Summary
Bu çalışma, pıhtı eritme, hücre boyama ve rutin kan muayenesi yoluyla serebral kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlamaktadır.
Abstract
Serebral arter veya damardaki bir kan pıhtısı olan serebral tromboz, en yaygın serebral enfarktüs türüdür. Serebral kan pıhtılarının hücre bileşenlerinin incelenmesi tanı, tedavi ve prognoz için önemlidir. Bununla birlikte, pıhtıların hücre bileşenlerini incelemeye yönelik mevcut yaklaşımlar, esas olarak, hücreler pıhtılara sıkıca sarıldığı için hücre bileşenlerinin kapsamlı çalışması için uygun olmayan in situ boyamaya dayanmaktadır. Önceki çalışmalar, çapraz bağlı fibrini doğrudan parçalayarak hücre bileşenlerini serbest bırakabilen bir fibrinolitik enzimi (sFE) Sipunculus nudus'tan başarıyla izole etmiştir. Bu çalışma, serebral trombüsün hücre bileşenlerini incelemek için sFE'ye dayalı kapsamlı bir yöntem oluşturmuştur. Bu protokol pıhtı eritme, hücre salma, hücre boyama ve rutin kan incelemesini içerir. Bu yönteme göre, hücre bileşenleri nicel ve nitel olarak incelenebilir. Bu yöntemi kullanan deneylerin temsili sonuçları gösterilmektedir.
Introduction
Serebrovasküler hastalık, insan sağlığını tehdit edebilen üç ana hastalıktan biridir ve bunların arasında iskemik serebrovasküler hastalık% 80'den fazlasını oluşturur. Serebral tromboz ve serebral ven trombozu, günümüzde en çok endişe duyulan iskemik serebrovasküler hastalıklardırve esas olarak serebral kan pıhtılarının neden olduğu 1,2. Tedavi uygun şekilde yapılmazsa, yüksek sakatlık ve mortalite oranlarına ve taburculuk sonrası yüksek nüks oranına sahip olacaktır3.
Son zamanlarda, giderek artan sayıda çalışma, serebral kan pıhtılarının hücre bileşenlerinin serebral trombozun tanısı, tedavisi ve prognozu ile sıkı bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir 4,5,6. Bu nedenle, trombüs bileşimi, özellikle hücre bileşenleri ile ilgili verilerin mevcudiyeti klinik tanı ve tedavi için önemlidir. Ne yazık ki, şu anda mevcut olan yöntemler, kan pıhtısı bileşenini nicel ve nitel olarak kapsamlı bir şekilde analiz edememektedir. Örneğin, Martius Scarlett Blue bazlı in-situ boyama, pıhtının yalnızca belirli dilimlerinin kırmızı/beyaz kan hücrelerini inceleyebilir7. İmmünohistokimya (IHC) tabanlı in-situ boyama, antikorlarını kullanarak pıhtının yalnızca belirli dilimlerinin sınırlı kan bileşenlerini inceleyebilir8. Mikroskobik görüntüye dayalı yöntemler sadece pıhtının spesifik yapısıyla ilgilidir9. Üstelik tüm bu yöntemler zahmetli ve zaman alıcıdır10. Bugüne kadar, serebral trombüs hücre bileşenlerini kantitatif ve kalitatif olarak incelemek için prosedürler bildirilmemiştir. Çapraz bağlı fibrinin pıhtılardaki kan hücrelerini sıkıca sardığı yaygın olarak kabul edilmektedir11. Sonuç olarak, çapraz bağlı fibrinin spesifik bozunması ve sağlam hücrelerin salınması, hücre bileşenlerinin doğru analizi için kritik öneme sahiptir.
Önceki çalışmalar, fibrini spesifik ve hızlı bir şekilde parçalayabilen Sipunculus nudus'tan (sFE) bir fibrinolitik enzimi izole etti12. Burada, sFE'nin benzersiz aktivitesine dayalı olarak serebral trombüsün hücre bileşenlerini analiz etmek için bir yöntem önerilmiştir. Bu protokol, önce pıhtıların fibrinini parçalamak için sFE'yi kullandı ve daha sonra hücre bileşenlerini Wright'ın Boyama ve rutin kan muayenesiile analiz etti 13,14. Bu yönteme göre, serebral trombüsün hücre bileşenleri kantitatif ve kalitatif olarak incelenebilir. Bu basit ve etkili protokol, diğer kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Araştırma, Huaqiao Üniversitesi Tıbbi Etik Komitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Serebral kan pıhtıları cerrahi olarak çıkarıldı ve Fujian Tıp Üniversitesi'ne bağlı Quanzhou Birinci Hastanesi'nde hastalardan bilgilendirilmiş onam alınarak toplandı.
1. Kan pıhtısı ön tedavisi
- Pıhtıları temiz bir tabağa koyun, cımbızla 5 mL fizyolojik salin ekleyin, tabağı hafifçe sallayın ve salini bir pipetle çıkarın.
NOT: Durulamayı üç kez tekrarlayın. - Pıhtıları bir makasla daha küçük parçalar halinde (5 mm x 5 mm x 5 mm'den küçük) kesin. 5 mL fizyolojik salin ekleyin, tabağı hafifçe çalkalayın ve salini bir pipetle çıkarın.
NOT: Durulamayı üç kez tekrarlayın. Durulama sırasında pıhtı parçalarının aspire edilmediğinden emin olun. - Pıhtıları başka bir temiz U plakasına aktarın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir (plakayı 2-8 °C'de saklayın) ve daha sonra yeniden başlatılabilir.
2. Tromboliz
- Fizyolojik salin ile sFE konsantrasyonunu 2000 U/mL'ye ayarlayarak sFE çalışma solüsyonunu hazırlayın.
NOT: sFE, Tang Lab15'in köklü protokollerine göre hazırlanmıştır. - Ön işlem görmüş pıhtılara 300 μL sFE çalışma solüsyonu ekleyin.
- İlk bozulma turunu gerçekleştirin.
- sFE ve pıhtı karışımını 37 °C'de 0,5 saat inkübe edin.
NOT: Serum fizyolojik ile tedavi edilen leke negatif kontrol olarak ayarlandı. S'yi döndürmeyinampçalkalayıcı üzerinde. - Numuneyi yavaşça karıştırın. Sıvı parçayı temiz bir pipetle başka bir temiz tüpe aktarın.
NOT: Kalan pıhtılar başka bir bozunma turu için kullanıldı. - Sıvı kısmı 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Geri kazanılan sFE çözeltisini elde etmek için süpernatanı bir pipetle başka bir temiz tüpe aktarın.
- Hücre çökelmesini 50 μL fizyolojik salin ile hafifçe karıştırın.
NOT: Hücre karışımı daha sonra kullanılmak üzere 2-8 °C saklanmıştır.
- sFE ve pıhtı karışımını 37 °C'de 0,5 saat inkübe edin.
- Sonraki bozulmayı gerçekleştirin.
- Kalan pıhtıları (adım 2.3.2) geri kazanılan sFE çözeltisi (adım 2.3.4) ile 37 °C'de 0,5 saat boyunca bozun.
NOT: Geri kalan adımlar ilk bozma turuyla aynıydı. Tüm pıhtılar parçalanana kadar bozunma işlemi tamamlandı.
- Kalan pıhtıları (adım 2.3.2) geri kazanılan sFE çözeltisi (adım 2.3.4) ile 37 °C'de 0,5 saat boyunca bozun.
- Hücre toplama işlemini gerçekleştirin.
- Her bozunma turunun hücre karışımını toplayarak kan hücresi örneğini hazırlayın.
3. Wright'ın lekelenmesi
- Hücre yayması yapın.
- Hücreleri 1 x 106 hücre/mL yoğunluğa ayarlayın.
- Poli-L lizin kaplı cam slayta 5 μL hücre ekleyin, ardından kapak fişini kullanarak bunları sürün.
- Sıvıyı oda sıcaklığında buharlaştırın.
- Boyamayı gerçekleştirin.
- Hücre yaymasına nazikçe 200 μL Wright boyası ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve eşit şekilde karıştırmak için 600 μL Wright boyası B ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyayın.
- Boyayı temiz suyla nazikçe durulayın.
NOT: Lekeli hücre yayması daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir.
- Mikroskobik görüntüleme yapın.
- Lekeli hücreleri bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin (bkz.
4. Rutin kan muayenesi
- Hücreleri 1 x 106 hücre/mL yoğunluğa ayarlayın.
- Trombositler, eritrositler, beyaz kan hücreleri, lenfositler, nötrofiller, monositler, eozinofiller, bazofiller ve olgunlaşmamış granülositler gibi hücre bileşenlerini üreticinin talimatlarına göre bir otohematoloji analizörü kullanarak analiz edin (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bozunma sürecinin ilk aşamasında, kan pıhtılarının kırmızı kompakt bir yapıya sahip olduğu ve çalışma çözeltisinin renksiz olduğu bulundu. 30 dakika inkübasyondan sonra, çalışma çözeltisi açık kırmızıya döndü, bu da çapraz kan hücrelerinin çalışma çözeltisine salındığını gösterdi. Kuluçka süresi 5 saate uzatıldığında çoğu pıhtı çözüldü ve çalışma çözeltisi açık kırmızı oldu. Aksine, 10 saatlik inkübasyondan sonra bile fizyolojik salin grubunda (NC) önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 1). Bu sonuçlar, pıhtılarda bulunan kan hücrelerinin bu protokol tarafından başarılı bir şekilde salındığını gösterdi.
Wright'ın boyanmasından sonra, hücre bileşenleri ışık mikroskobu altında net bir şekilde incelendi (Şekil 2A). Serbest bırakılan kan hücreleri arasında, hafif içbükey ve disk şeklinde yüzeylere sahip çok sayıda olgun kırmızı kan hücresi gözlemlenebilir. Cam slaytta, kan pıhtılarından salınan trombositler olan çok miktarda düzensiz şekilli küçük mor-kırmızı parçacıklar gözlendi. Beyaz kan hücreleri daha büyük plazma ve yoğunlaştırılmış nükleer sergiledi. Olgun nötrofil granülosit, eozinofil ve monosit gibi çeşitli granülosit türleri de gözlenmiştir.
Oto hematoloji analizörü yardımıyla hücre bileşenleri kantitatif olarak analiz edildi. Tespit edilen hücreler arasında trombositler ve eritrositler sırasıyla %51.25 ve %45.24'ünü oluşturuyordu. Bu veriler Wright'ın lekesinin sonuçlarıyla tutarlıdır. Beyaz kan hücreleri, lenfositler, nötrofiller, monositler, eozinofiller, bazofiller ve olgunlaşmamış granülositler gibi diğer kan hücreleri de tespit edildi (Tablo 1). Bu nedenle, bu protokolü takiben, bir serebral trombüsün hücre bileşenleri sadece kalitatif olarak değil, aynı zamanda kantitatif olarak da incelenebilir.
Şekil 1: Çözme işlemi. Serebral trombüs sırasıyla salin (NC) ve sFE içinde çözüldü. Fotoğraf 0 saat, 5 saat ve 10 saatte çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Serbest bırakılan hücrelerin mikroskopi ve akış sitometrisi . (A) Wright'ın boyanmasından sonra mikroskop altındaki hücreler. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Serbest bırakılan hücrelerin akış sitometrisi sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Rutin Kan Testi | ||
| Parametre | Sonuç -ları | Birim |
| Olgunlaşmamış granülosit mutlak sayısı (IG#) | 1 | 109/L |
| Olgunlaşmamış granülosit yüzdesi (IG%) | 3.7 | % |
| Eritrosit Sayısı (RBC) | 1.52 | 1012/L |
| Kırmızı kan hücresine özgü hacim (HCT) | 13.7 | % |
| Ortalama korpüsküler hacim (MCV) | 90.1 | F1 |
| Beyaz kan hücresi sayısı (WBC) | 26.98 | 109/L |
| Lenfosit sayısı (LYM) | 1.41 | 109/L |
| Lenfosit yüzdesi (LYM%) | 5.2 | % |
| Nötrofil sayısı (Neu#) | 24.08 | 109/L |
| Nötrofiller yüzdesi (% Neu) | 89.2 | % |
| Monosit sayısı (Mon#) | 1.02 | 109/L |
| Monosit yüzdesi (Pzt) | 3.8 | % |
| Eozinofil sayısı (Eos#) | 0.34 | 109/L |
| Eozinofil yüzdesi (Eos%) | 1.3 | % |
| Bazofil sayısı (Bas#) | 0.13 | 109/L |
| Bazofiller yüzdesi (Bas%) | 0.5 | % |
| trombosit sayısı (PLT) | 1722 | 109/L |
| Ortalama trombosit hacmi (MPV) | 11.6 | F1 |
Tablo 1: Rutin kan muayenesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE, fibrini doğrudan ve etkili bir şekilde parçalayabilen fibrinolitik bir ajandır12,16. Burada, serebral kan pıhtılarının çapraz bağlı fibrinini parçalamak, pıhtıların içindeki kapalı hücreleri serbest bırakmak ve pıhtıların hücre bileşenlerini kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmek için sFE kullanıldı. Mikroskopi verileri ve rutin kan muayenesi, kapalı hücrelerin kan pıhtılarından salındığını gösterdi. Ayrıca, salınan hücrelerin hücre tipleri ve yapıları sFE tedavisinden sonra önemli ölçüde etkilenmemiştir. Böylece, serebral kan pıhtılarının hücre bileşenlerini analiz etmek için ilk kez benzersiz, basit ve etkili bir yöntem oluşturuldu.
Serbest bırakılan hücreler pıhtılar içindeki kadar kararlı olmadığından, sıcaklık, sFE dozu, dönme hızı ve bozunma süresi gibi salınan hücrelerin kırık oranını azaltmak için bozunma koşullarının optimize edilmesi gerekir. Wright'ın boyama sonuçları, 10 saatlik bozulmanın arka planının 5 saatinkinden daha bulutlu olduğunu gösterdi. Bu farklılıklar muhtemelen hücre kalıntıları ve diğer hücre parçalarından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, akış sitometrisi verileri, hücre kalıntılarının bozunma süresi ile arttığını göstermiştir (Şekil 2B). 10 saatlik bozunma (% 32.5) hücre enkaz oranı, 5 saatlik bozunmadan (% 11.2) anlamlı olarak daha yüksekti. Bu nedenle, salınan hücrelerin mümkün olan en kısa sürede çalışma solüsyonundan ayrılması kritikti. Bu nedenle, bu çalışmada, hücreler her 0.5 saatte bir toplandı. Bir diğer önemli nokta, bozulmayı hızlandırabilen ancak salınan hücrelerin bozulmamış hücre yapısını korumak için kötü olan rotasyondu.
Bozunma koşulları optimize edilmiş olsa da, bu süreçte bazı hücreler parçalanabilir. Hücre kalıntısı, hücre mikroskobu ve rutin kan muayenesi için olumsuz olabilir17. Bu nedenle, bu hücre kalıntılarının sağlam hücrelerden ayrılması önerilir. Bu tekniğin bir başka sınırlaması da mikrop kontaminasyonu olasılığıdır. Bu fenomenin altında yatan neden, muhtemelen nonsteril operasyonla birlikte uzun bozulma süresidir. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalarda bazı uygun antibiyotikler eklenmelidir18. Farklı kan pıhtılarının benzer pıhtı yapılarını paylaştığı iyi bilinmektedir. Bu nedenle, burada bildirilen protokol, diğer kan pıhtılarının hücre bileşeni analizi için uygun olacaktır. Ayrıca bu teknik sayesinde sadece hücre bileşenleri değil, pıhtılı plazma da kalitatif ve kantitatif olarak analiz edilebilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a, Marder, V. J.
- Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
