するための手順は報告されていません。架橋されたフィブリンが血栓11内の血球をしっかりと包み込むことは広く認められている。したがって、架橋されたフィブリンの特異的な分解と無傷の細胞の放出は、細胞成分の正確な分析にとって重要です。
以前の研究では、シプンクルス・ヌーダス(sFE)から線溶酵素を単離し、フィブリンを特異的かつ迅速に分解することができます12。本明細書では、sFEの特異な活性に基づいて脳血栓の細胞成分を分析する方法が提案された。このプロトコルは血栓のフィブリンを最初に低下させるのにsFEを利用し、次にライトの汚損および定期的な血液検査13,14によって細胞部品を分析した。この方法によれば、脳血栓の細胞成分を定量的および定性的に研究することができる。このシンプルで効果的なプロトコルは、他の血栓の細胞成分分析にも適用できます。
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Protocol
この研究は、華橋大学の医療倫理委員会の機関ガイドラインに準拠して行われました。脳血栓は外科的に除去され、福建医科大学附属泉州第一病院で、患者のインフォームドコンセントを得て採取された。
1.血栓の前処理
- 血栓を清潔な皿の上に置き、ピンセットで生理食塩水5mLを加え、皿を静かに振って、ピペットで生理食塩水を取り除きます。
注意: すすぎを3回繰り返します。 - はさみで血栓を小さく切ります(5mm x 5mm x 5mm未満)。生理食塩水5mLを加え、皿を軽く振って、ピペットで生理食塩水を取り除きます。
注意: すすぎを3回繰り返します。すすぎ中に血栓片が吸引されていないことを確認してください。 - 血栓を別のきれいなUプレートに移します。
注:プロトコルはここで一時停止し(プレートを2〜8°Cで保存)、後で再起動できます。
2.血栓溶解
- 生理食塩水でsFEの濃度を2000 U/mLに調整して、sFEワーキング溶液を調製します。
注:sFEは、Tang Lab15の確立されたプロトコルに従って調製されました。 - 前処理した血栓に300μLのsFE作動溶液を加えます。
- 最初の劣化ラウンドを実行します。
- sFEと血栓の混合物を37°Cで0.5時間インキュベートします。
注:生理食塩水で処理したブロットは、ネガティブコントロールとして設定しました。シェーカーでサンプルを回転させないでください。 - サンプルを穏やかに混合します。液体部分を清潔なピペットで別の清潔なチューブに移します。
注:残りの血栓は、別の分解ラウンドに使用されました。 - 液体部分を200× g で4°Cで5分間遠心分離します。
- 上清をピペットで別の清潔なチューブに移し、回収したsFE溶液を得ます。
- 細胞沈殿物を50μLの生理食塩水と穏やかに混合します。
注:細胞混合物は、後で使用するために2〜8°Cで保存しました。
- sFEと血栓の混合物を37°Cで0.5時間インキュベートします。
- その後の劣化を実行します。
- 残りの血栓を回収したsFE溶液(ステップ2.3.4)で37°Cで0.5時間分解します(ステップ2.3.2)。
注:残りの手順は、最初の劣化ラウンドと同じです。凝固全体が分解されるまで分解プロセスが終了しました。
- 残りの血栓を回収したsFE溶液(ステップ2.3.4)で37°Cで0.5時間分解します(ステップ2.3.2)。
- 細胞の採取を行います。
- 分解の各ラウンドの細胞混合物を採取して、血球サンプルを調製します。
3.ライトの染色
- 細胞塗抹標本を実行します。
- 細胞の密度を 1 x 106 cells/mL に調整します。
- ポリLリジンでコーティングしたスライドガラスに細胞5 μLを加え、カバースリップを使用して塗抹標本します。
- 室温で液体を蒸発させます。
- 染色を行います。
- 200 μLのWright色素( 材料表を参照)を細胞塗抹標本に穏やかに加え、600 μLのWright色素Bを加えて均一に混合します。 室温で10分間染色します。
- 染料をきれいな水でやさしく洗い流します。
注:染色された細胞塗抹標本は、後で使用するために室温で保存できます。
- 顕微鏡イメージングを実行します。
- 染色した細胞を光学顕微鏡で調べます( 材料表を参照)。
4.定期的な血液検査
- 細胞の密度を 1 x 106 cells/mL に調整します。
- 血小板、赤血球、白血球、リンパ球、好中球、単球、好酸球、好塩基球、未熟顆粒球などの細胞成分を、メーカーの指示に従って自己血液分析装置で分析します( 材料表参照)。
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Representative Results
分解プロセスの初期段階では、血栓が赤い緻密な構造をしており、作業溶液は無色であることがわかりました。30分間インキュベートした後、作業溶液は淡赤色に変化し、交差した血球が作業溶液中に放出されたことを示しました。インキュベーション時間を5時間に延長するとほとんどの血栓が溶解し、作業溶液は淡赤色になった。それどころか、10時間のインキュベーション後も生理食塩水群(NC)に有意な変化はありませんでした(図1)。これらの結果は、血栓に封入された血球が、このプロトコルによって正常に放出されることを示しました。
ライト染色後、細胞成分を光学顕微鏡ではっきりと調べました(図2A)。放出された血球の中には、表面がわずかに凹んで円盤状の成熟した赤血球が多数観察されました。スライドガラス上には、血栓から放出された血小板である赤紫色の不規則な形状の小さな粒子が大量に観察されました。白血球はより大きな血漿と凝縮した核を示しました。成熟好中球顆粒球、好酸球、単球など、数種類の顆粒球も観察されました。
自動血液分析装置の助けを借りて、細胞成分を定量的に分析しました。検出された細胞のうち、血小板と赤血球はそれぞれ51.25%と45.24%を占めました。これらのデータは、ライト染色の結果と一致しています。白血球、リンパ球、好中球、単球、好酸球、好塩基球、未熟顆粒球などの他の血球も検出されました(表1)。したがって、このプロトコルに続いて、脳血栓の細胞成分を定性的にだけでなく定量的にも調査することができます。
図1:溶解プロセス。 脳血栓は、それぞれ生理食塩水(NC)とsFEに溶解しました。写真撮影は0時、5時、10時で行いました。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:放出された細胞の顕微鏡検査とフローサイトメトリー 。 (A)ライト染色後の顕微鏡下の細胞。スケールバー = 20 μm。 (B)放出細胞のフローサイトメトリー結果。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 定期的な血液検査 | ||
| パラメーター | 業績 | 単位 |
| 未熟顆粒球絶対数(IG#) | 1 | 109/L |
| 未熟な顆粒球の割合(IG%) | 3.7 | % |
| 赤血球数(RBC) | 1.52 | 1012/L |
| 赤血球比体積(HCT) | 13.7 | % |
| 平均赤血球容積(MCV) | 90.1 | F1キー |
| 白血球数(WBC) | 26.98 | 109/L |
| リンパ球数(LYM) | 1.41 | 109/L |
| リンパ球の割合(LYM%) | 5.2 | % |
| 好中球数(Neu#) | 24.08 | 109/L |
| 好中球率(Neu%) | 89.2 | % |
| 単球数(Mon#) | 1.02 | 109/L |
| 単球の割合(月%) | 3.8 | % |
| 好酸球数(Eos#) | 0.34 | 109/L |
| 好酸球の割合(Eos%) | 1.3 | % |
| 好塩基球数(Bas#) | 0.13 | 109/L |
| 好塩基球の割合(Bas%) | 0.5 | % |
| 血小板数(PLT) | 1722 | 109/L |
| 平均血小板体積(MPV) | 11.6 | F1キー |
表1:定期的な血液検査。
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Discussion
sFEは、フィブリンを直接かつ効果的に分解することができる線溶剤である12,16。ここでは、sFEを用いて、脳血栓の架橋フィブリンを分解し、血栓内の封入細胞を遊離させ、血栓の細胞成分を定性的および定量的に分析しました。顕微鏡データと定期的な血液検査により、同封された細胞が血栓から放出されたことが示されました。さらに、放出された細胞の細胞型および構造は、sFE処理後に有意な影響を受けなかった。こうして、脳血栓の細胞成分を分析するためのユニークで簡便かつ効果的な方法が初めて生み出された。
放出された細胞は血栓内ほど安定していないため、温度、sFEの投与量、回転速度、分解時間など、放出された細胞の分解率を低下させるには、分解条件を最適化する必要があります。ライトの染色結果は、10時間の分解の背景が5時間のそれよりも曇っていることを示しました。これらの違いは、おそらく細胞の破片やその他の細胞断片によるものです。さらに、フローサイトメトリーデータでは、細胞の破片が分解時間とともに増加していることが示されました(図2B)。10時間分解の細胞破片率(32.5%)は、5時間分解の細胞破片率(11.2%)よりも有意に高かった。したがって、放出された細胞を作業溶液からできるだけ早く分離することが重要でした。そのため、この研究では、細胞を0.5時間ごとに収集しました。もう一つの重要なポイントは回転で、これは分解を加速させる可能性がありますが、放出された細胞の細胞構造をそのまま維持するには不利です。
分解条件は最適化されていますが、このプロセスで一部の細胞が溶解する可能性があります。細胞破片は、細胞顕微鏡検査や定期的な血液検査に悪影響を及ぼす可能性があります17。したがって、これらの細胞破片を無傷の細胞から分離することをお勧めします。この技術のもう一つの限界は、微生物汚染の可能性である。この現象の根本的な理由は、おそらく非滅菌操作と相まって長い分解時間です。したがって、いくつかの適切な抗生物質は、将来の研究で追加する必要があります18。異なる血栓が類似した血栓構造を共有していることはよく知られています。したがって、ここで報告するプロトコルは、他の血栓の細胞成分分析に適しています。さらに、この技術の助けを借りて、細胞成分だけでなく、血栓のある血漿も定性的および定量的に分析することができました。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、厦門市科学技術局(3502Z20227197)と福建省科学技術局(No.2019J01070、No.2021Y0027)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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