Summary
Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.
Abstract
A trombose cerebral, um coágulo sanguíneo em uma artéria ou veia cerebral, é o tipo mais comum de infarto cerebral. O estudo dos componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais é importante para o diagnóstico, tratamento e prognóstico. No entanto, as abordagens atuais para estudar os componentes celulares dos coágulos são baseadas principalmente na coloração in situ , o que é inadequado para o estudo abrangente dos componentes celulares porque as células estão firmemente envolvidas nos coágulos. Estudos anteriores conseguiram isolar uma enzima fibrinolítica (FEs) de Sipunculus nudus, que pode degradar diretamente a fibrina reticulada, liberando os componentes celulares. Este estudo estabeleceu um método abrangente baseado na FEF para estudar os componentes celulares do trombo cerebral. Esse protocolo inclui dissolução de coágulos, liberação de células, coloração de células e exame de sangue de rotina. De acordo com esse método, os componentes celulares puderam ser estudados quantitativa e qualitativamente. Os resultados representativos dos experimentos que utilizam este método são mostrados.
Introduction
A doença cerebrovascular é uma das três principais doenças que podem ameaçar a saúde humana, dentre as quais a doença cerebrovascular isquêmica é responsável por mais de 80%. A trombose cerebral e a trombose venosa cerebral são as doenças isquêmicas cerebrovasculares mais afetadas na atualidade, causadas principalmente por coágulos sanguíneoscerebrais1,2. Se o tratamento não for feito adequadamente, terá altas taxas de incapacidade e mortalidade e alta taxa de recorrência após a altahospitalar3.
Recentemente, um número crescente de estudos tem demonstrado que os componentes celulares dos coágulos sanguíneos cerebrais estão estreitamente correlacionados com o diagnóstico, tratamento e prognóstico da trombosecerebral4,5,6. Portanto, a disponibilidade de dados sobre a composição do trombo, especialmente os componentes celulares, é importante para o diagnóstico clínico e tratamento. Infelizmente, os métodos atualmente disponíveis não podem analisar quantitativa e qualitativamente o componente do coágulo sanguíneo. Por exemplo, a coloração in situ baseada em Martius Scarlett Blue só pode estudar os glóbulos vermelhos/brancos de certas fatias do coágulo7. A coloração in situ baseada em imuno-histoquímica (IHQ) só pode estudar componentes sanguíneos limitados de certos cortes do coágulo usando seus anticorpos8. Os métodos microscópicos baseados em imagens preocupam-se apenas com a estrutura específica do coágulo9. Além disso, todos esses métodos são trabalhosos e demorados10. Até o momento, os procedimentos para estudo quantitativo e qualitativo dos componentes das células dos trombos cerebrais não foram relatados. É amplamente reconhecido que a fibrina reticulada envolve firmemente as células sanguíneas nos coágulos11. Consequentemente, a degradação específica da fibrina reticulada e a liberação das células intactas são críticas para a análise precisa dos componentes celulares.
Trabalhos anteriores isolaram uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE), que pode degradar a fibrina específica e rapidamente12. Neste trabalho, foi proposto um método para analisar os componentes celulares dos trombos cerebrais baseado na atividade única da FEs. Esse protocolo utilizou o FE para degradar primeiramente a fibrina dos coágulos e, em seguida, analisou os componentes celulares pela coloração de Wright e exame de sangue de rotina13,14. De acordo com esse método, os componentes celulares dos trombos cerebrais podem ser estudados quantitativa e qualitativamente. Este protocolo simples e eficaz pode ser aplicado para a análise de componentes celulares de outros coágulos sanguíneos.
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Protocol
A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais do Comitê de Ética Médica da Universidade de Huaqiao. Os coágulos sanguíneos cerebrais foram removidos cirurgicamente e coletados no Quanzhou First Hospital, afiliado à Fujian Medical University, com consentimento informado dos pacientes.
1. Pré-tratamento do coágulo sanguíneo
- Coloque os coágulos em um prato limpo, adicione 5 mL de soro fisiológico com um tweezer, agite o prato suavemente e retire o soro fisiológico com uma pipeta.
NOTA: Repita o enxágue três vezes. - Corte os coágulos em pedaços menores (menores que 5 mm x 5 mm x 5 mm) com uma tesoura. Adicione 5 mL de soro fisiológico, agite o prato suavemente e retire o soro fisiológico com uma pipeta.
NOTA: Repita o enxágue três vezes. Certifique-se de que nenhum pedaço de coágulo seja aspirado durante o enxágue. - Transfira os coágulos para outra placa em U limpa.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui (armazenar a placa a 2-8 °C) e reiniciado mais tarde.
2. Trombólise
- Preparar a solução de trabalho de sFE ajustando a concentração de sFE para 2000 U/mL com soro fisiológico.
NOTA: A FE foi preparada de acordo com os protocolos bem estabelecidos do Tang Lab15. - Adicionar 300 μL de solução de trabalho de sFE aos coágulos pré-tratados.
- Realizar a primeira rodada de degradação.
- Incubar a mistura de sFE e coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
OBS: O blot tratado com soro fisiológico foi definido como controle negativo. Não gire a amostra no agitador. - Misture a amostra delicadamente. Transfira a parte líquida para outro tubo limpo com uma pipeta limpa.
NOTA: Os coágulos restantes foram usados para outra rodada de degradação. - Centrifugar a parte líquida a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
- Transfira o sobrenadante para outro tubo limpo com uma pipeta para obter a solução de sFE recuperada.
- Misture suavemente a precipitação celular com 50 μL de solução salina fisiológica.
NOTA: A mistura celular foi armazenada a 2-8 °C para uso posterior.
- Incubar a mistura de sFE e coágulos a 37 °C durante 0,5 h.
- Executar a degradação subsequente.
- Degradar os coágulos restantes (passo 2.3.2) com a solução de sFE recuperada (passo 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 horas.
NOTA: As etapas de descanso foram as mesmas da primeira rodada de degradação. O processo de degradação foi finalizado até que todos os coágulos fossem degradados.
- Degradar os coágulos restantes (passo 2.3.2) com a solução de sFE recuperada (passo 2.3.4) a 37 °C durante 0,5 horas.
- Executar a coleta de células.
- Preparar a amostra de células sanguíneas coletando a mistura celular de cada rodada de degradação.
3. Coloração de Wright
- Realizar esfregaço celular.
- Ajustar as células a uma densidade de 1 x 106 células/mL.
- Adicione 5 μL das células à lâmina de vidro revestida de lisina poli-L e, em seguida, esfregue-as usando a folha de cobertura.
- Evaporar o líquido à temperatura ambiente.
- Realizar a coloração.
- Adicione 200 μL do corante de Wright (ver Tabela de Materiais) ao esfregaço celular suavemente e adicione 600 μL do corante B de Wright para misturar uniformemente. Manchar por 10 min em temperatura ambiente.
- Enxágue o corante suavemente com água limpa.
NOTA: O esfregaço celular corado pode ser armazenado à temperatura ambiente para uso posterior.
- Realizar imagens microscópicas.
- Examine as células coradas usando um microscópio de luz (ver Tabela de Materiais).
4. Exame de sangue de rotina
- Ajustar as células a uma densidade de 1 x 106 células/mL.
- Analise os componentes celulares como plaquetas, eritrócitos, glóbulos brancos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e granulócitos imaturos usando um analisador de auto-hematologia de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Na fase inicial do processo de degradação, verificou-se que os coágulos sanguíneos tinham uma estrutura compacta vermelha, e a solução de trabalho era incolor. Após a incubação por 30 min, a solução de trabalho ficou vermelha clara, o que indicou que as células sanguíneas cruzadas foram liberadas na solução de trabalho. A maioria dos coágulos foi dissolvida ao prolongar o tempo de incubação para 5 h, e a solução de trabalho tornou-se vermelha clara. Ao contrário, não houve alteração significativa no grupo salino fisiológico (CP) mesmo após 10 h de incubação (Figura 1). Esses resultados mostraram que as células sanguíneas contidas nos coágulos foram liberadas com sucesso por este protocolo.
Após a coloração de Wright, os componentes celulares foram examinados claramente ao microscópio de luz (Figura 2A). Entre as hemácias liberadas, observou-se grande número de hemácias maduras com superfícies levemente côncavas e em forma de disco. Uma grande quantidade de pequenas partículas vermelho-púrpura de formato irregular foi observada na lâmina de vidro, que eram as plaquetas liberadas dos coágulos sanguíneos. Os leucócitos exibiram plasma maior e nuclear condensado. Vários tipos de granulócitos, como granulócitos neutrófilos maduros, eosinófilos e monócitos, também foram observados.
Com o auxílio de auto-analisador hematológico, os componentes celulares foram analisados quantitativamente. Entre as células detectadas, plaquetas e eritrócitos representaram 51,25% e 45,24%, respectivamente. Esses dados são consistentes com os resultados da coloração de Wright. Outros hemognósmos, como leucócitos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, eosinófilos, basófilos e granulócitos imaturos, também foram detectados (Tabela 1). Assim, seguindo esse protocolo, os componentes celulares de um trombo cerebral podem ser estudados não só qualitativamente, mas também quantitativamente.
Figura 1: Processo de dissolução. O trombo cerebral foi dissolvido em salina (NC) e FEs, respectivamente. As fotografias foram tiradas às 0 h, 5 h e 10 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Microscopia e citometria de fluxo das células liberadas . (A) As células ao microscópio após a coloração de Wright. Barra de escala = 20 μm. (B) Resultados da citometria de fluxo das células liberadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Exame de sangue de rotina | ||
| Parâmetros | Resultados | Unidade |
| Número absoluto de granulócitos imaturos (IG#) | 1 | 109/L |
| Porcentagem de granulócitos imaturos (IG%) | 3.7 | % |
| Contagem de eritrócitos (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Volume específico de hemácias (HCT) | 13.7 | % |
| Volume corpuscular médio (VCM) | 90.1 | F1 |
| Número de glóbulos brancos (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Número de linfócitos (LYM) | 1.41 | 109/L |
| A porcentagem de linfócitos (LYM%) | 5.2 | % |
| Número de neutrófilos (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Porcentagem de neutrófilos (Neu%) | 89.2 | % |
| Número de monócitos (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Porcentagem de monócitos (Mon%) | 3.8 | % |
| Número de eosinófilos (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Porcentagem de eosinófilos (Eos%) | 1.3 | % |
| Número de basófilos (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Porcentagem de basófilos (Bas%) | 0.5 | % |
| contagem de plaquetas (PLT) | 1722 | 109/L |
| Volume plaquetário médio (VPM) | 11.6 | F1 |
Tabela 1: Exame de sangue de rotina.
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Discussion
O FEs é um agente fibrinolítico capaz de degradar a fibrina de forma direta e eficaz12,16. Aqui, o sFE foi empregado para degradar a fibrina reticulada dos coágulos sanguíneos cerebrais, liberar as células fechadas dentro dos coágulos e analisar qualitativa e quantitativamente os componentes celulares dos coágulos. Os dados de microscopia e o exame de sangue de rotina indicaram que as células fechadas foram liberadas dos coágulos sanguíneos. Além disso, os tipos celulares e as estruturas das células liberadas não foram afetados significativamente após o tratamento com FE. Assim, um método único, simples e eficaz foi criado pela primeira vez para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais.
Como as células liberadas não são tão estáveis quanto dentro dos coágulos, as condições de degradação precisam ser otimizadas para diminuir a proporção quebrada de células liberadas, como temperatura, dose de sFE, velocidade de rotação e tempo de degradação. Os resultados da coloração de Wright mostraram que o fundo da degradação de 10 h era mais nublado do que o de 5 h. Essas diferenças são provavelmente devidas a restos celulares e outros fragmentos celulares. Além disso, os dados de citometria de fluxo indicaram que os restos celulares aumentaram com o tempo de degradação (Figura 2B). A taxa de degradação de debris celulares de 10 h (32,5%) foi significativamente maior do que a de degradação de 5 h (11,2%). Portanto, era fundamental separar as células liberadas da solução de trabalho o mais rápido possível. Assim, neste estudo, as células foram coletadas a cada 0,5 h. Outro ponto fundamental foi a rotação, que poderia acelerar a degradação, mas é ruim para manter a estrutura celular intacta das células liberadas.
Embora as condições de degradação tenham sido otimizadas, algumas células podem ser lisadas neste processo. Os restos celulares podem ser adversos à microscopia celular e ao exame de sangue de rotina17. Portanto, recomenda-se separar esses restos celulares das células intactas. Outra limitação dessa técnica é a possibilidade de contaminação do micróbio. A razão subjacente para este fenômeno é provavelmente o longo tempo de degradação em conjunto com a operação não estéril. Assim, alguns antibióticos adequados devem ser adicionados em estudos futuros18. Sabe-se que diferentes coágulos sanguíneos compartilham estruturas semelhantes de coágulos. Assim, o protocolo aqui relatado será adequado para análise de componentes celulares de outros coágulos sanguíneos. Além disso, com o auxílio dessa técnica, não só os componentes celulares, mas também o plasma com os coágulos puderam ser analisados qualitativa e quantitativamente.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
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